Site-Directed immobilizzazione della proteina morfogenetica ossea 2 a superfici solide di Click Chemistry

L'obiettivo generale di questo studio è la produzione robusta e riproducibile di un'impalcatura osteogenica mediante accoppiamento sito-diretto e covalente di una variante BMP2 di nuova concezione mediante click chemistry. Questo metodo può aiutare a superare i problemi legati alle tecniche di uso comune per il trattamento della mancata guarigione dei difetti delle ossa lunghe. I metodi di assorbimento o incapsulamento richiedono quantità super fisiologiche di BMP2 che provocano diversi gravi effetti collaterali.

Il vantaggio principale di questa tecnica è quello di utilizzare quantità inferiori della variante BMP2 di nuova concezione che è legata covalentemente agli scaffold in modo diretto lateralmente. Propagare una singola colonia durante la notte in 50 millilitri di terreno LB con 50 microgrammi per millilitro di kanamicina e 100 microgrammi per millilitro di ampicillina a 37 gradi Celsius. Diluire le colture notturne da uno a 20 in 800 millilitri di fantastico brodo integrato con 50 microgrammi per millilitro di kanamicina e 100 microgrammi per millilitro di ampicillina.

Coltivare le colture a 37 gradi Celsius fino a raggiungere una densità ottica a 600 nanometri di 0,7. Quindi aggiungere propofol L-Lycine a una concentrazione finale di 10 millimolari. Indurre l'espressione genica mediante l'aggiunta di IPTG per una concentrazione finale di un millimolare.

Coltiva la coltura a 37 gradi Celsius per 16 ore in un agitatore orbitale a 180 giri/min. Dopo l'incubazione, centrifugare l'intera coltura a 9.000 volte g per 30 minuti. Scartare il surnatante e risospendere il pellet batterico in 30 millilitri di tampone TBSE.

Pesare un becher da centrifuga vuoto e trasferire il pellet risospeso nel becher vuoto. Quindi centrifugare il pellet risospeso a 6, 360 volte g per 20 minuti. Scartare il surnatante e pesare il becher con il pellet.

Sottrarre il peso del becher vuoto per calcolare il peso del pellet. Quindi risospendere il pellet nel tampone STE. Utilizzare 200 millilitri di tampone STE per ogni 10 grammi di pellet.

Sonicare la sospensione sul ghiaccio prima di centrifugare a 6, 360 volte g per 20 minuti. Scartare il surnatante e pesare il pellet. Dopo aver ripetuto le fasi di sonicazione e centrifugazione quattro volte, risospendere il pellet in 100 millilitri di tampone TBS.

Centrifugare a 6, 360 volte g per 20 minuti. Quindi scartare il surnatante e pesare il pellet. Risospendere il pellet nel tampone nucleasico con la nucleasi appena aggiunta utilizzando 10 millilitri per grammo di pellet.

Incubare la sospensione per una notte a temperatura ambiente su una piastra di agitazione a 30 giri/min. Il giorno successivo aggiungere Triton Buffer alla sospensione. Il volume di Triton Buffer da aggiungere corrisponde a una parte di volume 0,5 della sospensione.

Dopo aver incubato per 10 minuti a temperatura ambiente, centrifugare la sospensione a 6, 360 volte g per 20 minuti. Scartare il surnatante e pesare il pellet. Successivamente, risospendere il pellet nel tampone TE utilizzando otto millilitri per grammo di pellet.

Dopo la centrifugazione come prima, scartare il surnatante e pesare il pellet. Ora risospendere il pellet aggiungendo quattro millilitri per grammo di acitato di sodio 25 millimolare, PH5, e cinque millilitri per grammo di cloruro di guanidinio a sei molari con un millimolare DTT. Incubare la sospensione per una notte a quattro gradi Celsius su una piastra di agitazione.

Dopo la centrifugazione a 75, 500 volte g per 20 minuti, il surnatante contiene la proteina BMP2 monomerica non ripiegata. Raccogliere il surnatante e concentrare questo estratto a una densità ottica per millilitro di 20 utilizzando una membrana di taglio del peso molecolare di tre kilodalton in una cella di concentrazione. Aggiungere i monomeri concentrati in gocce singole al tampone di rinaturazione mescolando.

Quindi incubare la soluzione a temperatura ambiente per 120 ore al buio. Regolare il pH della soluzione a 3,0 utilizzando acido cloridrico concentrato prima di dializzare la soluzione con un millimolare di acido cloridrico. Concentrare la soluzione dializzata utilizzando una membrana di taglio del peso molecolare da 10 kilodalton in una cella di concentrazione.

Successivamente caricare la soluzione proteica sulla colonna equilibrata, diluire le frazioni utilizzando un gradiente lineare di tampone B, raccogliendo due frazioni millilitro. Analizzare 20 microlitri di ciascuna frazione mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide SDS seguita dalla colorazione Coomassie Brilliant Blue per determinare le frazioni contenenti monomeri e le frazioni contenenti dimeri. Successivamente estrarre il dimero contenente le frazioni.

Dializzare la pozza di frazioni contenenti dimero per una notte a quattro gradi Celsius contro cinque litri di acido cloridrico millimolare. Concentrare il prodotto utilizzando un'unità di filtro centrifugo concentratore da 10 kilodalton prima di analizzare il prodotto finale mediante colorazione SDS-PAGE e Coomassie Brilliant Blue. Combinare 20 micromolari di tipo BMP2-K3Plk o BMP2-while che viene utilizzato come controllo negativo con 20 microlitri di perle di agarosio attivate da Azide in tampone di reazione ad un volume totale di 500 microlitri.

Incubare per due ore a temperatura ambiente su una miscela rotante a 20 giri/min. Arrestare la reazione aggiungendo una concentrazione finale di cinque millimolari EDTA. Incubare la soluzione a temperatura ambiente per 15 minuti su un miscelatore rotante a 20 giri/min.

Quindi centrifugare i campioni a 20.000 volte g per un minuto a temperatura ambiente e raccogliere i surnatanti. Successivamente lavare il pellet contenente le perle con 1.000 microlitri di tampone HBS 500. Centrifugare il campione a 20.000 volte g per un minuto a temperatura ambiente e raccogliere il surnatante.

Ripetere questa procedura di lavaggio altre due volte con il tampone HBS 500, tre volte con cloruro di magnesio a quattro molari e due volte con PBS, raccogliendo ogni volta il surnatante. Conservare le perle accoppiate in 1.000 microlitri di PBS a quattro gradi Celsius. Eseguire il test ALP come descritto nel protocollo di testo.

Per eseguire la colorazione ALP, coltivare cellule promioblastiche C2C12 in DMEM con il 10% di siero fetale di vitello e 100 unità per millilitro di penicillina G e streptomicina a 37 gradi Celsius in un'atmosfera umidificata al 5% di anidride carbonica. Alimentare le cellule C2C12 a una densità di 30.000 cellule per pozzetto in una micropiastra a 96 pozzetti. Dopo aver lasciato che le cellule si attacchino per una notte, rimuovere il terreno e aggiungere 20 microlitri per pozzetto di perle accoppiate PMB2-K3PLK.

Quindi aggiungere 20 microlitri di agarosio a basso punto di fusione allo 0,4% in ogni pozzetto. Centrifugare la micropiastra a 96 pozzetti a 2.000 volte g per cinque minuti a 20 gradi Celsius. Quindi aggiungere 80 microlitri dello stesso mezzo.

Incubare a 37 gradi Celsius in un'atmosfera umidificata al 5% di anidride carbonica per 72 ore. Dopo l'incubazione, rimuovere il terreno facendo attenzione a non staccare l'agarosio solidificato allo 0,4%. Aggiungere 100 microlitri per pozzetto di soluzione sub-diritta MBT-BCIP in un solo passaggio.

Analizzare la colorazione con fosfatidato alcalino utilizzando la microscopia ottica subito dopo che la colorazione viola diventa evidente. Usa la microscopia a campo chiaro e scatta foto. La bioattività della variante BMP2-K3Plk di nuova produzione è convalidata dall'induzione dell'espressione genica della fosfatasi alcalina nelle cellule C2C12.

Il test in vitro mostra livelli simili di espressione genica della fosfatasi alcalina indotta da BMP2 o BMP2-K3Plk. Le perle rivestite con BMP2-K3Plk tramite l'addizione di alchino alchino azide catalizzato da copertura hanno prodotto fluorescenti quando incubate con l'eco-dominio 1A del recettore BMP dimarcato. Il legame del recettore BMP 1A al BMP2-K3Plk conferma il mantenimento della bioattività dopo l'accoppiamento.

La bioattività delle perle funzionalizzate BMP2-K3Plk è stata dimostrata mediante colorazione mediata da ALP. La colorazione si è verificata solo in quelle cellule che erano in contatto diretto con le perle funzionalizzate BMP2-K3Plk, confermando che la proteina è effettivamente legata covalentemente alle perle e non solo assorbita. Se la proteina fosse stata rilasciata nella situazione assorbita, si sarebbe osservata una colorazione più diffusa a distanze maggiori, come si vede qui per la colorazione con fosfatasi alcalina dopo il trattamento con BMP2-K2Plk solubile.

Dopo aver visto questo video dovresti avere una buona comprensione di come esprimere e produrre proteine biologicamente attive mediante espansione genetica e come accoppiare covalentemente una proteina romanzata a microsfere mediante reazione chimica di clic. La generazione di varianza proteica mediante espansione genetica consente, in linea di principio, l'introduzione di amminoacidi artificiali in qualsiasi posizione della sequenza proteica primaria. L'introduzione di una mutazione nella sequenza BMP2 può influenzare l'efficienza del ripiegamento e può anche modificare i parametri della proteina.

La produzione di BMP2-K3Plk ha richiesto una modifica del metodo stabilito per l'espressione del tipo BMP2. Il BMP2-K3Plk prodotto ha mostrato un'attività biologica paragonabile a quella della proteina di tipo while. Il nostro approccio di accoppiare covalentemente la variante BMP2 a perle di agarosio romanzate con azire mediante chimica click potrebbe essere realizzato con alta efficienza, risultando in perle romanzate, determinando una differenziazione genetica in vitro.

Deve essere garantita una protezione standard secondo le buone pratiche di laboratorio.