Name: Un romanzo In Vitro Live-imaging dosaggio del Astrocyte-mediata fagocitosi utilizzando pH indicatore-coniugato sinaptosomi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-05T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 43 s
Description: Scopri un saggio di fagocitosi con live-imaging in vitro per misurare la capacità fagocitaria degli astrociti utilizzando sinaptosomi coniugati a indicatore di pH. Questo metodo consente di analizzare le cinetiche di inglobamento e degradazione in tempo reale.

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Gli autori ringraziano Jung Yeon-Joo per il suo sostegno sperimentale durante la purificazione di synaptosome e Jungjoo Park per le immagini degli synaptosomes con esposizione di PS. Inoltre, ringraziamo tutti i membri nel laboratorio di Chung per utile discussione. Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Research Foundation di sovvenzione di Corea (NRF) finanziata dal governo coreano (MSIP) (NRF-2016M3C7A1905391 e NRF-2016R1C1B3006969) (W.-S. C).

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<li>Allen, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte+glypicans+4+and+6+promote+formation+of+excitatory+synapses+via+GluA1+AMPA+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Astrocyte glypicans 4 and 6 promote formation of excitatory synapses via GluA1 AMPA receptors.</a> Nature. 486 (7403), 410-414 (2012).</li>
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<li>Sekar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schizophrenia+risk+from+complex+variation+of+complement+component+4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Schizophrenia risk from complex variation of complement component 4.</a> Nature. 530 (7589), 177-183 (2016).</li>
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<li>Chung, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+allele-dependent+role+for+APOE+in+controlling+the+rate+of+synapse+pruning+by+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Novel allele-dependent role for APOE in controlling the rate of synapse pruning by astrocytes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (36), 10186-10191 (2016).</li>
<li>Purice, M. D., Speese, S. D., Logan, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delayed+glial+clearance+of+degenerating+axons+in+aged+Drosophila+is+due+to+reduced+PI3K%2FDraper+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Delayed glial clearance of degenerating axons in aged Drosophila is due to reduced PI3K/Draper activity.</a> Nat Commun. 7, 12871(2016).</li>
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<li>Xiao, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+astrocytic+lysosome+biogenesis+facilitates+Abeta+clearance+and+attenuates+amyloid+plaque+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Enhancing astrocytic lysosome biogenesis facilitates Abeta clearance and attenuates amyloid plaque pathogenesis.</a> J Neurosci. 34 (29), 9607-9620 (2014).</li>
<li>Lu, T. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axon+degeneration+induces+glial+responses+through+Draper-TRAF4-JNK+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Axon degeneration induces glial responses through Draper-TRAF4-JNK signalling.</a> Nat Commun. 8, 14355(2017).</li>
<li>Dunkley, P. R., Jarvie, P. E., Robinson, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+Percoll+gradient+procedure+for+preparation+of+synaptosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">A rapid Percoll gradient procedure for preparation of synaptosomes.</a> Nat Protoc. 3 (11), 1718-1728 (2008).</li>
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<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> J Vis Exp. (65), (2012).</li>
<li>Cahoy, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transcriptome+database+for+astrocytes%2C+neurons%2C+and+oligodendrocytes%3A+a+new+resource+for+understanding+brain+development+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A transcriptome database for astrocytes, neurons, and oligodendrocytes: a new resource for understanding brain development and function.</a> J Neurosci. 28 (1), 264-278 (2008).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

In questo articolo, presentiamo metodi per un lungo termine test di fagocitosi live-imaging in vitro utilizzando cellule gliale purificate e sinaptosomi coniugato con indicatore di pH. Indichiamo che confrontato con microglia, astrociti possiedono diverse capacità engulfment e degradazione durante la fagocitosi dei sinaptosomi. Inoltre, i nostri dati suggeriscono che fattori Astrocita-secreto, che contengono molecole passerella come GAS6, proteine e MEGE8, sono essenziali per efficiente fagocitosi di PS-dipenden...

Le cellule gliali, che si riferiscono alle cellule non eccitabili nel cervello, sono il tipo principali delle cellule nel sistema nervoso centrale (SNC). In precedenza, le cellule glial erano considerate come semplici cellule di supporto che principalmente giocano un ruolo passivo nel mantenimento della sopravvivenza neuronale e sinaptica basale proprietà. Tuttavia, la prova emergente ha rivelato che le cellule gliali svolgono i ruoli più attivi in vari aspetti della neurobiologia, quali il mantenimento dell'omeostasi del cervello, mediando sinapsi formazione1,2,3 e sinapsi eliminazione4,5e modulante plasticità sinaptica6,7. Astrociti, microglia ed oligodendrociti sono cellule gliali del SNC. Tra queste cellule, astrociti e microglia hanno dimostrato di svolgere ruoli fagocitici inghiottendo sinapsi4,5, di cellule apoptotiche8, detriti neurali9e proteine patogene, quali amiloide beta le piastre10,11. Nel cervello in via di sviluppo, gli astrociti eliminano sinapsi nel nucleo genicolato laterale dorsale (missilistico) attraverso fagocitosi di MERTK - e MEGF10-dipendente4. Allo stesso modo, le microglia eliminano anche rivestite con C1q sinapsi durante fasi di sviluppo attraverso il classico del complemento cascata5. Interessante, è stato suggerito che i difetti in potatura sinapsi possono essere uno degli iniziatori di parecchi disordini neurologici. Ad esempio, è stato indicato che le mutazioni nel componente del complemento 4 (C4), che aumenta la potatura sinapsi complemento-mediata da microglia, sono fortemente associate con la prevalenza della schizofrenia negli esseri umani12. Una carta recente inoltre ha dimostrato che la via classica del complemento è iperattivata nelle fasi di iniziazione dell'annuncio e induce la perdita di sinapsi iniziale in questa malattia13.
Confrontato con la fagocitosi mediata da microglia, se fagocitosi mediata Astrocita contribuiscono all'avvio e alla progressione di vari disturbi neurologici è meno chiaro. Tuttavia, un recente documento suggerisce che fattori che alterano il tasso di potatura normale sinapsi dai astrocytes possono interferire con l'omeostasi del cervello e contribuiscono alla suscettibilità e patologia DC14. Il tasso di potatura di sinapsi dai astrocytes potentemente è controllato dagli isomeri di ApoE , con un allele protettivo per annuncio (ApoE2) migliorando fortemente il tasso e un allele di rischio per l'annuncio (ApoE4) abbassando significativamente il tasso. Inoltre, topi transgenici che esprimono ApoE4 accumulato C1q sinaptica molto di più rispetto a controllo o ApoE2 topi14. Questi dati suggeriscono che alterata fagocitosi Astrocita-mediata nei primi cervello dell'annuncio può indurre l'accumulo di detriti senescenti rivestite con C1q sinapsi/sinaptica che attiva la fagocitosi microglial complemento-mediata, degenerazione sinaptica di guida . L'alterata capacità fagocitica dei astrocytes nei portatori ApoE4 può anche contribuire all'accumulo incontrollato delle placche di beta amiloide nel cervello colpite AD.
Inoltre, esso ha dimostrato che le cellule gliali nel cervello invecchiato Drosophila perdono la loro capacità fagocitica grazie alla traduzione in diminuzione di Draper, un omologo di Megf10 che gli astrociti utilizzano per phagocytosing sinapsi. Il ristabilimento dei livelli di Draper salvato la capacità fagocitica delle cellule gliali, che efficacemente ha eliminato detriti axonal danneggiati nel cervello invecchiato in simile misura come quello nel cervello giovane, che indica che invecchiamento indotto da alterazioni nella capacità fagocitica di gli astrociti possono contribuire alla rottura del cervello omeostasi15.
Basato su queste nuove scoperte, modulando la capacità fagocitica dei astrocytes può essere una strategia terapeutica attraente per prevenire e curare vari disturbi neurologici. A questo proposito, ci sono stati diversi tentativi per migliorare la capacità fagocitica dei astrocytes, ad esempio, inducendo l'acidificazione dei lisosomi con nanoparticelle acide16 e che overexpressing EB (IL2RG), che può migliorare il fattore di trascrizione lisosoma biogenesi17. Nonostante questi tentativi, non è ancora chiaro come astrociti e microglia differenze nella loro cinetica fagocitica e se dovremmo aumentare o diminuire la loro capacità fagocitica in varie malattie.
In questa carta, presentiamo un'analisi novella in vitro per la rilevazione della capacità fagocitica dei astrocytes in tempo reale. I dati mostrano diversa cinetica di engulfment e degradazione in astrociti e microglia. Astrocita-condizionato mezzo (ACM), che contiene fattori secreti dagli astrociti, è essenziale per la fagocitosi efficace di astrociti e microglia. Inoltre, Megf10, un recettore fagocitico in astrocytes e un omologo di Ced-1 e Draper, gioca ruoli critici nella fagocitosi mediata Astrocita8,18.

<table><tbody><tr><td>Purificazione dei sinaptosomi</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE healthcare life sciences</td><td>17-0891-01</td><td></td></tr><tr><td>Quick Start Bradford Protein Assay Kit 2</td><td>BIO-RAD</td><td>5000202</td><td></td></tr><tr><td>Coniugazione dell'indicatore di pH</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dimetil solfossido (DMSO)</td><td>Soluzione LPS</td><td></td><td></td>DMSO100</tr><tr><td>rosso pHrodo, estere succinimidilico</td><td>Sonde Molecula</td><td>P36600</td><td></td></tr><tr><td>Immunopanning</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10X Earle' s soluzione salina bilanciata (EBSS)</td><td>Sigma</td><td>E7510</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina</td><td>Bovogen</td><td>BSA025</td><td></td></tr><tr><td>Deossirebonucleasi 1 (DNasi)</td><td>Worthington</td><td>Is002007</td><td></td></tr><tr><td>(DMEM)</td><td>Gibco</td><td>11960-044</td><td></td></tr><tr><td>(dPBS)</td><td>Welgene</td><td>LB001-02</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>Gibco</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Griffonia Simplicifolia Lectina (BSL-1)</td><td>Vector Labs</td><td>L-1100</td><td></td></tr><tr><td>IgG + IgM (H + L) anti-topo</td> di <td>capra</td><td>115-005-044</td><td></td></tr><tr><td>IgM (&mu;-catena) anti-topo di capra Jackson</td> <td>ImmunoResearch</td><td>115-005-020</td><td></td></tr><tr><td>Fattore di crescita epidermico legante l'eparina</td><td>Sigma</td><td>E4643</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo HepaCAM umano</td><td>R & Sistemi D</td><td>MAB4108</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo monoclonale integrina beta 5 (KN52)</td><td>eBioscience</td><td>14-0497-82</td><td></td></tr><tr><td>L-cisteina</td><td>Sigma</td><td>C7880</td><td></td></tr><tr><td>L-glutammato</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>N-acetly-L-citeina (NAC)</td><td>Sigma</td><td>A8199</td><td></td></tr><tr><td>Terreni neurobasali</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>O4 surnatante ibridoma (IgM di topo)</td><td>Bansal et al.23</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Papain</td><td>Worthington</td><td>Is003126</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina/streptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Pluristrainer 20 &mu; m</td><td>PluriSelect</td><td>43-50020-03</td><td></td></tr><tr><td>Poli-D-lisina</td><td>Sigma</td><td>P6407</td><td></td></tr><tr><td>Progesterone</td><td>Sigma</td><td>P8783</td><td></td></tr><tr><td>Putrescina dicloridrato</td><td>Sigma</td><td>P5780</td><td></td></tr><tr><td>Anti-topo di ratto purificato CD45</td><td>BD Pharmingen</td><td>550539</td><td></td></tr><tr><td>Topo purificato anti-ratto CD45</td><td>BD Pharmingen</td><td>554875</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato di sodio</td><td>Gibco</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>Selenito di sodio</td><td>Sigma</td><td>S5261</td><td></td></tr><tr><td>Transferrina</td><td>Sigma</td><td>T1147</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Sigma</td><td>T9935</td><td></td></tr><tr><td>Inibitore della tripsina</td><td>Worthington</td><td>LS003086</td><td></td></tr><tr><td>Tubo ultra-chiaro (tubo, a parete sottile, ultra-trasparente)</td><td>Beckman Coulter</td><td>344059</td><td></td></tr><tr><td>Collect IP-ACM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dispositivi centrifughi Macrosep Advance con membrana Omega (10k)</td><td>PALL</td><td>MAP010C37</td><td></td></tr><tr><td>Dispositivi centrifughi Macrosep Advance con membrana Omega (30k)</td><td>PALL</td><td>MAP030C37</td><td></td></tr><tr><td>Phagocytosis test di imaging dal vivo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Juli stage</td><td>Plugin NanoEntek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Time Series Analyzer V3</td><td>https://imagej.nih.gov/ij/plugins/time-series.html</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

un romanzo in vitro live-imaging dosaggio del astrocyte-mediata fagocitosi utilizzando ph indicatore-coniugato sinaptosomi

A Novel In Vitro Live-imaging Assay of Astrocyte-mediated Phagocytosis Using pH Indicator-conjugated Synaptosomes

Gli astrociti sono del tipo di cellule principali nel cervello e contattare direttamente le sinapsi e vasi sanguigni. Anche se le cellule microglial sono state considerate le principali cellule del sistema immunitario e fagociti solo nel cervello, recenti studi hanno dimostrato che gli astrociti anche partecipano a vari processi fagocitici, come eliminazione sinaptica inerente allo sviluppo e liquidazione dei placche di beta amiloide nel morbo di Alzheimer (annuncio). Nonostante questi risultati, l'efficienza di engulfment Astrocita e degradazione dei loro obiettivi è chiari rispetto a quello di microglia. Questa mancanza di informazioni è per lo più a causa della mancanza di un sistema di test in cui la cinetica della fagocitosi mediata da astrociti e microglia sono facilmente paragonabili. Per raggiungere questo obiettivo, abbiamo sviluppato un test a lungo termine live-imaging in vitro fagocitosi per valutare la capacità fagocitica di purificato astrociti e microglia. In questa analisi, rilevamento in tempo reale di engulfment e degradazione è possibile tramite sinaptosomi coniugato con indicatore di pH, che emettono fluorescenza rosso brillante in organelli acidi, come ad esempio i lisosomi. La nostra analisi novella fornisce rilevamento semplice ed efficace di fagocitosi attraverso live-imaging. Inoltre, questo test di fagocitosi in vitro utilizzabile come una piattaforma di screening per identificare le sostanze chimiche e composti che possono migliorare o inibire la capacità fagocitica dei astrocytes. Come disfunzione sinaptica potatura e accumulo di proteine patogene sono stati indicati per causare disturbi mentali o malattie neurodegenerative, prodotti chimici e composti che modulano la capacità fagocitica delle cellule glial dovrebbero essere utile nel trattamento di varie disturbi neurologici.

In questo in vitro test di fagocitosi con imaging di vivere a lungo termine, abbiamo usato sinaptosomi da omogenati di cervello di topo adulto, che sono stati separati nella soluzione gradiente tra soluzione gradiente 23% e 10% pendenza soluzione per ultracentrifugazione ( Figura 3). Dopo la preparazione, sinaptosomi esposti PS nella loro membrana esterna (Figura 4), suggerendo che hanno perso la loro funzione e potrebbe...

Questo protocollo presenta un in vitro live-imaging test di fagocitosi per misurare la capacità fagocitica dei astrocytes. Microglia e astrociti di ratto purificati vengono utilizzati insieme a sinaptosomi coniugato con indicatore di pH. Questo metodo in grado di rilevare in tempo reale engulfment e degradazione cinetica e fornisce una piattaforma di screening adatto per identificare i fattori che influenzano la fagocitosi di astrociti.

Un romanzo In Vitro Live-imaging dosaggio del Astrocyte-mediata fagocitosi utilizzando pH indicatore-coniugato sinaptosomi

Astrocytes are the major cell type in the brain and directly contact synapses and blood vessels. Although microglial cells have been considered the major ...

L'obiettivo generale di questo esperimento è quello di rilevare in tempo reale la cinetica di inghiottimento e degradazione di cellule gliali, come astrociti e microglia, attraverso l'imaging in vitro della fagocitosi di sinaptosomi coniugati con indicatore di pH. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle neuroscienze, come ad esempio come viene regolata la fagocitosi delle cellule gliali nei cervelli sani e malati. Il vantaggio principale di questa tecnica è che possiamo monitorare e analizzare efficacemente la cinetica fagocitaria in tempo reale delle cellule gliali attraverso l'imaging dal vivo di cellule coltivate in vitro.Questo metodo può essere utilizzato anche per lo screening di fattori e composti che regolano la capacità di inghiottimento e degradazione delle cellule gliali. Iniziare centrifugando i campioni di sinaptosoma scongelati per tre o quattro minuti a 21.092 G e quattro gradi Celsius. Dopo aver aspirato i surnatanti, risospendere i pellet in 200 microlitri di carbonato di sodio molare 0,1 per provetta, aggiungendo due microlitri di indicatore di pH a ciascun campione dopo che sono stati accuratamente miscelati.Dopo un leggero vortice

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Fonte: Funes, S., et. al., Cellule simili alla microglia umana: differenziazione da cellule staminali pluripotenti indotte e saggio di fagocitosi su cellule vive in vitro utilizzando sinaptosomi umani. J. Vis. Exp. (2022)Questo video mostra un test per studiare la capacità fagocitaria di cellule simili alla microglia utilizzando sinaptosomi marcati con coloranti fluorescenti sensibili al pH.

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Qui si descrive un adattamento dei protocolli usati per indurre plasticità omeostatica nei neuroni per lo studio della plasticità dei recettori accoppiati a proteina G astrociti. Utilizzati di recente per esaminare i cambiamenti nel gruppo astrociti I mGluRs nei topi giovani, il metodo può essere applicato per misurare il ridimensionamento di diversi GPCR astrocitiche, in tessuto dai topi adulti in situ e in vivo, e di ottenere un migliore apprezzamento della sensibilità dei recettori...

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fagocitosi microglia è fondamentale per il mantenimento della omeostasi tissutale e fagocitaria inadeguata è stato implicato nella patologia. Tuttavia, valutare la funzione microglia in vivo è tecnicamente impegnativo. Abbiamo sviluppato una tecnica semplice ma robusto per monitorare e quantificare il potenziale di fagocitosi microglia in un ambiente fisiologico preciso.

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Qui descriviamo un metodo in vitro di imaging dal vivo per visualizzare il trasporto intracellulare di organelli e il traffico di proteine della membrana plasmatica negli astrociti murini. Questo protocollo presenta anche una metodologia di analisi delle immagini per determinare gli itinerari e la cinetica nel trasporto merci.

Visualizzazione e analisi del trasporto intracellulare di organelli e di altri carichi in Astrociti

Le malattie neurodegenerative sono associate a funzioni microglia disregolate. Questo articolo delinea un test in vitro della fagocitosi delle cellule di neuroblastoma da parte dei macrofagi iPSC. Le lettura quantitative al microscopio sono descritte sia per l'imaging time-lapse a cellule vive che per l'imaging ad alto contenuto a cellule fisse.

Test di imaging quantitativo in vitro per la fagocitosi delle cellule morte del neuroblastoma da parte di iPSC-Macrophages

Questo protocollo descrive il processo di differenziazione delle cellule staminali pluripotenti indotte umane (iPSC) in cellule simili alle microglia per la sperimentazione in vitro . Includiamo anche una procedura dettagliata per generare sinaptosomi umani da motoneuroni inferiori derivati da iPSC che possono essere utilizzati come substrato per saggi di fagocitosi in vitro utilizzando sistemi di imaging di cellule vive.

Cellule simili alla microglia umana: differenziazione da cellule staminali pluripotenti indotte e saggio di fagocitosi di cellule vive in vitro utilizzando sinaptosomi umani

Qui presentiamo due protocolli per quantificare l'inghiottimento microgliale delle sinapsi vGLUT1-positive e dei sinaptosomi grezzi marcati con pHRodo Red utilizzando la citometria a flusso.

Quantificazione dell'inghiottimento microgliale di materiale sinaptico mediante citometria a flusso

Scopri un saggio di fagocitosi con live-imaging in vitro per misurare la capacità fagocitaria degli astrociti utilizzando sinaptosomi coniugati a indicatore di pH. Questo metodo consente di analizzare le cinetiche di inglobamento e degradazione in tempo reale.

Un romanzo In Vitro Live-imaging dosaggio del Astrocyte-mediata fagocitosi utilizzando pH indicatore-coniugato sinaptosomi

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