Name: In Vitro Saggio di SUMOilazione per studiare lattività E3 ligasi SUMO (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-29T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Impara un saggio di SUMOilazione in vitro per identificare nuove ligasi E3 SUMO e studiarne la specificità verso diversi isoformi SUMO. Questo metodo avanzato consente di analizzare la modificazione post-traduzionale delle proteine.

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Quest'opera è stata sostenuta da sovvenzioni dal Ministero della scienza e tecnologia (la maggior parte, 105-2320-B-010-007-MY3 a PCC), dall'Istituto di ricerca di salute nazionale (vi-EX105-10215BC a PCC), dal Ministero della scienza e tecnologia (più 105-2314-B-400-019 di HJK) e dell'Istituto di ricerca di salute nazionale (vi MG-105-SP-10, vi MG-106-SP-10 di HJK). Questo lavoro è stato supportato anche parzialmente con National Yang-Ming University sulla pubblicazione del manoscritto di PCC. I finanziatori non avevano alcun ruolo nel disegno dello studio, raccolta dati e analisi, decisione di pubblicare o riparazione del manoscritto.

1. preparazione di costrutti di espressione di Baculovirus
<ol><li>
Purificare il SUMO E3 ligasi K-bZIP di clonazione del cDNA di K-bZIP19 in un vettore di baculovirus duplice espressione (Vedi tabella materiali) con un epitopo-tag N-terminale. Abbiamo avuto successo usando un tag di octapeptide (indicato in tutto il protocollo come vettore-tag-K-bZIP). Nota: Il modello di DNA per K-bZIP della polimerasi reazione a catena (PCR) clonazione è cDNA inverso trascritto dal RNA isolato dalle cellule di TREx F3H3-K-Rta BCBL-1 seguono doxiciclina trattamento20.<ol>
<li>Trasferimento del full-length cDNA di K-bZIP19 nel vettore di espressione dual con CpoI siti di clonazione. CPO Io digerisco il prodotto PCR e 1 µ g del vettore duplice espressione a 37 ° C per 3 h21.</li>
		<li>Separare ed estrarre il DNA digerito dopo elettroforesi su un gel di agarosio 0.8%22. Legare l'inserto (K-bZIP) e vettore di T4 DNA ligasi a 16 ° C per 30 min secondo le istruzioni del produttore (Vedi Tabella materiali).</li>
		<li>Aggiungere 5 µ l di legatura del DNA a 50 µ l competente Escherichia coli cellule "A" (Vedi Tabella materiali) in una provetta da 1,5 mL. Mettere il ghiaccio per 30 min. Quindi, incubare la provetta da 1,5 mL in bagnomaria a 42 ° C per 45 s e mettere immediatamente il tubo sul ghiaccio per 3 min.</li>
		<li>Aggiungere 600 µ l di terreno S.O.C (0,5% (p/v) di Estratto di lievito, tryptone di 2% (p/v), 10 millimetri di NaCl, 2.5 mM KCl, 20mm MgSO4e 4% (p/v) di glucosio) nel tubo e incubare a 37 ° C per 1 h. Quindi, centrifugare la provetta a temperatura ambiente per 3 min a 600 x g.</li>
		<li>Rimuovere il surnatante, risospendere il pellet con il mezzo di Luria-Bertani 60 µ l (LB; tryptone di 1% (p/v), 0,5% (p/v) di lievito estratto e 85 mM NaCl) e la diffusione su piastre di agar LB contenente ampicillina di 100 µ g/mL. Incubare la piastra di agar a 37 ° C per 16 h23,24.</li>
		<li>Selezionare 1 Colonia per inoculare in 5 mL di terreno LB contenente 100 µ g/mL ampicillina e coltura a 37 ° C per 16 h con 250 giri/min agitazione. Quindi, estrarre il plasmide, vector-tag-K-bZIP, da un kit di estrazione del plasmide secondo le istruzioni del produttore (Vedi Tabella materiali).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Generare il bacmid ricombinante che harboring le bZIP-K-tag di trasformazione del vettore-tag-K-bZIP in competente Escherichia coli cellule "B" (Vedi tabella materiali).
	<ol>
<li>Mescolare 0,2 µ g vettore-tag-K-bZIP plasmide e 100 µ l competente E. cellule di coli "B" in una provetta da 1,5 mL e mettere il ghiaccio per 30 min. Incubare la provetta nel bagnomaria a 42 ° C per 45 s e mettere immediatamente il tubo sul ghiaccio per 3 min.</li>
		<li>Aggiungere 900 µ l di terreno di S.O.C nel tubo e incubare a 37 ° C per 4 h con rotazione a 50 giri/min. Successivamente, prendere 10 µ l del mezzo, aggiungere un ulteriore 50 µ l di S.O.C medium per diffondere su piastre di agar LB contenente kanamicina di 50 µ g/mL, 7 µ g/mL Gentamicina, tetraciclina di 10 µ g/mL, substrato di galattosidasi 100 µ g/mL e 40 µ g/mL isopropilico β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG ) e incubare le piastre per 48 h a 37 ° C.</li>
		<li>Inoculare una colonia bianca in 5 mL di terreno LB contenente kanamicina di 50 µ g/mL, 7 µ g/mL Gentamicina e la tetraciclina di 10 µ g/mL. Incubare a 37 ° C con 250 giri/min agitazione per 16 h.</li>
		<li>Isolare il bacmid ricombinante del DNA che harboring il tag-K-bZIP, quantificare e risospendere ad una concentrazione di 1 µ g / µ l25.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Generare ricombinante Baculoviridae esprimendo tag-K-bZIP di transfezione 1 µ g di bacmid ricombinante del DNA contenente tag-K-bZIP in cellule Sf9 in un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti.
	<ol>
<li>Semi 2 x 106 Sf9 celle (Vedi Tabella materiali) in insetto Medium di 2ml grazia fornito con 10% siero bovino fetale (FBS) e gentamicina 1% in ogni bene di una piastra ben 6, quindi incubare a 27 ° C per 1 h.</li>
		<li>Mantenere una cultura di fase log delle cellule Sf9 in insetto Medium di grazia fornito con 10% FBS, gentamicina 1% e 1% detergente C (Vedi Tabella materiali) a 27 ° C in sospensione orbitale a 140 giri/min. Contare le celle utilizzando un emocitometro e colorazione blu di trypan; vitalità cellulare deve superare il 95%. Mantenere le cellule utilizzando un rapporto di subcoltivazione di 1:3 ogni 2-3 giorni (densità minima ~0.5 x 106 cellule/mL).</li>
		<li>Aggiungere 2 µ l bacmid del DNA (1 µ g / µ l) e µ l 98 riduzione media del siero (Vedi Tabella materiali) in una provetta da 2 mL. Quindi, aggiungere 4 µ l di reagente di transfezione (Vedi Tabella materiali) al tubo e mescolare bene. Incubare a temperatura ambiente per 15 min.</li>
		<li>Aggiungere questa miscela di transfezione (104 µ l) in ogni pozzetto e incubare a 27 ° C per 12-16 h.</li>
		<li>Rimuovere i supporti esausti con leggera aspirazione e sostituire con 2 mL di terreno di insetto di Grace fresco fornito con 10% FBS e 1% gentamicina. Le cellule Sf9 aderiscano liberamente alla superficie della placca e non essere disturbate con leggera aspirazione.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Raccogliere baculovirus ricombinanti dopo trasfezione e amplificare baculovirus per ottenere scorte di alto-titolo (P1) per ulteriori esperimenti.
	<ol>
<li>72 h dopo il cambio medio, raschiare il Sf9 celle utilizzando un sollevatore di cella sterile, raccogliere il surnatante da ogni pozzetto individuo in una provetta da 1,5 mL e vortexare per 10 s.</li>
		<li>Centrifugare a 4 ° C per 3 min a 150 g. di x raccogliere surnatante come baculovirus P0 e aliquota in tubi da 1,5 mL (1 mL baculovirus in ogni tubo). Conservare a-80 ° C.</li>
		<li>Cellule di7 Sf9 seme 1 x 10 a insetto Medium di 10ml grazia fornito con 10% FBS e 1% gentamicina in un 10cm di Petri e incubare a 27 ° C per 1 h.</li>
		<li>Per l'amplificazione di Baculoviridae ricombinanti esprimenti tag-K-bZIP, aggiungere 0,5 mL P0 baculovirus alle celle Sf9 seminate e incubare a 27 ° C per 48 h.</li>
		<li>Raccogliere il surnatante baculovirus P1 in un tubo da 15 mL e conservare a 4 ° C per 1 mese.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. purificazione di K-bZIP
<ol><li>Mantenere una cultura di fase log delle cellule Sf9 in insetto Medium di grazia fornito con 10% FBS, gentamicina 1% e 1% detergente C a 27 ° C in sospensione orbitale a 140 giri/min, come descritto al punto 1.3.2.</li>
	<li>Il giorno della trasduzione, aggiungere 1 mL di surnatante contenenti baculovirus (P1) in 250 mL di Sf9 cellule con una densità di 2 x 106 cellule/mL.</li>
	<li>Incubare le cellule Sf9 per 72 h a 27 ° C su agitatore orbitale con 140 giri/min agitazione, poi raccogliere mediante centrifugazione a 2.740 x g per 15 min a 4 ° C.</li>
	<li>Rimuovere il surnatante e lisare il pellet cellulare in 10 mL di tampone di lisi (20 mM HEPES pH 7.9, 0.5 M NaCl, 1% detergente un (Vedi Tabella materiali), 2% glicerolo, inibitore della proteasi cocktail) e ruotare a 50 rpm usando un miscelatore di sospensione a 4 ° C per 30 min.</li>
	<li>Lysate a 15.000 x g per 15 min a raccogliere il surnatante delle cellule della centrifuga.</li>
	<li>Per purificare tag-K-bZIP, incubare i lisati cellulari (10 mL) con 50 µ l di anticorpo-etichetta biglie magnetiche in provette di polipropilene 14 mL e ruotarlo a 50 giri/min per 3 ore a 4 ° C, usando un miscelatore di sospensione. Dopo la cattura di proteina, pellet le perline a 800 x centrifugazione g per 30 s a 4 ° C. Rimuovere la maggior parte del surnatante e risospendere le sfere nel volume residuo di circa 1 mL trasferire in una provetta da 1,5 mL per il lavaggio.</li>
	<li>Lavare la proteina catturata inserendo il tubo contenente le perline su un supporto magnetico e rimuovere il supernatante, una volta che i branelli magnetici hanno aderito completamente al lato del tubo.</li>
	<li>
Lavare le perle con buffer di lisi quattro volte.
	<ol>
<li>Aggiungere 1 mL di tampone di lisi in provette da 1,5 mL e invertire i tubi 10 volte. Posizionare la provetta da 1,5 mL su un supporto magnetico e rimuovere il surnatante come descritto in 2.7.</li>
		<li>Ripetere il passaggio precedente altre 3 volte.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Lavare una volta le perline con tamponato fosfato salino (PBS).
	<ol>
<li>Aggiungere 1 mL di PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 1,5 mM KH2PO4) in provette da 1,5 mL e invertire i tubi 10 volte.</li>
		<li>Mettere la provetta da 1,5 mL su un supporto magnetico e quindi rimuovere il surnatante.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Eluire la proteina K-tag-bZIP dai branelli magnetici anticorpo-etichetta aggiungendo 100 µ l di 150 octapeptide µ g/mL diluito in PBS in una provetta da 1,5 mL. Ruotare il tubo per 10 min a 50 giri/min di miscelatore di sospensione a temperatura ambiente. Quindi, riposizionare il tubo sul supporto magnetico e raccogliere il surnatante in una provetta pulita da mL 1,5 K-bZIP-contenenti.</li>
	<li>Analizzare 1-5 µ l purificato proteina bZIP-K-tag da SDS-PAGE seguita da macchiatura26blu di Coomassie. Caricare 2 µ g, 1 µ g e 0,5 µ g campioni di albumina di siero bovino (BSA) sullo stesso gel e usarlo per quantificazione con un programma di elaborazione di immagini, come ImageJ. Stimare la concentrazione di K-bZIP in confronto agli standard BSA.</li>
	<li>Il K-bZIP purificata è ora pronto per essere usato per ogni test di SUMOilazione. Diluire il K-bZIP in PBS a una concentrazione finale di 100 ng / µ l e negozio in piccole aliquote a-80 ° C.</li>
</ol>3. sumoilazione Assay
<ol><li>Aggiungere 3 µ l di 100 ng / µ l di purificato tag-K-bZIP nel mix master di ogni in vitro sumoilazione reazione. Componenti in mix master contengono 1 µ l di tampone di proteina, 1 x sumoilazione tampone, proteina di p53 0,5 µ l (0,5 mg/mL), 25 nM di E1 l'enzima d'attivazione (conc. stock: 1 µM), 50 nM di E2 enzima di coniugazione (conc. stock: 10 µM) e 250 nM ogni dei peptidi SUMO (SUMO-1 , SUMO-2 o SUMO-3; Conc. Stock: 5 µM) ad un volume finale di 17 µ l.</li>
	<li>Mescolare delicatamente il contenuto e incubare la reazione a 30 ° C per 3 h. fermare la reazione aggiungendo 20 µ l di tampone di caricamento SDS-PAGE: 2x (100 mM Tris-HCL a pH 6.8, 4% sodio dodecil solfato, blu di bromofenolo 0,2% (w/v), 20% (v/v) glicerolo e 200mm β-mercaptoetanolo) e denaturare i campioni a 95 ° C per 5 min.</li>
	<li>
Campioni separati su SDS-PAGE, trasferire le proteine separate sulla membrana PVDF utilizzando un apparato di Trasferimento elettroforetico semi-secco e analizzare mediante Western blot con anticorpi anti-p53.
	<ol>
<li>Impostare l'apparecchio di gel come descritto al punto 2.11 e caricare 20 µ l di campione nei pozzetti del gel.</li>
		<li>Esegua il gel 10% in una corrente costante a 80 V per circa 120 min (fino a quando la band di tintura raggiunge il fondo del gel). Dopo il completamento dell'elettroforesi, spegnere l'alimentazione.</li>
		<li>Scollegare l'apparecchio di gel e gel di cassette per togliere il gel e galleggiare il gel in tampone di trasferimento semi-secco (48 mM Tris-HCl, glicina di 39 mM, 20% metanolo) per 5 min.</li>
		<li>Prendere un altro contenitore e immergere la membrana PVDF in metanolo per 1 min. Tolga PVDF metanolo, quindi mettere in tampone di trasferimento semi-secco. Agitare delicatamente la membrana per 5 min.</li>
		<li>Rimuovere il coperchio di sicurezza dell'apparato elettroforetico semi-secco.</li>
		<li>Pre-bagnato carta da filtro e preparare un sandwich di gel sull'anodo fondo platino come segue: carta da filtro, membrana PVDF, gel e carta da filtro.</li>
		<li>Coperchio piatto e sicurezza sicuro catodo, quindi eseguire macchia al 15 V corrente costante per 90 min Disabilita l'alimentazione elettrica, disinserire gli apparecchi semi-secco e togliere la membrana PVDF.</li>
		<li>Membrana di PVDF di blocco con tampone bloccante (5% senza grassi del latte nel buffer di TBST (137 mM NaCl2, 20 mM Tris-HCl, 0,1% detergente B (Vedi Tabella materiali), pH 7,6)) a temperatura ambiente per 1 h con 30 giri/min agitando a Agitatore orbitale.</li>
		<li>Ibridare la membrana PVDF con l'anticorpo anti-p53 diluito (1:1, 000) in tampone bloccante per 12-16 ore a 4 ° C con 30 giri/min agitazione utilizzando un miscelatore di sospensione.</li>
		<li>Togliere la membrana PVDF in un contenitore e mettere in TBST. Risciacquare la membrana PVDF con TBST altre due volte.</li>
		<li>Immergere la membrana PVDF in TBST per 30 min con 45 giri agitando a Agitatore orbitale.</li>
		<li>Ibridare la membrana PVDF con anti-coniglio anticorpo coniugato con perossidasi di rafano (HRP) diluito (1:4, 000) in tampone bloccante per 1 h a temperatura ambiente con 30 giri/min agitazione utilizzando un miscelatore di sospensione.</li>
		<li>Lavare la membrana PVDF con TBST 3 volte come descritto nel passaggio 3.4.10.</li>
		<li>Immergere la membrana PVDF in TBST per 30 min con 45 giri agitazione utilizzando un miscelatore di sospensione. Rimuovere TBST e aggiungere PBS per preservare la membrana PVDF a 4 ° C per fino a 12 h.</li>
		<li>Agitare il reagente substrato chemiluminescente avanzata (substrato ECL) 1 e 2 (1:1) (Vedi Tabella materiali). Rimuovere la membrana PVDF da PBS, tamponare brevemente con un tovagliolo di carta o leggeri tergicristallo per assorbire l'umidità in eccesso e immediatamente aggiungere 400 µ l di reagente di ECL alla superficie di ciascuna membrana per 3-5 min. Remove in eccesso ECL reagente tamponando brevemente, ma non consentono la m Embrane a completamente asciutto.</li>
		<li>Esporre la macchia usando un sistema di imaging luminescenza o autoradiografia pellicola27.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non divulgare nessun potenziali conflitti di interesse.

Lo in vitro sumoilazione protocollo descritto qui è usata ordinariamente per stabilire lo stato di sumoilazione di identificati Ubc9 substrati. La limitazione principale utilizzando il protocollo standard per studiare la funzione di sumoilazione di SUMO E3 ligasi è l'abbondanza di SUMO E1 attivando ed enzimi di coniugazione E2 Ubc9 che massimizzano la coniugazione di SUMO in sistemi in vitro . Considerando questa sfida, noi crediamo che titolazione della quantità di enzimi SUMO E1 ed E2 al livello che a...

Modifica di SUMO è stato inizialmente identificato come una modificazione post-traduzionale reversibile (PTM) che regola la stabilità della proteina1. Oltre a coniugazione diretta, SUMO può anche essere collegato ad una proteina attraverso l'interazione non-covalente di SUMO interazione motivi (SIMs)2. Simile all'associazione di tyrosyl-fosforilazione di molecole che harboring Src homology 2 (SH2) o phosphotyrosine binding (PTB) domini3,4, modifica di SUMO fornisce una piattaforma di interazione aggiuntiva per selettiva assunzione di5,di proteine effettrici SIM contenenti6. Oltre alla regolazione della trasduzione del segnale, sumoilazione di fattori trascrizionali e molecole di rimodellamento della cromatina servono a modulare l'espressione genica7,8. Gli studi di pattern di SUMOilazione del genoma hanno rivelato che modifica di SUMO è associato con positivo9,10 o negativo10,11,12 trascrizione regolamento, in parte a causa della specificità paralogo di SUMOilazione.
Ci sono tre isoforme principali di SUMO per proteina coniugando presente in cellule di mammiferi; Questi includono SUMO-1 e il SUMO-2 altamente omologa e SUMO-3 (denominato SUMO-2/3)13. SUMO è solitamente coniugata con il residuo di lisina (K) all'interno del motivo di ψKxD/E consenso nella proteina bersaglio. SIM nel SUMO E3 ligasi è responsabile della specificità paralogo14. In contrasto con le vie di ubiquitinazione contenente centinaia di E3 ligasi, ci sono stati solo pochi SUMO E3 ligasi identificati15. Ligasi E3 SUMO sono definiti dalla proprietà, inclusa la capacità di (i) associare Ubc9, (ii) associare frazione SUMO tramite un dominio SIM e (iii) migliorare il trasferimento di SUMO da Ubc9 sul substrato. Ligasi E3 non è assolutamente necessaria per SUMO coniugazione16, ma fornisce il substrato e SUMO-paralogo specificità. Dal solito solo una piccola frazione della proteina totale substrato è SUMO-modificato, la rilevazione di proteine SUMOilate in vivo è sempre una sfida. Pertanto, sono necessari dosaggi accurati e riproducibili per delucidare la precisa funzione di modifica di SUMO.
Lo in vitro test sumoilazione, che valuta la capacità di catalizzare sumoilazione delle proteine substrato Ubc9 purificato, è un saggio ben accettato per lo studio di SUMO modifica17. Tuttavia, attività di ligasi E3 SUMO nella maggior parte dei casi non può essere rilevato o possono essere rilevati solo con mutata ligasi SUMO con alta attività SUMO E3 ligasi e specificità di substrato basso dal protocollo standard a causa della presenza di una quantità abbondante di Ubc918 . Il successo globale di questo dosaggio dipende in gran parte la titolazione attenta di Ubc9 purificata. Il saggio in vitro sumoilazione descritto qui è stato modificato da un sumoilazione standard protocollo (Vedi Tabella materiali). L'osservazione di modificazione di SUMO globale aumentata durante la riattivazione del herpesvirus associato al sarcoma di Kaposi (KSHV) spinti ad identificare la ligasi E3 SUMO virale che può essere responsabile per l'up-regolazione di SUMOilazione. A seguito di uno screening su piccola scala delle proteine d'interazione di virale SUMO E3 ligasi K-bZIP, p53 è stato identificato come un substrato romanzo. In questo protocollo, vi mostriamo nel dettaglio nelle cellule di insetto i passaggi coinvolti nell'espressione e purificazione di selvaggio-tipo K-bZIP, una SUMO E3 ligasi virale con specificità di SUMO-2/3. La capacità del K-bZIP purificata per migliorare la sumoilazione di p53, un ben noto substrato SUMO, è valutata in presenza di ridotte quantità di enzimi E1 ed E2. Utilizzando questa analisi modificata di SUMOilazione, i ricercatori possono attendibilmente definire le capacità di SUMO E3 ligasi SUMOylate romanzo o substrati noti, che è un passo principale nello studio della proteina sumoilazione. Inoltre, questo metodo consente di identificare il romanzo SUMO E3 ligasi con basso ligasi attività ma la specificità di substrato alta.

<table><tbody><tr><td>pFastBac</td><td>Invitrogen</td><td>10359-016</td><td>vettore del baculovirus a doppia espressione</td></tr><tr><td>vettore pCR2.1-TOPO</td> vettore del prodotto <td>Invitrogen</td><td></td><td>PCR</td></tr><tr><td>cellula competente&nbsp; E. coli DH5&alpha;</td><td>Yeastern Biotech</td><td>FYE678-80VL</td><td>competente E. coli cellule A</td></tr><tr><td>E. coli DH10Bac</td><td>Invitrogen</td><td>10359-016</td><td>competente E. coli cellule B</td></tr><tr><td>FugeneHD</td><td>Roche</td><td>04709705001</td><td>reagente di trasfezione</td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Gibco</td><td>31985062</td><td>reticolo ridotto</td></tr><tr><td>T4 Ligasi</td><td>NEW England BioLabs</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>CpoI (RsrII)</td><td>Thermo Scientific</td><td>ER0741</td><td></td></tr><tr><td>Bluo-gal</td><td>Thermo Scientific</td><td>B1690</td><td>substrato di galattosidasi</td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6758-1G</td><td></td></tr><tr><td>Grace' s Insect Medium</td><td>Gibco</td><td>11605094</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Gibco</td><td>10082147</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>Thermo Fisher 15750060</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ampicillina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9393-25G</td><td></td></tr><tr><td>Kanamicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K0254-20ML</td><td></td></tr><tr><td>gentamicina</td><td>Gibco</td><td>15710-064</td><td></td></tr><tr><td>tetraciclina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>87128-25G</td><td></td></tr><tr><td>LB Brodo</td><td>Merk</td><td>1.10285.0500</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034-100G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888-5KG</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merk</td><td>1.04936.1000</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5136-500G</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>J.T.Baker</td><td>3246-01</td><td></td></tr><tr><td>sodio dodecil solfato</td><td>Merk</td><td>1.13760.1000</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoetanolo</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0710</td><td></td></tr><tr><td>TRIS (Base)</td><td>J.T.Baker</td><td>4109-06</td><td></td></tr><tr><td>Latte scremato</td><td>Fonterra</td><td></td><td></td></tr><tr><td>glicerolo</td><td>J.T.Baker</td><td>2136-01</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Amresco</td><td>0694-1L</td><td>detergente A</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Amresco</td><td>0777-500ML</td><td>detergente B</td></tr><tr><td>Poloxamer 188 soluzione</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5556-100ML</td><td>detergente C</td></tr><tr><td>Inibitore della proteasi Cocktail Tablet</td><td>Roche</td><td>04 693 132 001</td><td></td></tr><tr><td>3x Flag peptide</td><td>Sigma</td><td>F4799</td><td></td></tr><tr><td>anti-FLAG m2 Perline magnetiche</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8823</td><td>anticorpi etichettati</td></tr><tr><td>SUMOlink SUMO-1 Kit</td><td>Active Motif</td><td>40120</td><td>protocollo standard SUMOilazione&nbsp;</td></tr><tr><td>SUMOlink SUMO-2/3 Kit</td><td>Motivo attivo</td><td>40220</td><td>protocollo SUMOilazione standard&nbsp;</td></tr><tr><td>Kit di estrazione su gel QIAquick</td><td>QIAGEN</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>Mini kit di plasmidi QIAGEN</td> Kit di <td>estrazione plasmidi</td><td>QIAGEN</td><td>12123</td></tr><tr><td>Provette in polipropilene</td><td>Falcon</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>Petri Dish</td><td>Falcon</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>Sollevatore cellulare</td><td>Corning</td><td>CNG3008</td><td></td></tr><tr><td>Punta di caricamento</td><td>Sorenson BioScience</td><td>28480</td><td></td></tr> Carta da filtro <tr><td>in PVDF</td><td>PerkinElmer</td><td>NEF1002</td><td></td></tr><tr><td>Blotting</td><td>Bio-Rad</td><td>1703932</td><td></td></tr><tr><td>Apparecchio per gel per lastre Mini (Bio-Rad Mini Protean II Cell)</td><td>Bio-Rad</td><td>1658001 EDU</td><td></td></tr><tr><td>Trans-Blot SD Cella di trasferimento elettroforetica semi-secca</td><td>Bio-Rad</td><td>1703940</td><td></td></tr><tr><td>Pierce ECL Western Blotting</td><td>Thermo</td><td>32106</td><td>ECL </td></tr><tr><td>miscelatore per sospensioni</td> per reagenti <td>Digisystem laboratory instruments&nbsp; Inc.</td>Agitatore orbitale <td>SM-3000</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Kansin instruments Co.</td><td>OS701</td><td></td></tr><tr><td>ImageQuant LAS 4000 imager biomolecolare</td><td>GE Healthcare</td><td>28955810</td><td></td></tr><tr><td>Sf9</td><td>Thermo Scientific</td><td>B82501</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo anti-p53</td><td>Cell Signaling</td><td>#9282</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo anti-coniglio</td><td>GE Healthcare</td><td>NA934-1ML</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro saggio di sumoilazione per studiare l'attività e3 ligasi sumo

In Vitro SUMOylation Assay to Study SUMO E3 Ligase Activity

Modifica piccolo ubiquitina-come modificatore (SUMO) è un'importante modificazione post-traduzionale (PTM) che media la trasduzione del segnale principalmente attraverso interazioni proteina-proteina di modulazione. Simile alla modifica di ubiquitina, sumolazione è diretto da una cascata enzimatica sequenziale tra cui enzima E1-attivazione (SAE1/SAE2), enzima di coniugazione E2 (Ubc9) ed E3-ligasi (cioè, pia famiglia, RanBP2 e Pc2). Tuttavia, a differenza di ubiquitinazione, una ligasi E3 non è essenziale per la reazione, ma non fornire la precisione e l'efficacia per la coniugazione di SUMO. Proteine modificate da SUMOylation possono essere identificati dall'analisi in vivo tramite immunoprecipitazione con anticorpi specifici per substrato e immunoblotting con anticorpi specifici per SUMO. Tuttavia, la dimostrazione dell'attività della proteina SUMO E3 ligasi richiede la ricostituzione in vitro di SUMOilazione saggi utilizzando enzimi purificati, substrato e proteine SUMO. Poiché nelle reazioni in vitro , solitamente SAE1/SAE2 e Ubc9, da soli sono sufficienti per la coniugazione di SUMO, valorizzazione di sumoilazione di una putativa ligasi E3 non è sempre facile da rilevare. Qui, descriviamo una modificate in vitro sumoilazione protocollo che identifica costantemente modificati di SUMO utilizzano un sistema in vitro ricostituito. Un protocollo di passo-passo per purificare cataliticamente attiva K-bZIP, una virale SUMO-2/3 E3 ligasi, inoltre è presentato. Le attività di SUMOilazione della K-bZIP purificato sono esposte su p53, una destinazione ben nota di SUMO. Questo protocollo può essere impiegato non solo per il delucidamento romanzo SUMO E3 ligasi, ma anche per rivelare la loro specificità di paralog SUMO.

Secondo le informazioni fornite dal costruttore, la quantità di enzima E1 ed E2 nell'analisi della SUMOilazione standard è di 50 nM e 500 nM, rispettivamente. La quantità minima di E2 coniugando enzima Ubc9 che è in grado di SUMOylate p53 in primo luogo è stata determinata mediante un test di SUMOilazione in vitro . In basso come un quinto della quantità di Ubc9 usato nello standard in vitro protocollo di analisi di SUMOilazione ha saputo efficientemente SUMOylate p53 (<...

A differenza di ubiquitin-ligasi, sono stati identificati alcuni ligasi E3 SUMO. Questo modificate in vitro sumoilazione protocollo è in grado di identificare il romanzo SUMO E3 ligasi mediante saggio di ricostituzione in vitro .

In Vitro Saggio di SUMOilazione per studiare l'attività E3 ligasi SUMO

Small ubiquitin-like modifier (SUMO) modification is an important post-translational modification (PTM) that mediates signal transduction primarily ...

L'obiettivo generale di questo esperimento è quello di verificare una proteina di interesse che può essere SUMOilata o è una SUMO E3 ligasi. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della SUMOilazione, come l'identificazione della ligasi SUMO E3. Il vantaggio principale di questa tecnica è che potrebbe essere utilizzata per lo studio della specificità della ligasi SUMO E3 verso diverse forme iso di SUMO.A dimostrare la procedura sarà Wan-Shan Young, uno studente di dottorato del mio laboratorio. Per purificare il tag K-bZIP, incubare prima 10 millilitri di lisato cellulare con 50 microlitri di microsfere magnetiche marcate con anticorpi in una provetta di polipropilene da 14 millilitri. Quindi ruotare il tubo a 50 giri al minuto a quattro gradi Celsius per tre ore in un miscelatore a sospensione.Una volta catturata la proteina, centrifugare il campione a 800 volte g per 30 secondi a quattro gradi Celsius per pellettare le perline. Scartare tutto tranne un millilitro di surnatante per risospendere le perline. E trasferire le perle disciolte in un tubo da 1,5 millilitri.Per lavare le proteine catturate, posizionare il tubo con le perle su un supporto magnetico. Attendere circa tre secondi affinché le perle aderiscano alle pareti laterali del tubo e quindi rimuovere il surnatante. Per lavare le perle, aggiungere un millilitro di tampone di lisi nel tubo da 1,5 millilitri.Quindi capovolgere il tubo dieci volte. Successivamente, posizionare il tubo da 1,5 millilitri sul supporto magnetico e rimuovere il surnatante una volta che le perle aderiscono alle pareti. Per lavare nuovamente le perle, aggiungere un millilitro di soluzione salina tamponata con fosfato al tubo da 1,5 millilitri e capovolgerlo dieci volte.Quindi trasferire il tubo nel supporto magnetico e rimuovere il surnatante una volta che le perline si sono attaccate alle pareti laterali. Per eluire le proteine marcate con K-bZIP dalle biglie magnetiche marcate con anticorpi, aggiungere 100 microlitri a 150 microgrammi per millilitro di octapeptide diluito in soluzione salina tamponata con fosfato nella provetta da 1,5 millilitri. Quindi ruotare il tubo su un miscelatore a sospensione a 50 giri al minuto per dieci minuti a temperatura ambiente.Trasferire il tubo sul supporto magnetico. E poi raccogli il K-bZIP contenente surnatante. Successivamente, per analizzare il tag K-bZIP purificato, sottoporre da uno a cinque microlitri della proteina purificata alla pagina SDS, seguita dalla colorazione blu di Coomassie.Caricare 0,5, 1 e 2 microgrammi di albumina sierica bovina come standard sul gel per quantificare la concentrazione di K-bZIP. Durante l'elaborazione dell'immagine sull'immagine J.Successivamente, diluire il K-bZIP purificato in soluzione salina tamponata con fosfato. Raggiungere una concentrazione finale di 100 nanogrammi per microlitro.E conservare a meno 80 gradi Celsius in piccole aliquote. Aggiungere tre microlitri da 100 nanogrammi per microlitro di K-bZIP marcato purificato nella reazione master mix SUMOilazione in vitro. Quindi mescolare delicatamente il contenuto della miscela master e incubare a 30 gradi Celsius per tre ore.Quindi, aggiungere 20 microlitri di pagina SDS 2X con tampone di caricamento per fermare la reazione. Quindi riscaldare i campioni a 95 gradi Celsius per cinque minuti per denaturare la proteina. Quindi, caricare 20 microlitri di campione su un gel per pagine SDS al 10%.E fai scorrere il gel a 80 volt per circa 120 minuti fino a quando il colorante raggiunge il fondo del gel. Una volta terminata l'elettroparesi, scollegare l'apparecchio in gel. E trasferire il gel nel tampone di trasferimento semi-secco per cinque minuti.Quindi immergere la membrana in PVDF in un altro contenitore riempito di metanolo per un minuto. Rimuovere la membrana in PVDF dal metanolo e immergerla in un tampone di trasferimento semi-secco. Quindi agitare delicatamente la membrana per cinque minuti.Rimuovere il coperchio di sicurezza dell'apparecchio elettroforetico semisecco. Pre-bagnare una carta da filtro. E prepara un sandwich di gel sul fondo dell'anodo di platino.Dopo aver fissato la piastra catodica nel coperchio di sicurezza, far funzionare il blot a 15 volt di corrente costante per 90 minuti. Quindi spegnere l'alimentazione ed estrarre la membrana in PVDF dopo aver scollegato l'apparecchio semisecco. Bloccare ora la membrana in PVDF con tampone di blocco per un'ora a temperatura ambiente su un agitatore orbitale a 30 giri al minuto.Successivamente, ibridare la membrana PVDF con l'anticorpo anti-p53 e il tampone bloccante per 12-16 ore a quattro gradi Celsius su un miscelatore in sospensione a 30 giri al minuto. Quindi estrarre la membrana in PVDF e trasferirla in un contenitore riempito con soluzione salina tamponata con Tris tween 20. Quindi, immergere la membrana PVDF in soluzione salina tamponata Tris 20 per 30 minuti sull'agitatore orbitale a 45 giri al minuto.Quindi ibridare la membrana PVDF con anticorpo anti-coniglio coniugato con perossidasi di rafano diluito in tampone bloccante per un'ora a temperatura ambiente sul miscelatore in sospensione a 30 giri al minuto. Successivamente, lavare la membrana PVDF con soluzione salina tamponata con Tris per 20 tre volte. Dopo il lavaggio, immergere la membrana PVDF in soluzione salina tamponata con Tris 20 per 30 minuti sul miscelatore in sospensione a 45 giri al minuto.Quindi sostituire la soluzione salina tamponata con Tris tween 20 con soluzione fisiologica tamponata con fosfato. Per preservare la membrana in PVDF a quattro gradi Celsius per un massimo di 12 ore. Quindi, mescolare i reagenti del substrato chemiluminescente potenziato uno e due in un rapporto uno a uno.Quindi rimuovere la membrana in PVDF dalla soluzione salina tamponata con fosfato e tamponare brevemente con le tasche del punzone per assorbire l'umidità in eccesso. Aggiungere immediatamente 400 microlitri di reagente chemiluminescente sulla superficie della membrana e attendere da tre a cinque minuti. Tamponare brevemente per drenare il reagente chemiluminescente in eccesso, evitando che la membrana si asciughi completamente.Usa il sistema di imaging di Luminescente per esporre il blot. Qui è stata eseguita l'analisi dell'immuno blot per mostrare la concentrazione dell'enzima Ubc9 necessaria per SUMOylate i bersagli di p53. Ciò dimostra che 1/2 e 1/5 della concentrazione dell'enzima Ubc9 possono sufficientemente SUMOilare l'enzima p53 in un saggio di SUMOilazione in vitro utilizzando i peptidi SUMO 1 e SUMO 2.Per analizzare la p53 SUMOilata la membrana è stata sondata con anticorpi anti-p53. Un'analisi immuno blot simile è stata eseguita per dimostrare che metà della concentrazione E1 e 1/10 degli enzimi Ubc9 sono necessari per SUMOilare il bersaglio p53 in un saggio di SUMOilazione in vitro utilizzando i peptidi SUMO 1, SUMO 2 e SUMO 3. Qui la membrana è stata colorata con Coomassie per mostrare la proteina K-bZIP purificata.Il sistema di espressione del baculovirus è stato utilizzato per esprimere il K-bZIP purificato che è stato analizzato sulla pagina SDS con albumina sierica bovina come standard per il confronto. Sono state inoltre eseguite ulteriori analisi immuno blot che hanno dimostrato che, aumentando la concentrazione di K-bZIP, catalizza la SUMOilazione di p53 in presenza rispettivamente di metà della quantità di E1 e di 1/10 della quantità di enzimi Ubc9. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in quattro ore se eseguita correttamente.Durante il tentativo di questa procedura è importante ricordarsi di tenere tutto il reagente per il saggio di SUMOilazione in vitro su ghiaccio e di eseguire la diluizione in serie piuttosto che in un'unica diluizione gigante. Trova questa procedura e altri metodi come la sovraespressione della SUMOligasi possono essere eseguiti per verificare la SUMOilazione in vitro. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della SUMOilazione per esplorare più SUMOligasi e convalidare il loro potere di specificità.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come identificare una ligasi SUMO e3 utilizzando un saggio di simulazione in vitro.

in-vitro-sumoylation-assay-to-study-sumo-e3-ligase-activity

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Questo video dimostra il metodo in vitro per la SUMOilazione delle proteine del substrato utilizzando una cascata enzimatica sequenziale. Inoltre, lo stato SUMOilato della proteina viene identificato utilizzando l'elettroforesi e la tecnica dell'immunoblotting.

Saggio di SUMOilazione: una tecnica in vitro per rilevare lo stato di SUMOilazione delle proteine del substrato mediante immunoblotting

Questo manoscritto descrive la rilevazione di sumoilazione e ubiquitinazione delle proteine ​​cinetocore, Ndc10 e Ndc80, nel lievito Saccharomyces cerevisiae erba.

Purificazione delle proteine ​​tecnica che permette la rilevazione di sumoilazione e Ubiquitinazione di lievito in erba cinetocore proteine ​​Ndc10 e Ndc80

Proteine della famiglia piccolo ubiquitina-relativo modificatore (SUMO) sono coniugati ai residui di lisina delle proteine bersaglio per regolare i vari processi cellulari. Questo articolo descrive un protocollo per la rilevazione della proteina del retinoblastoma (Rb) sumoilazione in condizioni endogene ed esogene in cellule umane.

In Vivo Rilevamento e analisi di Rb sumoilazione di proteine in cellule umane

Il SUMO è una proteina modificatoria di tipo ubiquitina, essenziale e altamente conservata. In questo protocollo stiamo descrivendo l'uso di una proteina di SUMO-trapping ricombinante tollerante allo stress (kmUTAG) per visualizzare i coniugati SUMO nativi e senza tag e la loro localizzazione in una varietà di tipi di cellule.

Localizzazione delle proteine di SUMO-modificate utilizzando proteine di cattura di Sumo fluorescente

Qui, presentiamo un protocollo per arricchire, isolare, identificare e caratterizzare le proteine modificate da SUMO in vivo sia da cellule umano di epatoma e tumori del fegato ottenuti da modelli murini di carcinoma epatocellulare utilizzando entità leganti SUMO (SUBE).

Entità DI legame SUMO (SUBE) come strumenti per l'arricchimento, l'isolamento, l'identificazione e la caratterizzazione del proteoma SUMO nel cancro al fegato

L'obiettivo di questo manoscritto è quello di presentare un profilo per gli studi biochimici e funzionali completi dei legamenti dell'ubiquitina E3 di tipo RING. Questa pipeline multifase, con protocolli dettagliati, convalida un'attività enzimatica della proteina testata e dimostra come collegare l'attività alla funzione.

Caratterizzazione funzionale di RING-Type E3 Ubiquitin Ligases In Vitro e In Planta

Il presente studio fornisce protocolli dettagliati di test di ubiquitilazione in vitro per l'analisi dell'attività catalitica dell'ubiquitina ligasi E3. Le proteine ricombinanti sono state espresse utilizzando sistemi procariotici come la coltura di Escherichia coli.

In vitro Analisi della funzione E3 Ubiquitina ligasi

Forniamo un protocollo dettagliato per un test di ubiquitilazione di un substrato specifico e un'ubiquitina-ligasi E3 in cellule di mammifero. Le linee cellulari HEK293T sono state utilizzate per la sovraespressione proteica, il substrato poliubiquitilato è stato purificato dai lisati cellulari mediante immunoprecipitazione e risolto in SDS-PAGE. L'immunoblotting è stato utilizzato per visualizzare questa modifica post-traduzionale.

Valutazione dell'ubiquitilazione del substrato mediante ubiquitina-ligasi E3 nei lisati a cellule di mammifero

Il presente protocollo evidenzia un metodo modificato per rilevare e quantificare i legami incrociati DNA-proteina (DPC) e le loro modificazioni post-traduzionali (PTM), tra cui l'ubiquitilazione, la SUMOilazione e l'ADP-ribosilazione indotte da inibitori della topoisomerasi e dalla formaldeide, consentendo così lo studio della formazione e della riparazione delle DPC e dei loro PTM.

Rilevazione quantitativa dei legami incrociati DNA-proteina e delle loro modificazioni post-traduzionali

L'ubiquitinazione è un regolatore critico delle funzioni intracellulari delle proteine. Qui descriviamo due metodi di lisi cellulare per rilevare i livelli di ubiquitinazione delle proteine del substrato nelle cellule dei mammiferi e confrontiamo la loro efficacia nell'analisi dei livelli di ubiquitinazione. La sovraespressione proteica nelle cellule di HEK293T è stata indotta tramite trasfezione transitoria, mentre proteine ubiquitinate sono state rilevate tramite analisi western blot.

Strategie comparative per il rilevamento dell'ubiquitinazione nei lisati cellulari di mammiferi utilizzando SMAD2/SMURF2 come modello

Questo protocollo descrive un metodo per ubiquitinare Streptococcus pneumoniae utilizzando lisato cellulare di mammifero o complesso enzimatico puro ubiquidina, seguito da un trattamento con complesso proteico purificato VCP/p97-UFD1-NPLOC4 per valutarne l'attività batteriolitica, consentendo lo studio degli effettori immunitari dipendenti da ubiquidina.

In-vitro Ricostituzione dell'ubiquitinazione batterica ed eliminazione mediata da VCP/p97

Impara un saggio di SUMOilazione in vitro per identificare nuove ligasi E3 SUMO e studiarne la specificità verso diversi isoformi SUMO. Questo metodo avanzato consente di analizzare la modificazione post-traduzionale delle proteine.

In Vitro Saggio di SUMOilazione per studiare l'attività E3 ligasi SUMO

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