Name: Una procedura chirurgica per lamministrazione delle droghe allinterno dellorecchio in un Non umano primati comune uistitì (Callithrix jacchus) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-27T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 55 s
Description: Impara una tecnica chirurgica per somministrare farmaci all'orecchio interno nel Callithrix jacchus senza causare perdita dell'udito. Questo metodo consente di valutare terapie per la sordità umana.

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Il lavoro è supportato da sovvenzioni per M.F. dal governo giapponese MEXT KAKENHI (24592560, 15 H 04991 e 15 K 15624) e la Fondazione di scienza di Takeda di M.F. e il Jikei University priorità ricerca fondo strategico per H.J.O.

Tutte le procedure sperimentali sono state effettuate presso l'Università di Jikei, Tokyo Giappone. Movimentazione degli animali e procedure sperimentali sono state approvate dal comitato di utilizzare della Jikei University e The Animal Care istituzionali (approvazione no: 26-060) ed eseguite in conformità con le linee guida istituzionali per l'uso degli animali da laboratorio presso il Jikei Università, che sono d'accordo con le linee guida per la corretta condotta di animale esperimenti dal Consiglio scienza del Giappone (2006). Cura degli animali è stata condotta in conformità con le raccomandazioni della Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio (Istituto del laboratorio animale risorse, 1996).
1. operatoria
<ol><li>Prendere un'esplorazione cranica di tomografia computerizzata (TC) di animali (Uistiti comune) al fine di facilitare l'identificazione delle singole strutture anatomiche almeno un mese prima dell'intervento chirurgico.</li>
	<li>Eseguire un esame audiometrico almeno un mese prima dell'intervento chirurgico. Nota: Qui, abbiamo usato l'ABR per valutare lo stato dell'udito. Brevemente, un elettrodo positivo per via sottocutanea è stata posta al vertice e un elettrodo di riferimento negativo alla base dorsale all'orecchio stimolato. L'elettrodo di massa è stato disposto per via sottocutanea nella parte dorsale del collo. 17 , 18 ABRs sono stati evocati con raffica di tono (tono 1,0 ms durata con aumento di 0,1 ms burst e tempo di caduta). Il livello sonoro è stato poi ridotto in passi di 10 dB dalla sua massima ampiezza. A ogni livello sonoro, 512 risposte erano media (con stimolo polarità alternate). Soglia ABR è stato definito come il più basso livello di pressione sonora (SPL) in cui qualsiasi onda potrebbe essere rilevato.</li>
</ol>2. anestesia
<ol><li>Animali veloci dalla notte prima dell'intervento chirurgico in anestesia generale.</li>
	<li>Amministrare la 4% isoflurane e aria ambiente al 5-6 mL/min con maschera-a-faccia ventilazione oppure in una camera di induzione per induzione lenta (Figura 1A). Confermare che l'animale non risponde agli stimoli dolorosi, come il pizzico di punta.</li>
	<li>Anesthestize marmoset comune con iniezione intramuscolare (nel muscolo femorale) di una combinazione di medetomidina (0,04 mg/kg), midazolam (0,4 mg/kg) e butorfanolo (0,4 mg/kg).</li>
	<li>Iniettare per via sottocutanea ampicillina (0,08 mg/g) 30 min o più prima dell'incisione della pelle come un antibiotico preoperatorio.</li>
	<li>Posizionare l'uistitì in posizione supina con la testa verso l'alto ed estendere la testa e il collo. Difficoltà la mascella superiore al tavolo con un filo di nylon e tirare la linguetta per ottenere una buona vista, oppure utilizzare un laringoscopio per visualizzare l'epiglottide e l'entrata della laringe in alternativa (Figura 1B).</li>
	<li>Inserire un tubo endotracheale lungo la superficie laringea dell'epiglottide. Nota: È possibile utilizzare un catetere endovenoso di calibro 16, o 6-francese calibro tubo di alimentazione, come un tubo endotracheale (Figura 1).</li>
	<li>Verifica la EtCO2 dal tubo endotracheale al fine di confermare che è stato correttamente inserito nella trachea. Dopo aver posizionato il tubo e movimento respiratorio di gas è stato controllato, fissare il tubo endotracheale al viso di uistitì con nastro adesivo.</li>
	<li>Mantenere l'anestesia tra 1-3% Isoflurane durante l'operazione.</li>
	<li>Monitorare la SpO2, EtCO2, temperatura corporea e temperatura rettale durante le operazioni. Eseguire tutte le procedure su una stuoia di riscaldamento per evitare una diminuzione della temperatura corporea.</li>
</ol>3. la preparazione
<ol><li>Preparare l'uistitì in posizione supina e inclinare la testa a un angolo di 30-45 gradi al lato inoperante (Figura 2A).</li>
	<li>Radere la regione post-auricolare dal lato attivo.</li>
	<li>Disinfettare l'area chirurgica con alcool e povidone iodio, sia nella regione del alberino-auricolare e canale uditivo esterno.</li>
	<li>Mettere un foglio di telo chirurgico con un foro rotondo sulla uistitì (Figura 2B).</li>
</ol>4. interventi chirurgici
<ol><li>Iniettare 1% di lidocaina cloridrato (con epinefrina 1: 100.000, 0.1-0.2 mL) per via sottocutanea nel sito di incisione della pelle. Fare un'incisione nella pelle postauricular con una lama di forma circolare n ° 15.</li>
	<li>Per emostasi, applicare pressione sulla zona sanguinante utilizzando una garza imbevuta di epinefrina 1:5,000 diluito. Cauterizzazione bipolare è anche efficace (Figura 2).</li>
	<li>Aprire i tessuti molli della regione alberino-auricolare quindi quella cartilagine auricolare (c) e muscolo post-auricolare (m) può essere riconosciuto. Esporre l'osso del canale uditivo esterno che deve essere visibile nel profondo la cartilagine (Figura 3A).</li>
	<li>Per confermare la profondità della membrana timpanica, esporre la parte ossea del cerchio timpanico che può essere riconosciuto come l'aderenza della pelle e dell'osso nella parte più profonda del canale posteriore dell'orecchio. Nota: Questo passaggio permette di riconoscere quanto è profonda la parte laterale della cavità dell'orecchio medio è (Figura 3A).</li>
	<li>Sbucciare i muscoli alberino-auricolari (muscolo sternocleidomastoideo, muscolo di splenio della testa e del ventre posteriore del muscolo digastrico) verso l'aspetto caudale, separato dall'osso temporale. Quindi esporre la superficie laterale dell'osso temporale (asterisco nella Figura 3B).</li>
	<li>Fare un foro di circa 5 mm dietro il canale uditivo esterno con un fu seppellito nel diamante di 1,0 mm (Figura 3). Utilizzare una velocità di punta di 1.000-8.000 giri/min a seconda del sito di perforazione. Nota: Una velocità lenta è adeguata per la delicata manipolazione vicino il canale semicircolare o del nervo facciale. Goccia a goccia la soluzione fisiologica nel sito correttamente per evitare la lesione termica di perforazione.</li>
	<li>Allargare il foro di perforazione e confermare la posizione del canale semicircolare orizzontale (HSC), che sporge verso la cavità mastoid (Figura 3D).</li>
	<li>Confermare la posizione del nervo facciale cui parte verticale viene eseguito anteriore di HSC. Forare e rimuovere tutti i setti di osso, se presenti, per ottenere una visione chiara dell'incavo facciale, che si trova al centro dell'area triangolare tra il nervo facciale e la corda del timpano.</li>
	<li>Fate un piccolo foro di perforazione tra la parte verticale del nervo facciale e il timpanico rim (asterisco nella Figura 4A) con una fresa diamantata di diametro 0,6 mm a 1.000 giri/min.</li>
	<li>Spostare la fresa parallela alla parete posteriore del canale per evitare danni al nervo facciale, che può essere visto come una linea rosa attraverso l'osso assottigliata. Fermare la trivella immediatamente prima che il nervo è esposto come una struttura di linea bianca (Figura 4B).</li>
	<li>Garantire che la nicchia della finestra rotonda possa essere visualizzata attraverso il foro (Figura 4). Quindi, amministrare farmaci nella nicchia con un ago calibro 25 o più sottile. Al fine di conservare i farmaci nella nicchia della finestra rotonda, posizionare una soluzione viscosa sulla nicchia (Figura 4).</li>
	<li>Dopo aver confermato che l'emostasi è saldamente controllata, chiudere gli strati (strato epidermico e dermico strato) con semplice sutura interrotto utilizzando thread assorbente 6-0.</li>
	<li>Difficoltà garza sulla ferita chirurgica e apporre un bendaggio.</li>
</ol>5. postoperatoria
<ol><li>Amministrare atipamezolo cloridrato (0,15 mg/kg) per via intramuscolare nel muscolo femorale di contrapporrsi medetomidina.</li>
	<li>Quando inizia di respirazione spontanea, rimuovere il tubo endotracheale.</li>
	<li>Mantenere il marmoset comune in un'unità di cure intensive al 30% O2, 29 ℃ fino a quando l'anestesia svanisce per completare l'eccitazione.</li>
	<li>Confermare che non ci sono risultati indicativi di disfunzione vestibolare come nistagmo e restituire l'animale nella gabbia di allevamento.</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Il volume del flusso sanguigno cocleare è estremamente piccolo, stimato nell'ordine di 1/1.000.000 di gittata cardiaca totale in esseri umani, e l'accesso è limitato dalla presenza della barriera sangue-coclea che separa l'orecchio interno dalla circolazione generale19 ,20. Per questi motivi, droga o amministrazione di vettore virale nell'orecchio interno è favorevole, non tramite somministrazione sistemica ma piuttosto di amministrazione diretta. Nel topo e cav...

Perdita dell'udito neuro-sensoriale (SNHL) si manifesta principalmente da deficit nella coclea o danni. Le cause più comuni di SNHL includono invecchiamento (ad es. presbiacusia), difetti genetici, esposizione a rumori forti, infezione e farmaci ototossici1. L'organizzazione mondiale della sanità (OMS) stima che oltre 360 milioni di persone, che rappresentano il 5,3% della popolazione del mondo, soffrono di udito perdita2. Si stima anche che 1 in 900 a 1 in 2.500 neonati hanno moderato, severo, e ipoacusia permanente congenita profonda e circa uno in tre adulti oltre 65 anni hanno un certo grado di perdita di udito3. Tuttavia, non c'è nessun efficace trattamento clinico di perdita dell'udito per questi pazienti.
Ricerca di udienza lungo è stato eseguito utilizzando roditore o modelli di cavia, e molti approcci, quali la terapia genica e la terapia rigenerativa, sono stati suggeriti come un nuovo trattamento per la perdita dell'udito. Tuttavia, c'è una grande differenza tra gli esseri umani e roditori in termini di sistema uditivo, ed è molto difficile da tradurre modelli animali per applicazioni sull'uomo. Il comune uistitì (c. jacchus), una scimmia del nuovo mondo che proviene dal Rio delle Amazzoni, è diventato un modello attraente primate non umano per vari studi di ricerca di base per diversi motivi. In primo luogo, la sua anatomia e la fisiologia sono più simili a quelli degli esseri umani piuttosto che roditori. In secondo luogo, le informazioni biologiche di base riguardo a questa specie, tra cui malattie, reti neurali, il comportamento e il genoma, sono ben caratterizzate. Elaborazione uditiva e vocale, la codifica corticale di periodicità, la rappresentazione del passo e le interazioni uditivo-vocale di uistitì comuni sono stati anche segnalati4,5,6,7 , 8 , 9 , 10. in recenti studi istologici, i ricercatori hanno identificato i modelli di espressione distintiva di 20 geni sordità e scambiatori di anioni nella coclea di uistitì di comune e ha scoperto che cinque geni causativi di sordità progressiva e tre scambiatori di anioni, avuto modelli di espressione diversi da quelli di roditori11,12. Questi profili ci portano a credere che il marmoset comune è un potente strumento per la ricerca di udienza.
Gli attributi più marcati di uistitì di comune come un animale da laboratorio sono come segue:
<ul><li>Maneggevolezza con una piccola dimensione corporea rispetto ad alcune specie del vecchio mondo scimmie: uistitì adulti pesano 300-400 g e sono circa 60 cm di altezza, che è simile ai ratti.</li>
	<li>Primate altamente riproduttiva: uistitì raggiungono la maturità sessuale ad un'età di 18 mesi e sono in grado di sopportare due volte all'anno e producono prole di 4 a 6 ogni anno.</li>
	<li>Modificazioni genetiche sono disponibili: Sasaki E et al. è riuscito a creare transgenici13 e knock-out14 primati utilizzando Uistitì di modificazioni genetiche implicate nei disturbi neurologiciad es., morbo di Parkinson di ( malattia e malattia di Alzheimer).</li>
	<li>Entrambe le cellule staminali embrionali (ES) e pluripotenti indotte (iPS) staminali sono stati stabiliti15,16. Anche se è piuttosto difficile mantenere lo stesso numero di uistitì rispetto ai roditori, la disponibilità di cellule staminali o cellule iPS fornisce saggi in vitro che ridurranno il numero di saggi in vivo necessaria.</li>
</ul>Per facilitare la ricerca traslazionale di meglio nel campo della sordità e della sua terapia potenziale, abbiamo stabilito un protocollo di studio di imaging utilizzando CT e MRI, anestesia generale e test dell'udito utilizzando risposte uditive del tronco cerebrale (ABR). Questi sistemi sperimentali possono fornirci le migliori opportunità di ottenere la prova pre-clinico di studi concettuali che sono essenziali per colmare i divari tra gli studi del roditore e studi clinici. Qui, segnaliamo un metodo chirurgico per amministrare le droghe all'interno dell'orecchio dell'uistitì comune attraverso la membrana della finestra rotonda. Per ottenere una visione chiara intorno la finestra rotonda, senza manipolare la membrana timpanica che potrebbe causare una perdita della capacità uditiva conduttiva, è utile all'approccio da cavità mastoid. Clinicamente, questo approccio, definito come "posteriore tympanotomy" è ben consolidata e solitamente utilizzato per la chirurgia coclea impianto e cholesteatoma. Noi crediamo che tympanotomy posteriore ci permette di effettuare la gestione accurata delle droghe senza indurre la perdita della capacità uditiva.

<table><tbody><tr><td>uistitì comune</td><td>CLEA Giappone</td><td>EDM:C.Marmoset(Jic)</td><td></td></tr><tr><td>isoflurano</td><td>Phizer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>medetomidina</td><td>ZENOAQ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>midazolam</td><td>astellas</td><td></td><td></td></tr><tr><td>butorphanol</td><td>Meiji Seika</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ampicillina</td><td>Meiji Seika</td><td></td><td></td></tr><tr><td>lidocaina cloridrato</td><td>AstraZeneca</td><td></td><td></td></tr><tr><td> 6-0 filo assorbente</td><td>ETHICON</td><td>RD-1</td><td></td></tr><tr><td>atipamezolo cloridrato</td><td>ZENOAQ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>soluzione salina tamponata con fosfato</td><td>Wako</td><td>045-29795</td><td></td></tr><tr><td>Surge Wave</td><td>Morita</td><td>TR-900-OR</td><td></td></tr><tr><td>Diamond Bar 006</td><td>Morita</td><td>14070057</td><td></td></tr><tr><td>Diamond Bar 010</td><td>Morita</td><td>14070081</td><td></td></tr><tr><td>unità di terapia intensiva</td><td>Menix</td><td>P-100</td><td></td></tr></tbody></table>

una procedura chirurgica per l'amministrazione delle droghe all'interno dell'orecchio in un non umano primati comune uistitì (callithrix jacchus)

A Surgical Procedure for the Administration of Drugs to the Inner Ear in a Non-Human Primate Common Marmoset (Callithrix jacchus)

Sentendo la ricerca lungo è stata facilitata dai modelli del roditore, anche se in alcune malattie, sintomi umani non possono essere ricapitolati. Il comune uistitì (Callithrix jacchus) è una scimmia di nuovo mondo piccola, facile da maneggiare che ha un'anatomia simile dell'osso temporale, compresi le catene degli ossicini dell'orecchio medio e orecchio interno agli esseri umani, inferiore rispetto a quello dei roditori. Qui, segnaliamo un approccio chirurgico riproducibile, sicuro e razionale alla nicchia cocleare finestra rotonda per la consegna di droga all'interno dell'orecchio di uistitì di comune. Abbiamo adottato tympanotomy posteriore, una procedura utilizzata clinicamente in chirurgia umana, per evitare la manipolazione della membrana timpanica che può causare la perdita della capacità uditiva conduttiva. Questa procedura chirurgica non ha condotto a qualsiasi significativa perdita di udito. Questo approccio è stato possibile grazie alla struttura grande bulla del marmoset comune, anche se il canale semicircolare laterale e la parte verticale del nervo facciale dovrebbe essere considerati con attenzione. Questo metodo chirurgico permette di eseguire la gestione sicura e precisa delle droghe senza perdita di udito, che è di grande importanza nell'ottenere pre-clinici proof of concept per ricerca traslazionale.

Tympanotomy posteriore è stato effettuato senza alcuna complicazione come un'infezione del sito chirurgico, sanguinamento con lesioni vascolari o disfunzione vestibolare, che a volte si verifica con la manipolazione dell'orecchio medio. Abbiamo effettuato tympanotomy posteriore sull'orecchio destro del marmoset comune 7-anno-vecchio ed amministrato 1 µ l di tampone fosfato salino per la nicchia della finestra rotonda. ABRs sono stati misurati prima e due mesi dopo l'intervento chirurgico ...

Segnaliamo un metodo chirurgico per amministrare le droghe all'interno dell'orecchio di un primate non umano, il comune uistitì (Callithrix jacchus), tramite la membrana della finestra rotonda.

Una procedura chirurgica per l'amministrazione delle droghe all'interno dell'orecchio in un Non umano primati comune uistitì (Callithrix jacchus)

Hearing research has long been facilitated by rodent models, although in some diseases, human symptoms cannot be recapitulated. The common marmoset ...

L'obiettivo generale di questa procedura chirurgica è valutare gli effetti di specifici farmaci di interesse sulla funzione uditiva dell'uistitì comune di primati non umani attraverso la loro somministrazione sicura nell'orecchio interno senza indurre la perdita dell'udito. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave sulla somministrazione di farmaci nell'orecchio interno, tra cui come aprire la cavità principale e dove somministrare il farmaco. Il vantaggio principale di questa tecnica è che l'orecchio interno può essere un vantaggio senza complicazioni, il che è fondamentale per valutare l'efficienza dei trattamenti dell'orecchio interno nei primati.Le implicazioni di questa tecnica si estendono allo studio di potenziali terapie per la sordità umana, poiché il sistema uditivo dell'uistitì è abbastanza simile a quello degli esseri umani. La padronanza di questo metodo è fondamentale e la postura e l'anatomia sono difficili da imparare e richiedono che quella piccola finestra venga creata nello spazio ristretto senza danneggiare il pomello facciale o la catena ossiculare. Confermare il livello appropriato di sedazione pizzicando le dita dei piedi e posizionare l'animale

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Questo video mostra la canalostomia, una procedura che consente la somministrazione locale di farmaci nell'orecchio interno di un topo attraverso il canale semicircolare con danni minimi all'udito e alla funzione vestibolare. Questo metodo consente l'inoculazione di vettori virali, prodotti farmaceutici e piccole molecole nell'orecchio interno del topo.

Canalostomia per la somministrazione locale di farmaci nell'orecchio interno di un topo adulto

Due approcci microchirurgici per la somministrazione locale di farmaci all'orecchio interno sono descritti e confrontati in termini di impatto sui parametri uditivi, citoarchitettura cocleare ed espressione di marcatori infiammatori.

Uno studio comparato Drug metodi di consegna mirate per l'orecchio interno mouse: Bullostomy Versus Iniezione transtimpanica

In questo studio, descriviamo l'approccio del canale semicircolare posteriore come un metodo affidabile per la consegna del gene dell'orecchio interno in topi neonatali. Indichiamo che consegna del gene attraverso il canale semicircolare posteriore è in grado di irrorare l'intero orecchio interno.

Approccio del canale semicircolare posteriore per consegna del Gene dell'orecchio interno in Mouse neonatale

Qui descriviamo la procedura canalostomy che permette la consegna di droga locale nelle orecchie interno dei topi adulti e neonati attraverso il canale semicircolare con minimo danno alla funzione uditiva e vestibolare. Questo metodo può essere utilizzato per inoculare vettori virali, prodotti farmaceutici e le piccole molecole nell'orecchio interno del mouse.

Canalostomy come un approccio chirurgico alla consegna di droga locale nelle orecchie interno dei topi adulti e neonati

Modelli animali di impianti cocleari possono far progredire le conoscenze delle basi tecnologiche di trattare la perdita permanente dell'udito neuro-sensoriale con stimolazione elettrica. Questo studio presenta un protocollo chirurgico per assordante acuta e l'impianto cocleare di un array di elettrodi in topi come pure la valutazione funzionale con risposta uditiva del tronco cerebrale.

Chirurgia di impianto cocleare e registrazioni di risposta elettricamente evocate uditive del tronco cerebrale in topi C57BL/6

Abbiamo sviluppato una matrice electrocorticographic intero-corticale per il marmoset comune che continuamente copre quasi tutta la superficie laterale della corteccia, dai poli frontale e occipitale pole per il temporale. Questo protocollo descrive una procedura di impianto cronica della matrice nello spazio epidurale del cervello uistitì.

Impianto cronico di tutto-corticale Electrocorticographic Array nel Marmoset comune

Qui, dimostriamo la risonanza magnetica (MR) guidata dalla convezione migliorata (CED) dei vettori virali nella corteccia come un approccio efficiente e semplificato per ottenere l'espressione optogenetica attraverso grandi aree corticali nel cervello macaco.

Convezione Consegna migliorata del vettore virale optogenetico adeno-associato alla Corteccia di Rhesus Macaque Sotto la guida di immagini MRI online

Questo lavoro presenta un protocollo per eseguire un impianto stereotassico e neurochirurgico di array di microelettrodi nel comune marmoset. Questo metodo consente specificamente registrazioni elettrofisiologiche in animali che si comportano liberamente, ma può essere facilmente adattato a qualsiasi altro intervento neurochirurgico simile in questa specie (ad esempio, cannula per la somministrazione di farmaci o elettrodi per la stimolazione cerebrale).

Chirurgia stereotassica per l'impianto di array di microelettrodi nel Common Marmoset (Callithrix jacchus)

I microazionamenti personalizzati consentono il targeting sub-millimetrico dei siti di registrazione corticale con array lineari di silicio.

Elettrofisiologia dell'attività corticale laminare nell'uistitì comune

Per studiare l'evoluzione del linguaggio, è importante confrontare i meccanismi cerebrali negli esseri umani con quelli dei primati non umani. Abbiamo sviluppato un metodo per misurare in modo non invasivo l'elettroencefalografia (EEG) degli animali svegli. Ci consente di confrontare direttamente i dati EEG tra esseri umani e animali a lungo termine senza danneggiarli.

Misurazioni dell'elettroencefalografia in uistitì svegli che ascoltano vocalizzazioni conspecifiche 

Impara una tecnica chirurgica per somministrare farmaci all'orecchio interno nel Callithrix jacchus senza causare perdita dell'udito. Questo metodo consente di valutare terapie per la sordità umana.

Una procedura chirurgica per lamministrazione delle droghe allinterno dellorecchio in un Non umano primati comune uistitì (Callithrix jacchus) (Video) | JoVE Journal

Una procedura chirurgica per l'amministrazione delle droghe all'interno dell'orecchio in un Non umano primati comune uistitì (Callithrix jacchus)

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