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Fonte: Laboratorio del Dr. Andrew J. Steckl — Università di Cincinnati
Un microscopio elettronico a scansione, o SEM, è un potente microscopio che utilizza gli elettroni per formare un'immagine. Consente l'imaging di campioni conduttivi a ingrandimenti che non possono essere raggiunti utilizzando microscopi tradizionali. I moderni microscopi otrici possono raggiungere un ingrandimento di ~ 1.000X, mentre il tipico SEM può raggiungere ingrandimenti di oltre 30.000X. Poiché il SEM non utilizza la luce per creare immagini, le immagini risultanti che forma sono in bianco e nero.
I campioni conduttivi vengono caricati sullo stadio campione del SEM. Una volta che la camera del campione raggiunge il vuoto, l'utente procederà ad allineare la pistola elettronica nel sistema alla posizione corretta. La pistola elettronica spara un fascio di elettroni ad alta energia, che viaggiano attraverso una combinazione di lenti e aperture e alla fine colpiscono il campione. Mentre la pistola elettronica continua a sparare elettroni in una posizione precisa sul campione, gli elettroni secondari rimbalzeranno dal campione. Questi elettroni secondari sono identificati dal rivelatore. Il segnale trovato dagli elettroni secondari viene amplificato e inviato al monitor, creando un'immagine 3D. Questo video dimostrerà la preparazione, il funzionamento e le capacità di imaging dei campioni SEM.
1. Preparazione del campione
2. Inserimento del campione e avvio SEM
3. Acquisizione dell'immagine SEM
4. Effettuare misurazioni utilizzando il software SEM
La microscopia elettronica a scansione, o SEM, è una potente tecnica utilizzata in chimica e analisi dei materiali che utilizza un fascio di elettroni scansionato per analizzare la struttura superficiale e la composizione chimica di un campione.
I moderni microscopi ottica sono limitati dall'interazione delle onde luminose visibili con un oggetto, chiamato diffrazione. La più piccola distanza risolvibile tra due oggetti, o la risoluzione laterale, varia a seconda delle dimensioni del modello di diffrazione rispetto alle dimensioni dell'oggetto. Di conseguenza, i microscopi ottivi hanno un ingrandimento massimo fino a 1.000X e una risoluzione laterale fino a 200 nm in situazioni ideali.
Il SEM non è limitato dalla diffrazione, in quanto utilizza un fascio di elettroni piuttosto che la luce. Pertanto, un SEM può raggiungere ingrandimenti fino a un milione di X con risoluzione laterale sub-nanometrica. Inoltre, la SEM non si limita alle caratteristiche di imaging solo sul piano focale, come con la microscopia ottica. Pertanto, gli oggetti al di fuori del piano focale sono risolti, al contrario della microscopia ottica in cui appaiono sfocati. Ciò fornisce una profondità di campo fino a 300 volte superiore con SEM.
I chimici usano ampiamente il SEM per analizzare la composizione superficiale, la struttura e la forma di entità su scala nanometrica, come le particelle catalizzanti.
Questo video delineerà i principi dello strumento SEM e dimostrerà le basi della preparazione e del funzionamento dei campioni SEM in laboratorio.
Nel SEM, i campioni devono essere conduttivi per l'imaging convenzionale. I campioni non conduttivi sono rivestiti con un sottile strato di metallo, come l'oro. Le immagini vengono quindi generate scansionando un fascio focalizzato di elettroni ad alta energia attraverso il campione.
Il fascio di elettroni utilizzato in SEM è generato da una pistola elettronica, dotata di un catodo a filamento di tungsteno. Gli elettroni sono spinti verso l'anodo, nella direzione del campione, da un campo elettrico.
Il fascio di elettroni viene quindi focalizzato sulle lenti del condensatore ed entra nella lente dell'obiettivo. L'obiettivo deve essere calibrato dall'utente per focalizzare il fascio di elettroni su una posizione fissa sul campione. Il fascio focalizzato viene quindi scansionato raster attraverso il campione.
Quando gli elettroni primari interagiscono con il campione, scavano un tunnel verso una profondità che dipende dall'energia del fascio di elettroni. Questa interazione con la superficie provoca l'emissione di elettroni secondari e retrodatterati, che vengono poi misurati dai rispettivi rivelatori.
L'intensità del segnale degli elettroni secondari emessi varia a seconda dell'angolo del campione. Le superfici perpendicolari al fascio rilasciano meno elettroni secondari e quindi appaiono più scure. Ai margini delle superfici, vengono rilasciati più elettroni e l'area appare più luminosa. Questo fenomeno produce immagini con un aspetto 3D ben definito, come mostrato in questa scansione SEM dell'amianto.
Al contrario, gli elettroni retrodifati vengono riflessi nella direzione opposta del fascio di elettroni. L'intensità di rilevamento aumenta con l'aumentare del numero atomico del campione, consentendo l'acquisizione di informazioni compositime di una superficie, come mostrato in questa immagine di backscatter di inclusioni in vetro.
Ora che i principi dello strumento SEM sono stati delineati, il funzionamento di base di un SEM sarà dimostrato in laboratorio.
Per iniziare, sputter rivestire il campione posizionandolo su uno stub campione. Assicurarsi che il campione sia completamente asciutto e degassato. Se necessario, è possibile utilizzare un nastro di carbonio conduttivo a doppia faccia per far aderire il campione allo stub. Posizionare il campione in un sistema di sputtering. Sputter alcuni nanometri d'oro sul campione. Lo spessore dello strato d'oro varierà a seconda che il rivestimento interferisca con la morfologia del campione.
Rimuovere il campione dal sistema di sputtering. Assicurarsi che vi sia un ponte conduttivo dalla superficie del campione al mozzicone di metallo.
Una volta che il campione è stato rivestito, è pronto per essere ripreso. Per fare ciò, prima sfiatare la camera del campione SEM e consentire alla camera di raggiungere la pressione nominale.
Aprire il compartimento del campione SEM e rimuovere lo stadio del campione. Posizionare lo stub sullo stadio campione e stringere lo stub in posizione.
Se la distanza tra l'obiettivo e il campione, chiamata distanza di lavoro, non può essere controllata dal software, assicurarsi che lo stadio e lo stub abbiano l'altezza corretta per ottenere un'immagine.
Mettere lo stadio del campione nella camera del campione e chiudere il compartimento.
Accendere le pompe per vuoto e consentire al sistema di pompare verso il basso.
Per iniziare l'imaging, aprire il software SEM. Selezionare la tensione di funzionamento desiderata da 1 a 30 kV. Con materiali ad alta densità, dovrebbero essere utilizzate tensioni di accelerazione più elevate. Selezionare una bassa tensione di accelerazione per materiali a bassa densità.
La maggior parte dei software SEM include una funzione di messa a fuoco automatica. Questo acquisirà un focus del campione da utilizzare come punto di partenza.
Impostare l'ingrandimento sul livello di zoom minimo di 50X.
SEM ha diverse modalità di scansione come la scansione veloce e la scansione lenta. La modalità di scansione più veloce offre una frequenza di aggiornamento più rapida dello schermo con una qualità inferiore. Selezionare la modalità di scansione rapida per iniziare, al fine di trovare il campione e iniziare la messa a fuoco grossolana.
Regola la messa a fuoco del percorso fino a quando l'immagine diventa più nitida. Quindi, regola il posizionamento del palco in modo che la regione di interesse possa essere vista sul display.
Innanzitutto, metti a fuoco l'ingrandimento più basso usando la messa a fuoco grossolana. Quindi, aumentare il livello di ingrandimento fino a quando non viene osservata la funzione desiderata. Regola la messa a fuoco del corso per mettere a fuoco approssimativamente l'immagine a questo ingrandimento. Se necessario, regolare una messa a fuoco grossolana quando l'ingrandimento è aumentato.
Quindi, regola la messa a fuoco fine per migliorare ulteriormente l'immagine. Ripetere questi passaggi di messa a fuoco ogni volta che l'ingrandimento viene aumentato.
Le distorsioni asimmetriche del fascio possono causare sfocatura dell'immagine, chiamata astigmatismo, anche quando il campione è ben focalizzato. Per diminuire questo effetto, aumentate l'ingrandimento al livello massimo e mettete a fuoco l'immagine utilizzando la messa a fuoco fine. Quindi regolare la stigmatizzazione sia nella direzione x che in quella y per rimodellare il raggio.
Continua a regolare le impostazioni di messa a fuoco e stigmatizzazione fino a quando l'immagine non è il più focalizzata possibile al livello di ingrandimento aumentato.
Quindi tornare al livello di ingrandimento desiderato.
L'immagine SEM può essere acquisita in modalità "foto lenta" o "foto veloce". La modalità "foto veloce" crea un'immagine di qualità inferiore, ma viene acquisita più velocemente. La modalità "foto lenta" crea un'immagine di qualità superiore, ma può saturare la superficie con elettroni.
Per misurare le caratteristiche all'interno dell'immagine acquisita, utilizzare gli strumenti di misurazione del software.
La maggior parte degli strumenti include opzioni di misurazione come lunghezza, area e angolo.
Per determinare la lunghezza, selezionate la distanza da misurare sull'immagine SEM. Clicca sull'immagine per creare i punti di riferimento che verranno analizzati dal software.
Al termine, spegnere il SEM secondo le linee guida del produttore.
La microscopia elettronica a scansione viene utilizzata per l'immagine di una vasta gamma di campioni.
SEM può essere utilizzato per l'immagine di materiali complessi e altamente strutturati, come una membrana in fibra di carbonio.
Il campione ha mostrato un alto grado di porosità e struttura tridimensionale; una proprietà altamente desiderabile per applicazioni come la catalisi.
SeM può anche essere utilizzato per l'immagine di campioni biologici, come i batteri. In questo esempio, i capelli come appendici, o pili, dei batteri intestinali sono stati ripresi con SEM.
L'Helicobacter pylori è stato coltivato su lastre di agar di sangue e i batteri seminati su coperture di vetro scivolano.
Sono stati montati campioni completamente essiccati e rivestiti con 5 nm di palladio-oro per rendere il campione conduttivo.
Infine, il campione è stato ripreso utilizzando SEM. H. pylori erano facilmente visibili, con pili misurabili su scala nanometrica.
Questo esempio descrive come il tessuto cerebrale può essere incorporato in una resina stabile e quindi ripreso in tre dimensioni utilizzando un fascio ionico focalizzato e SEM.
In primo luogo, il tessuto cerebrale è stato fissato e incorporato nella resina. Quindi la regione di interesse identificata e affettata con un microtomo.
Il campione è stato quindi inserito nel microscopio elettronico a scansione a fascio iondo focalizzato per l'imaging tridimensionale. Il fascio ioio focalizzato è stato quindi utilizzato per rimuovere in sequenza strati sottili del campione. Ogni livello è stato ripreso prima della rimozione utilizzando il backscatter SEM.
Hai appena visto l'introduzione di JoVE alla microscopia elettronica a scansione. Ora dovresti comprendere i principi operativi di base del SEM e come preparare e analizzare un campione SEM.
Grazie per l'attenzione!
La microscopia elettronica a scansione, o SEM, è una potente tecnica utilizzata in chimica e nell'analisi dei materiali che utilizza un fascio di elettroni scansionato per analizzare la struttura superficiale e la composizione chimica di un campione.
I moderni microscopi ottici sono limitati dall'interazione delle onde di luce visibile con un oggetto, chiamata diffrazione. La distanza risolvibile più piccola tra due oggetti, o la risoluzione laterale, varia a seconda delle dimensioni del modello di diffrazione rispetto alle dimensioni dell'oggetto. Di conseguenza, i microscopi ottici hanno un ingrandimento massimo fino a 1.000X e una risoluzione laterale fino a 200 nm in situazioni ideali.
Il SEM non è limitato dalla diffrazione, poiché utilizza un fascio di elettroni piuttosto che la luce. Pertanto, un SEM può raggiungere ingrandimenti fino a un milione di X con una risoluzione laterale sub-nanometrica. Inoltre, il SEM non si limita alle funzioni di imaging solo sul piano focale, come con la microscopia ottica. Pertanto, gli oggetti al di fuori del piano focale vengono risolti, al contrario della microscopia ottica dove appaiono sfocati. Ciò fornisce una profondità di campo fino a 300 volte maggiore con il SEM.
I chimici utilizzano ampiamente il SEM per analizzare la composizione della superficie, la struttura e la forma di entità su scala nanometrica, come le particelle del catalizzatore.
? Questo video illustra i principi dello strumento SEM e illustra le basi della preparazione e del funzionamento dei campioni SEM in laboratorio.
Nel SEM, i campioni devono essere conduttivi per l'imaging convenzionale. I campioni non conduttivi sono rivestiti con un sottile strato di metallo, come l'oro. Le immagini vengono quindi generate scansionando un fascio focalizzato di elettroni ad alta energia attraverso il campione.
Il fascio di elettroni utilizzato nel SEM è generato da un cannone elettronico, dotato di un catodo a filamento di tungsteno. Gli elettroni sono spinti verso l'anodo, in direzione del campione, da un campo elettrico.
Il fascio di elettroni viene quindi focalizzato sulle lenti del condensatore ed entra nella lente dell'obiettivo. La lente dell'obiettivo deve essere calibrata dall'utente per focalizzare il fascio di elettroni su una posizione fissa sul campione. Il raggio focalizzato viene quindi scansionato raster attraverso il campione.
Quando gli elettroni primari interagiscono con il campione, si traghettano a una profondità che dipende dall'energia del fascio di elettroni. Questa interazione con la superficie provoca l'emissione di elettroni secondari e retrodiffusi, che vengono poi misurati dai rispettivi rivelatori.
L'intensità del segnale degli elettroni secondari emessi varia a seconda dell'angolo del campione. Le superfici perpendicolari al fascio rilasciano meno elettroni secondari e quindi appaiono più scure. Ai margini delle superfici, vengono rilasciati più elettroni e l'area appare più luminosa. Questo fenomeno produce immagini con un aspetto 3D ben definito, come mostrato in questa scansione SEM dell'amianto.
Al contrario, gli elettroni retrodiffusi vengono riflessi nella direzione opposta al fascio di elettroni. L'intensità di rivelazione aumenta con l'aumentare del numero atomico del campione, consentendo l'acquisizione di informazioni sulla composizione di una superficie, come mostrato in questa immagine di retrodiffusione delle inclusioni nel vetro.
Ora che i principi dello strumento SEM sono stati delineati, il funzionamento di base di un SEM sarà dimostrato in laboratorio.
Per iniziare, ricopri il campione posizionandolo su un mozzicone di campione. Assicurarsi che il campione sia completamente asciutto e degassato. Se necessario, è possibile utilizzare un nastro biadesivo di carbonio conduttivo per far aderire il campione allo stub. Posizionare il campione in un sistema di sputtering. Sputter alcuni nanometri d'oro sul campione. Lo spessore dello strato d'oro varierà a seconda che il rivestimento interferisca con la morfologia del campione.
Rimuovere il campione dal sistema di sputtering. Assicurarsi che vi sia un ponte conduttivo dalla superficie del campione al tronchetto metallico.
Una volta che il campione è stato rivestito, è pronto per essere riprodotto. A tale scopo, sfiatare prima la camera del campione SEM e lasciare che la camera raggiunga la pressione nominale.
Aprire il vano del campione SEM e rimuovere il tavolino del campione. Posizionare il tronchetto sul tavolino di campionamento e serrare il tronchetto in posizione.
Se la distanza tra l'obiettivo e il campione, chiamata distanza di lavoro, non può essere controllata dal software, assicurarsi che il tavolino e il tronchetto abbiano l'altezza corretta per ottenere un'immagine.
Inserire il tavolino di campionamento nella camera del campione e chiudere lo scomparto.
Accendere le pompe del vuoto e consentire al sistema di pompare.
Per avviare l'imaging, aprire il software SEM. Selezionare la tensione di esercizio desiderata da 1,30 kV. Con materiali ad alta densità, è necessario utilizzare tensioni di accelerazione più elevate. Selezionare una bassa tensione di accelerazione per materiali a bassa densità.
La maggior parte dei software SEM include una funzione di messa a fuoco automatica. In questo modo si acquisirà un focus del campione da utilizzare come punto di partenza.
Impostare l'ingrandimento sul livello di zoom minimo di 50X.
SEM dispone di diverse modalità di scansione, ad esempio la scansione veloce e la scansione lenta. La modalità di scansione più veloce offre una frequenza di aggiornamento più rapida dello schermo con una qualità inferiore. Selezionare la modalità di scansione rapida per iniziare, al fine di trovare il campione e iniziare la messa a fuoco grossolana.
Regolare la messa a fuoco della rotta fino a quando l'immagine non diventa più nitida. Quindi, regolare il posizionamento del tavolino in modo che la regione di interesse possa essere visualizzata sul display.
Innanzitutto, mettere a fuoco all'ingrandimento più basso utilizzando la messa a fuoco macrometrica. Quindi, aumentare il livello di ingrandimento fino a quando non si osserva la funzione desiderata. Regolare la messa a fuoco della rotta per mettere a fuoco approssimativamente l'immagine a questo ingrandimento. Se necessario, regolare una messa a fuoco grossolana quando l'ingrandimento aumenta.
Quindi, regola la messa a fuoco fine per migliorare ulteriormente l'immagine. Ripetere questi passaggi di messa a fuoco ogni volta che si aumenta l'ingrandimento.
Le distorsioni asimmetriche del fascio possono causare una sfocatura dell'immagine, chiamata astigmatismo, anche quando il campione è ben messo a fuoco. Per ridurre questo effetto, aumentare l'ingrandimento al livello massimo e mettere a fuoco l'immagine utilizzando la messa a fuoco fine. Quindi regolare la stigmatizzazione in entrambe le direzioni x e y per rimodellare il raggio.
Continuare a regolare le impostazioni di messa a fuoco e stigmatizzazione fino a quando l'immagine non è il più a fuoco possibile al livello di ingrandimento aumentato.
Quindi tornare al livello di ingrandimento desiderato.
L'immagine SEM può essere acquisita in modalità "foto lenta" o "foto veloce". La modalità "foto veloce" crea un'immagine di qualità inferiore, ma viene acquisita più velocemente. La modalità "foto lenta" crea un'immagine di qualità superiore, ma può saturare la superficie con elettroni.
Per misurare le caratteristiche all'interno dell'immagine acquisita, utilizzare gli strumenti di misurazione del software.
La maggior parte degli strumenti include opzioni di misurazione come lunghezza, area e angolo.
Per determinare la lunghezza, selezionare la distanza da misurare sull'immagine SEM. Clicca sull'immagine per creare i punti di riferimento che verranno analizzati dal software.
Al termine, spegnere il SEM secondo le linee guida del produttore.
La microscopia elettronica a scansione viene utilizzata per l'imaging di un'ampia gamma di campioni.
Il SEM può essere utilizzato per l'imaging di materiali complessi e altamente strutturati, come una membrana in fibra di carbonio.
Il campione ha mostrato un alto grado di porosità e struttura tridimensionale; Una proprietà altamente desiderabile per applicazioni come la catalisi.
Il SEM può essere utilizzato anche per l'imaging di campioni biologici, come i batteri. In questo esempio, le appendici simili a capelli, o pili, dei batteri intestinali sono state visualizzate con SEM.
Helicobacter pylori sono stati coltivati su piastre di agar sanguigno e i batteri sono stati seminati su vetrini di vetro.
I campioni completamente essiccati sono stati montati e rivestiti con 5 nm di palladio-oro per rendere il campione conduttivo.
Infine, il campione è stato ripreso utilizzando il SEM. H. pylori era facilmente visibile, con pili misurabili su scala nanometrica.
Questo esempio descrive come il tessuto cerebrale può essere incorporato in una resina stabile e quindi riprodotto in tre dimensioni utilizzando un fascio ionico focalizzato e SEM.
Innanzitutto, il tessuto cerebrale è stato fissato e incorporato nella resina. Quindi la regione di interesse identificata e affettata con un microtomo.
Il campione è stato quindi inserito nel microscopio elettronico a scansione a fascio ionico focalizzato per l'imaging tridimensionale. Il fascio ionico focalizzato è stato quindi utilizzato per rimuovere in sequenza strati sottili del campione. Ogni strato è stato ripreso prima della rimozione utilizzando il SEM a retrodiffusione.
Hai appena visto l'introduzione di JoVE alla microscopia elettronica a scansione. A questo punto è necessario comprendere i principi di funzionamento di base del SEM e come preparare e analizzare un campione SEM.
Grazie per l'attenzione!
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