Caratterizzazione delle estensioni della membrana cellulare e studiando i loro ruoli nella dinamica di adesione delle cellule cancro

L'obiettivo generale è quello di determinare l'effetto delle alterazioni sperimentali sul repertorio di estensione cellulare e come si relaziona con la funzione di adesione cellulare nel cancro. Questo metodo può aiutare a identificare i ruoli chiave del repertorio di estensione della membrana cellulare nella modulazione del comportamento cellulare, come l'adesione, la motilità e l'invasione cellulare. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è relativamente semplice da eseguire e può essere facilmente adattata a varie condizioni sperimentali.

Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla nostra terapia o diagnosi di tumori localmente avanzati o metastatici perché aiuta a quantificare con precisione i cambiamenti nel repertorio di estensione cellulare associati ad alterazioni nelle cellule tumorali nelle capacità adesive e invasive. Può anche essere applicato ad altri sistemi come la regolazione dei canali ionici, che è nota per svolgere un ruolo importante nella formazione dell'estensione cellulare e nei normali processi fisiologici. La dimostrazione visiva e la registrazione di questo metodo sono fondamentali in quanto il conteggio dei passaggi di estensione cellulare è difficile da imparare a causa delle sottigliezze del loro aspetto a volte.

Un giorno prima dell'imaging, contare le cellule SW 13, SW Neo e SW DKK3 cresciute in un incubatore a 37 gradi Celsius e al cinque percento di anidride carbonica utilizzando un emocitometro. Posizionare i vetrini di vetro sterili nei singoli pozzetti di tre piastre a sei pozzetti. Utilizzare una piastra separata per ogni linea cellulare e placcare le tre linee cellulari a una densità di 5.000 cellule per pozzetto in queste piastre a sei pozzetti.

Metti le cellule in un incubatore a 37 gradi Celsius e al cinque percento di anidride carbonica durante la notte. Il giorno successivo, da ogni pozzetto aspirare il terreno di coltura. Quindi, lavare le cellule in un millilitro di PBS caldo.

Successivamente, aggiungere un millilitro di formaldeide al 3,7% in ciascun pozzetto per fissare le cellule. Lasciare le cellule nel fissativo per 10 minuti. Al termine della fissazione, aspirare la formaldeide.

Aggiungere un millilitro di cristallovioletto allo 0,05% in ogni pozzetto per colorare le cellule per 30 minuti. Quindi, eliminare la macchia in eccesso lavando le celle con un millilitro di acqua deionizzata per pozzetto tre volte. Quindi, posizionare una goccia di reagente di montaggio trasparente su un vetrino etichettato.

Quindi, utilizzando una pinza a punta fine, recuperare delicatamente i vetrini coprioggetti e posizionarli a faccia in giù sopra i reagenti di montaggio. Dopo aver montato tutti i vetrini coprioggetti colorati sui vetrini, al microscopio ottico scegliere 20 viste casuali di cellule non sovrapposte da ciascun vetrino coprioggetti. Scatta micrografie fotografiche con un ingrandimento di 400 intensità per ogni campo visivo.

Quindi, osserva e conta il numero di tipi di estensione in ciascuna delle 20 celle rappresentative. Usa le definizioni e il protocollo testuale per guidare la tua classificazione dell'estensione della membrana come filopodi, lobopodi o lamellipodi. Quando si contano per la prima volta i tipi di estensione delle celle, può essere utile mantenere un'immagine di riferimento disponibile per la revisione.

Se possibile, il conteggio in cieco rispetto ai loro campioni sperimentali fornirà ulteriore oggettività. Determinare il numero medio di estensioni di ciascun tipo per cellula in ciascuna delle tre linee cellulari esaminate. Utilizzare l'anova unidirezionale per verificare la differenza nella percentuale media di estensioni della membrana cellulare tra i diversi tipi di cellule è statisticamente significativa.

Un giorno prima del test, utilizzando un emocitometro, contare le cellule SW 13, SW Neo e SW DKK3. Piastra queste celle a densità di 100.000 cellule per pozzetto in piastre a sei pozzetti utilizzando una piastra per ciascuno dei sei punti temporali designati che verranno testati. Metti le cellule in un incubatore a 37 gradi Celsius e al cinque percento di anidride carbonica durante la notte.

Il giorno successivo, rimuovere la piastra dall'incubatrice e lavare una volta le celle con PBS caldo. Quindi, aggiungere 0,5 millilitri di soluzione di dissociazione cellulare non enzimatica a forza singola in ciascun pozzetto. Agitare delicatamente le piastre per distribuire uniformemente la soluzione aggiunta.

Incubare le piastre con la soluzione per tempi definiti. Aspirare la targhetta designata alla fine di ogni punto temporale. Subito dopo ogni aspirazione, lavare le cellule con un millilitro di PBS caldo.

Quindi picchiettare delicatamente la piastra per staccare le cellule attaccate in modo lasco. Ripetere il lavaggio insieme al picchiettamento intermittente altre due volte. Infine, aspirare l'eventuale PBS rimanente e fissare le cellule rimaste nella piastra con un millilitro di formaldeide al 3,7%.

Al termine della fissazione, aspirare la formaldeide. Quindi, aggiungi un millilitro di cristallovioletto allo 0,05% in ciascun pozzetto per colorare le cellule. Una volta completata la colorazione, eliminare la macchia in eccesso lavando le celle con un millilitro di acqua deionizzata per pozzetto tre volte.

Utilizzando un microscopio ottico con un ingrandimento di 100 intensità, contare le cellule attaccate rimanenti in ciascun pozzetto per ogni piastra. Quindi determinare la percentuale di cellule che sono rimaste staccate durante i diversi punti temporali per le tre linee cellulari che sono state testate. Utilizzando un anova a due vie, il test delle differenze e dei tassi di distacco cellulare tra le tre linee cellulari è statisticamente significativo.

Le cellule di controllo SW 13 e SW Neo colorate con cristallovioletto hanno formato principalmente filopodi e lamellipodi. Al contrario, le cellule che esprimono DKK3 hanno formato più lobopodi con quasi totale assenza di lamellipodi e pochissimi filopodi. Inoltre, si notino le differenze di polarità tra le cellule che esprimono DKK3 e le linee cellulari di controllo.

Il grafico mostra la proporzione di diverse estensioni cellulari nelle tre linee cellulari testate. Si noti la percentuale significativamente più alta di lobopodi nelle cellule che esprimono DKK3. I grafici a linee mostrano la percentuale di cellule che sono rimaste attaccate alla piastra dopo il trattamento con la soluzione di dissociazione per i punti temporali indicati nell'asse X.

In tutti i punti temporali fino a 10 minuti, le cellule che esprimono DKK3 hanno mostrato una forza di adesione cellulare significativamente più elevata rispetto alle cellule di controllo. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in un periodo di uno o due giorni a seconda della configurazione sperimentale, se viene eseguita correttamente. Durante l'esecuzione di questa procedura è importante ricordare di valutare come i cambiamenti nella morfologia dell'estensione cellulare influenzino la capacità adesiva.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come quantificare accuratamente le estensioni cellulari in relazione ai cambiamenti nelle caratteristiche di adesione delle cellule tumorali. Buona fortuna e grazie per aver guardato.