Un romanzo In Vitro Live-imaging dosaggio del Astrocyte-mediata fagocitosi utilizzando pH indicatore-coniugato sinaptosomi

Questo protocollo presenta un in vitro live-imaging test di fagocitosi per misurare la capacità fagocitica dei astrocytes. Microglia e astrociti di ratto purificati vengono utilizzati insieme a sinaptosomi coniugato con indicatore di pH. Questo metodo in grado di rilevare in tempo reale engulfment e degradazione cinetica e fornisce una piattaforma di screening adatto per identificare i fattori che influenzano la fagocitosi di astrociti.

L'obiettivo generale di questo esperimento è quello di rilevare in tempo reale la cinetica di inghiottimento e degradazione di cellule gliali, come astrociti e microglia, attraverso l'imaging in vitro della fagocitosi di sinaptosomi coniugati con indicatore di pH. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle neuroscienze, come ad esempio come viene regolata la fagocitosi delle cellule gliali nei cervelli sani e malati. Il vantaggio principale di questa tecnica è che possiamo monitorare e analizzare efficacemente la cinetica fagocitaria in tempo reale delle cellule gliali attraverso l'imaging dal vivo di cellule coltivate in vitro.

Questo metodo può essere utilizzato anche per lo screening di fattori e composti che regolano la capacità di inghiottimento e degradazione delle cellule gliali. Iniziare centrifugando i campioni di sinaptosoma scongelati per tre o quattro minuti a 21.092 G e quattro gradi Celsius. Dopo aver aspirato i surnatanti, risospendere i pellet in 200 microlitri di carbonato di sodio molare 0,1 per provetta, aggiungendo due microlitri di indicatore di pH a ciascun campione dopo che sono stati accuratamente miscelati.

Dopo un leggero vortice, proteggere le soluzioni dalla luce con coperture di alluminio e posizionare i campioni in un agitatore a rotazione con leggera agitazione per due ore a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione, aggiungere un millilitro di PBS di Dulbecco, o DPBS, e raccogliere i sinaptosomi per centrifugazione, rimettendo in sospensione il pellet in un millilitro di DPBS fresco per lavaggio. Dopo l'ultima centrifugazione, risospendere il pellet di sinaptosoma non funzionante in 200 microlitri di DPBS integrati con DMSO al 5%.

Per l'imaging dal vivo dell'inghiottimento del sinaptosoma, rimuovere prima il surnatante da ciascun pozzetto di una coltura di astrociti confluenti e lavare rapidamente le cellule tre volte con un millilitro di DPBS per lavaggio. Dopo l'ultimo lavaggio, aggiungere 300 microlitri di terreno basico per astrociti immunopannati e cinque microlitri di sinaptosomi coniugati con indicatore di pH, oltre a qualsiasi fattore aggiuntivo in grado di modulare la fagocitosi delle cellule gliali. Lasciare che i sinaptosomi si depositino sul fondo dei pozzetti e si attacchino ai recettori della fosfatidilserina sugli astrociti a 37 gradi Celsius e al 5% di Co2.

Dopo 40 minuti, scartare i surnatanti e lavare rapidamente ma delicatamente i pozzetti tre volte con un millilitro di DPBS per lavaggio. Dopo l'ultimo lavaggio, aggiungere 500 microlitri di terreno fresco integrato con i fattori di interesse ai pozzetti appropriati e trasferire la piastra in uno strumento di imaging dal vivo. Selezionare le posizioni dell'imaging, regolare la messa a fuoco, il tempo di esposizione, la luminosità e la potenza del LED e impostare il formato dell'immagine, l'intervallo di tempo e il numero totale di cicli per l'imaging dal vivo come appropriato sperimentalmente.

Quindi, inizia l'imaging dal vivo degli esperimenti di fagocitosi. Al punto finale sperimentale appropriato, aprire un programma di analisi delle immagini e importare la sequenza di immagini time lapse. Converti le immagini in scala di grigi a 8 bit e avvia una sottrazione dello sfondo con un raggio della barra di rotolamento di 50 pixel.

Quindi, apri il plug-in Time Series Analyzer V3 e trascina l'area di interesse nel plug-in. Nella regione di gestione degli interessi, fai clic su Aggiungi. Nel plug-in Time Series V3 fare clic su Ottieni intensità totale.

Quindi, salva i risultati e integra i dati. Dopo la loro preparazione, i sinaptosomi esprimono fosfatidilserina sulle loro membrane esterne, suggerendo una perdita di funzione, e che può essere riconosciuta dai recettori della fosfatidilserina sugli astrociti e sulla microglia. Quando i sinaptosomi coniugati con indicatore di pH vengono fagocitati, emettono fluorescenti rosso vivo.

Per quantificare la fagocitosi delle cellule gliali, è possibile misurare l'area del segnale di fluorescenza rossa, o indice fagocitico. Sebbene gli astrociti siano efficienti nel fagocitare un gran numero di sinaptosomi coniugati con indicatore di pH, le microglia sono più veloci nell'inghiottire e degradare i sinaptosomi. È interessante notare che i fattori secreti dagli astrociti, che sono contenuti nel mezzo condizionato dagli astrociti, sono essenziali per aumentare la fagocitosi mediata sia dagli astrociti che dalla microglia.

Inoltre, gli astrociti knockout MEGF10 di topo hanno dimostrato una capacità fagocitaria significativamente compromessa rispetto alle cellule wild type. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo delle neuroscienze e della biologia delle cellule gliali per esplorare i meccanismi coinvolti nella modulazione della fagocitosi delle cellule gliali come potenziale metodo per il trattamento di vari disturbi neurologici.