In Vitro Saggio di SUMOilazione per studiare l'attività E3 ligasi SUMO

L'obiettivo generale di questo esperimento è quello di verificare una proteina di interesse che può essere SUMOilata o è una SUMO E3 ligasi. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della SUMOilazione, come l'identificazione della ligasi SUMO E3. Il vantaggio principale di questa tecnica è che potrebbe essere utilizzata per lo studio della specificità della ligasi SUMO E3 verso diverse forme iso di SUMO.

A dimostrare la procedura sarà Wan-Shan Young, uno studente di dottorato del mio laboratorio. Per purificare il tag K-bZIP, incubare prima 10 millilitri di lisato cellulare con 50 microlitri di microsfere magnetiche marcate con anticorpi in una provetta di polipropilene da 14 millilitri. Quindi ruotare il tubo a 50 giri al minuto a quattro gradi Celsius per tre ore in un miscelatore a sospensione.

Una volta catturata la proteina, centrifugare il campione a 800 volte g per 30 secondi a quattro gradi Celsius per pellettare le perline. Scartare tutto tranne un millilitro di surnatante per risospendere le perline. E trasferire le perle disciolte in un tubo da 1,5 millilitri.

Per lavare le proteine catturate, posizionare il tubo con le perle su un supporto magnetico. Attendere circa tre secondi affinché le perle aderiscano alle pareti laterali del tubo e quindi rimuovere il surnatante. Per lavare le perle, aggiungere un millilitro di tampone di lisi nel tubo da 1,5 millilitri.

Quindi capovolgere il tubo dieci volte. Successivamente, posizionare il tubo da 1,5 millilitri sul supporto magnetico e rimuovere il surnatante una volta che le perle aderiscono alle pareti. Per lavare nuovamente le perle, aggiungere un millilitro di soluzione salina tamponata con fosfato al tubo da 1,5 millilitri e capovolgerlo dieci volte.

Quindi trasferire il tubo nel supporto magnetico e rimuovere il surnatante una volta che le perline si sono attaccate alle pareti laterali. Per eluire le proteine marcate con K-bZIP dalle biglie magnetiche marcate con anticorpi, aggiungere 100 microlitri a 150 microgrammi per millilitro di octapeptide diluito in soluzione salina tamponata con fosfato nella provetta da 1,5 millilitri. Quindi ruotare il tubo su un miscelatore a sospensione a 50 giri al minuto per dieci minuti a temperatura ambiente.

Trasferire il tubo sul supporto magnetico. E poi raccogli il K-bZIP contenente surnatante. Successivamente, per analizzare il tag K-bZIP purificato, sottoporre da uno a cinque microlitri della proteina purificata alla pagina SDS, seguita dalla colorazione blu di Coomassie.

Caricare 0,5, 1 e 2 microgrammi di albumina sierica bovina come standard sul gel per quantificare la concentrazione di K-bZIP. Durante l'elaborazione dell'immagine sull'immagine J.Successivamente, diluire il K-bZIP purificato in soluzione salina tamponata con fosfato. Raggiungere una concentrazione finale di 100 nanogrammi per microlitro.

E conservare a meno 80 gradi Celsius in piccole aliquote. Aggiungere tre microlitri da 100 nanogrammi per microlitro di K-bZIP marcato purificato nella reazione master mix SUMOilazione in vitro. Quindi mescolare delicatamente il contenuto della miscela master e incubare a 30 gradi Celsius per tre ore.

Quindi, aggiungere 20 microlitri di pagina SDS 2X con tampone di caricamento per fermare la reazione. Quindi riscaldare i campioni a 95 gradi Celsius per cinque minuti per denaturare la proteina. Quindi, caricare 20 microlitri di campione su un gel per pagine SDS al 10%.

E fai scorrere il gel a 80 volt per circa 120 minuti fino a quando il colorante raggiunge il fondo del gel. Una volta terminata l'elettroparesi, scollegare l'apparecchio in gel. E trasferire il gel nel tampone di trasferimento semi-secco per cinque minuti.

Quindi immergere la membrana in PVDF in un altro contenitore riempito di metanolo per un minuto. Rimuovere la membrana in PVDF dal metanolo e immergerla in un tampone di trasferimento semi-secco. Quindi agitare delicatamente la membrana per cinque minuti.

Rimuovere il coperchio di sicurezza dell'apparecchio elettroforetico semisecco. Pre-bagnare una carta da filtro. E prepara un sandwich di gel sul fondo dell'anodo di platino.

Dopo aver fissato la piastra catodica nel coperchio di sicurezza, far funzionare il blot a 15 volt di corrente costante per 90 minuti. Quindi spegnere l'alimentazione ed estrarre la membrana in PVDF dopo aver scollegato l'apparecchio semisecco. Bloccare ora la membrana in PVDF con tampone di blocco per un'ora a temperatura ambiente su un agitatore orbitale a 30 giri al minuto.

Successivamente, ibridare la membrana PVDF con l'anticorpo anti-p53 e il tampone bloccante per 12-16 ore a quattro gradi Celsius su un miscelatore in sospensione a 30 giri al minuto. Quindi estrarre la membrana in PVDF e trasferirla in un contenitore riempito con soluzione salina tamponata con Tris tween 20. Quindi, immergere la membrana PVDF in soluzione salina tamponata Tris 20 per 30 minuti sull'agitatore orbitale a 45 giri al minuto.

Quindi ibridare la membrana PVDF con anticorpo anti-coniglio coniugato con perossidasi di rafano diluito in tampone bloccante per un'ora a temperatura ambiente sul miscelatore in sospensione a 30 giri al minuto. Successivamente, lavare la membrana PVDF con soluzione salina tamponata con Tris per 20 tre volte. Dopo il lavaggio, immergere la membrana PVDF in soluzione salina tamponata con Tris 20 per 30 minuti sul miscelatore in sospensione a 45 giri al minuto.

Quindi sostituire la soluzione salina tamponata con Tris tween 20 con soluzione fisiologica tamponata con fosfato. Per preservare la membrana in PVDF a quattro gradi Celsius per un massimo di 12 ore. Quindi, mescolare i reagenti del substrato chemiluminescente potenziato uno e due in un rapporto uno a uno.

Quindi rimuovere la membrana in PVDF dalla soluzione salina tamponata con fosfato e tamponare brevemente con le tasche del punzone per assorbire l'umidità in eccesso. Aggiungere immediatamente 400 microlitri di reagente chemiluminescente sulla superficie della membrana e attendere da tre a cinque minuti. Tamponare brevemente per drenare il reagente chemiluminescente in eccesso, evitando che la membrana si asciughi completamente.

Usa il sistema di imaging di Luminescente per esporre il blot. Qui è stata eseguita l'analisi dell'immuno blot per mostrare la concentrazione dell'enzima Ubc9 necessaria per SUMOylate i bersagli di p53. Ciò dimostra che 1/2 e 1/5 della concentrazione dell'enzima Ubc9 possono sufficientemente SUMOilare l'enzima p53 in un saggio di SUMOilazione in vitro utilizzando i peptidi SUMO 1 e SUMO 2.

Per analizzare la p53 SUMOilata la membrana è stata sondata con anticorpi anti-p53. Un'analisi immuno blot simile è stata eseguita per dimostrare che metà della concentrazione E1 e 1/10 degli enzimi Ubc9 sono necessari per SUMOilare il bersaglio p53 in un saggio di SUMOilazione in vitro utilizzando i peptidi SUMO 1, SUMO 2 e SUMO 3. Qui la membrana è stata colorata con Coomassie per mostrare la proteina K-bZIP purificata.

Il sistema di espressione del baculovirus è stato utilizzato per esprimere il K-bZIP purificato che è stato analizzato sulla pagina SDS con albumina sierica bovina come standard per il confronto. Sono state inoltre eseguite ulteriori analisi immuno blot che hanno dimostrato che, aumentando la concentrazione di K-bZIP, catalizza la SUMOilazione di p53 in presenza rispettivamente di metà della quantità di E1 e di 1/10 della quantità di enzimi Ubc9. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in quattro ore se eseguita correttamente.

Durante il tentativo di questa procedura è importante ricordarsi di tenere tutto il reagente per il saggio di SUMOilazione in vitro su ghiaccio e di eseguire la diluizione in serie piuttosto che in un'unica diluizione gigante. Trova questa procedura e altri metodi come la sovraespressione della SUMOligasi possono essere eseguiti per verificare la SUMOilazione in vitro. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della SUMOilazione per esplorare più SUMOligasi e convalidare il loro potere di specificità.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come identificare una ligasi SUMO e3 utilizzando un saggio di simulazione in vitro.