L'effetto di Stress osmotico su vescicole secretorie ed esocitosi di monitoraggio

L'obiettivo generale di questa metodologia analitica combinata è quello di fornire informazioni su come le vescicole secretorie nelle cellule rispondono a una forza fisica, come la pressione osmotica extracellulare, e su come le regolazioni di questi organelli influenzano ulteriormente il processo di esocitosi. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle neuroscienze, come ad esempio, in che modo le vescicole secretorie rispondono direttamente ai cambiamenti nell'ambiente extracellulare o al trattamento farmacologico? Il vantaggio principale di questo approccio è quello di monitorare gli effetti diretti sul contenuto vescicolare delle cellule vive e di saper distinguere l'alterazione nel loro rilascio di reh-chemical ed prima e dopo il trattamento dell'esocitosi.

Per ottenere una superficie piatta dell'elettrodo a disco, posizionare l'elettrodo nel supporto di una microsmerigliatrice e smussare ciascun elettrodo in fibra di carbonio con un angolo di 45 gradi. Successivamente, contrassegnare il capillare per riferimento futuro su come individuare la superficie dell'elettrodo del disco con un angolo di 45 gradi quando si posiziona l'elettrodo vicino alle cellule per la misurazione dell'esocitosi. Per eseguire la registrazione amperometrica su singole cellule, montare il microelettrodo a disco in fibra di carbonio appena smussato e testato nel portaelettrodo dello stadio di testa che viene utilizzato con un potenziostato.

Prima dell'uso, posizionare ciascun microelettrodo in fibra di carbonio in una soluzione di prova per monitorare la corrente dello stato di studio utilizzando la voltammetria ciclica. Per una scansione voltammetrica ciclica, applicare una forma d'onda di potenziale triangolare da 0,2 volt negativi a 0,8 volt positivi contro un elettrodo di riferimento cloruro argento-argento a 100 millivolt al secondo per garantire una buona cinetica di reazione. Per la registrazione amperometrica dell'esocitosi, posizionare la piastra di Petri con cellule cromaffini in coltura in tampone isotonico su un microscopio invertito in una gabbia di Faraday.

Utilizzare un tavolino di riscaldamento del microscopio per mantenere una temperatura di 37 gradi Celsius durante gli esperimenti cellulari. Successivamente, utilizzare uno strumento patch clamp a basso rumore per applicare un potenziale costante di 700 millivolt positivi all'elettrodo di lavoro. Per registrare l'esocitosi delle cellule cromaffini, digitalizzare il segnale a 10 kilohertz e applicare un filtro di Bessel passa-basso interno a due kilohertz per filtrare il segnale registrato.

Si noti che l'elettrodo del disco ovale deve essere posizionato in piano sopra le celle e parallelo alla superficie della piastra di Petri. Inoltre, gli elettrodi vengono smussati lo stesso giorno degli esperimenti per garantire una superficie pulita dell'elettrodo. Per stimolare l'esocitosi cellulare, posizionare una micropipetta di vetro riempita con una soluzione di cloruro di bario da cinque millimolari a una distanza di almeno 20 micrometri dalla cellula.

Quindi, applicare un impulso di iniezione di cinque secondi di una soluzione di cloruro di bario da cinque millimolari sulla superficie della cellula per stimolare l'esocitosi cellulare. Posizionare la pipetta dello stelo nella soluzione e stimolare l'esocitosi cellulare applicando un impulso di iniezione di bario e registrando i transitori di corrente amperometrica per circa tre minuti. Per confrontare le risposte esocitotiche in condizioni isotoniche con quelle ipertoniche, incubare le cellule per 10 minuti in una soluzione tampone ipertonica.

Successivamente, applicare un impulso di iniezione di bario per stimolare l'esocitosi ed eseguire tre minuti di registrazione amperometrica. Per la risposta reversibile delle cellule, incubare nuovamente le cellule per 10 minuti in una soluzione tampone isotonica. Stimolare le cellule applicando un impulso di iniezione di bario ed eseguire tre minuti di registrazione della risposta esocitotica.

Per fabbricare gli elettrodi per le misurazioni delle dimensioni quantistiche vescicolari, preparare un elettrodo in fibra di carbonio con un diametro di cinque micrometri. Al microscopio, usa un bisturi per tagliare la fibra di carbonio che si estende dalla punta di vetro in modo che rimangano solo da 30 a 100 micrometri. Utilizzare una fiamma di butano per preparare una punta incisa a fiamma dell'elettrodo in fibra di carbonio.

Per ottenere una punta dell'elettrodo di forma cilindrica e incisa in modo uniforme, tenere l'elettrodo in fibra di carbonio di forma cilindrica mentre lo si ruota. E posiziona la fibra di carbonio che si estende dal vetro al bordo blu della fiamma del butano fino a quando la punta del carbonio non sviluppa un colore rosso. Dopo l'incisione a fiamma, posizionare l'elettrodo al microscopio per valutare la punta dell'elettrodo.

La dimensione della punta dell'elettrodo inciso deve avere un diametro compreso tra 50 e 100 nanometri. Quindi, inserire il microelettrodo cilindrico a nanopunta nella soluzione epossidica per tre minuti, seguito da un'immersione di 15 secondi della punta dell'elettrodo nella soluzione di acetone. Ciò consente alla resina epossidica di sigillare lo spazio potenziale tra la fibra di carbonio e la parete del capillare del gas isolante.

Mentre l'acetone rimuove la resina epossidica dalla superficie dell'elettrodo in fibra di carbonio incisa. Per polimerizzare la resina epossidica, cuocere gli elettrodi in forno per una notte a 100 gradi Celsius. Prima dell'uso, testare la corrente stazionaria di ciascun microelettrodo in fibra di carbonio utilizzando la voltammetria ciclica.

Per gli esperimenti, utilizzare solo elettrodi che mostrano una corrente di plateau compresa tra 1,5 e 2,5 nanoampere. Per le misure di amperometria intracellulare, posizionare le cellule al microscopio e utilizzare le stesse impostazioni sperimentali del potenziostato. Prevenire danni fisici significativi alla cellula.

Inserire il microelettrodo cilindrico nanotip nella cella aggiungendo una leggera forza meccanica. Quanto basta per spingere l'elettrodo attraverso la membrana plasmatica cellulare e nel citoplasma cellulare utilizzando un micromanipolatore. Dopo l'inserimento, e con la membrana cellulare sigillata attorno all'elettrodo cilindrico, avviare la registrazione amperometrica in situ sulla cella viva.

Al potenziale di ossidazione applicato all'elettrodo, le vescicole si adsorbono sulla superficie dell'elettrodo e si rompono stocasticamente. Quindi, non c'è bisogno di alcun tipo di stimolo per avviare questo processo. Per determinare l'effetto osmotico sulla dimensione quantica vescicolare, raccogliere le misurazioni della citometria intracellulare da un gruppo di cellule che sono state incubate in tampone isotonico e ipertonico utilizzando la condizione sperimentale.

L'effetto dell'osmolalità extracellulare sull'attività dell'esocitosi è presentato come la frequenza degli eventi di esocitosi quando le cellule cromaffini vengono stimolate con una soluzione di bario in condizioni isotoniche, poi ipertoniche e infine isotoniche. Questi dati mostrano un'inibizione dell'attività dell'esocitosi nelle cellule che subiscono stress osmotico e un parziale recupero può essere raggiunto dopo che le cellule sono tornate in un ambiente isotonico. L'esperimento di controllo mostra la frequenza degli eventi di esocitosi dopo tre stimolazioni consecutive con bario su cellule cromaffini in condizioni isotoniche.

Ciò dimostra che la stimolazione multipla del bario nell'arco di tempo utilizzato in questi esperimenti sta causando una riduzione dell'attività dell'esocitosi mediante stimolazione cellulare consecutiva. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire questi metodi analitici complementari che ti consentono di confrontare come le vescicole secretorie e il processo di esocitosi sono influenzati da alterazioni nell'ambiente extracellulare.