Utilizzando l'analisi filogenetica di indagare l'origine genica negli eucarioti
14 agosto 2018
È descritto un metodo per costruire un albero filogenetico basato su omologia di sequenza di dolci da eucarioti e SemiSWEETs da procarioti. L'analisi filogenetica è uno strumento utile per spiegare la parentela evolutiva tra proteine omologhe o geni da gruppi di organismi diversi.
Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo fitogenetico, come ad esempio come raccogliere sequenze e come selezionare il modello di calcolo corretto. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è molto facile da imparare. In generale, coloro che sono nuovi a questo metodo possono avere difficoltà semplicemente perché non sanno come gestire i dati a causa della mancanza di conoscenze di base dei principi e dei metodi della filogenesi.
Questo metodo è stato sviluppato per la prima volta quando abbiamo analizzato l'allineamento dei geni eucariotici SWEET. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto esiste una grande quantità di scelte e impostazioni per diversi aspetti dell'allineamento. Inizia questa procedura con la selezione di 35 proteine SWEET candidate da organismi eucariotici unicellulari come descritto nel protocollo di testo.
Allinea le 35 sequenze SWEET inserendole in Clustal Omega. Copia e incolla le sequenze proteiche in formato FASTA nella casella di input o carica un file di sequenza in formato FASTA. Specificare che si tratta di una sequenza di amminoacidi facendo clic sull'icona sotto il menu a discesa nella sezione del passaggio uno.
Se necessario, specificare il formato di output e altri parametri nella sezione del passaggio due. Per questo studio, impostare il formato di output come Clustal senza numero e lasciare gli altri parametri sulle impostazioni predefinite. Nella maggior parte dei casi, i parametri predefiniti funzionano bene senza alcuna specificazione.
Inviare ed eseguire l'allineamento nella sezione del passaggio tre. Potrebbero essere necessari da alcuni secondi a minuti prima che l'allineamento sia terminato. Nel pannello Riepilogo risultati, fare clic con il pulsante destro del mouse sul collegamento sotto l'allineamento in formato CLUSTAL e salvare le sequenze allineate come 35.clustal.
Per aprire il file dei risultati dell'allineamento in BioEdit, fare clic su Sequenza e selezionare Modifica stato d'animo nel primo menu a discesa del pannello principale di BioEdit. Quindi fare clic su Modifica residui nel sottomenu. Selezionate le sequenze sporgenti sul lato sinistro dell'allineamento con il cursore e fate clic sull'icona Elimina (Delete) nel menu Modifica (Edit) per rimuovere le sequenze selezionate.
Seleziona ed elimina le sequenze sul lato destro del primo dominio salivare MtN3 e salva le prime sequenze del dominio saliva MtN3 tagliate come 35-1.fas. Allo stesso modo, elimina le sequenze laterali sinistra e destra del secondo dominio salivare MtN3 e salvalo come 35-2.fas. La prima e la seconda sequenza del dominio salivare MtN3 possono essere previste in anticipo con il ritmo o TMHMM.
Apri il file 35-1. fas con MEGA e fai clic su Allinea quando richiesto. Nel menu Modifica, fai clic su Seleziona tutto.
Quindi fare clic su Seleziona sequenze. I nomi e le sequenze dei taxa saranno selezionati in nero. Scegliete Copia dal menu Modifica per copiare le sequenze negli Appunti e incollare le sequenze copiate in un file doc.
Nel file doc, sostituisci tutti i segni di cancelletto con il segno di maggiore di, quindi elimina tutti i caratteri non correlati per convertirli in formato FASTA. Aggiungi 1 alla fine di ogni nome di taxon per contrassegnarli come le prime sequenze del dominio salivare MtN3. Processare le seconde sequenze del dominio salivare MtN3 seguendo lo stesso metodo e aggiungerne 2 dopo ogni nome di taxon.
Ora combina la prima e la seconda sequenza del dominio salivare MtN3 in formato FASTA in un file doc. A tale scopo, caricare nuovamente le sequenze combinate in Clustal Omega e allineare le sequenze come prima. Salva il risultato come 35realigned.clustal.
Apri il file 35realigned. clustal in BioEdit. Elimina i residui di amminoacidi irregolari alle due estremità delle sequenze allineate e poi salva le sequenze come 35realigned.fas.
Fare clic su Sì quando viene visualizzato un avviso che indica che non è possibile salvare alcuni caratteri non standard. Aprire 35riallineato. fas in MEGA.
Fare clic sul menu Dati e scegliere Esporta allineamento. Quindi salvare l'allineamento in formato POP come 35. successivo per un uso successivo in RM Base.
Nel frattempo, fai clic sull'icona Modelli nel pannello principale di MEGA. Scegli Trova i migliori modelli di proteine del DNA e fai clic su OK nella finestra popup. Fare clic su Calcola per avviare il processo di ricerca del modello.
Si aprirà un nuovo pannello di avanzamento. Questo processo dura da alcuni minuti a diversi giorni a seconda della complessità delle sequenze caricate e delle prestazioni del computer. Una tabella che mostra i risultati si aprirà al termine del processo di ricerca del modello.
Il punteggio BIC più piccolo sarà elencato per primo, seguito da una serie di modelli diversi con punteggi BIC gradualmente crescenti. Il primo modello LG+G+F con il punteggio BIC più basso è il modello consigliato per l'albero ML basato sul 35realigned. file fas.
Quindi, fai clic sull'icona Filogenesi nel pannello principale di MEGA. Fare clic su Costruisci/Testa l'albero di massima verosimiglianza, quindi fare clic su Sì nel pannello a comparsa. Si aprirà una nuova finestra che mostra i diversi parametri che devono essere specificati.
Innanzitutto, imposta il valore di bootstrap nel test della scatola filogenesi. 500 o 1.000 è adeguato nella maggior parte dei casi. In Modello di sostituzione, scegli l'amminoacido come tipo di sostituzione.
Lo scopo della scelta di un modello di sostituzione è quello di stimare la vera differenza tra le sequenze in base ai loro stati attuali. Seleziona LG con modello Freqs nella casella Modello e metodo. Nella casella Tariffe e modelli, selezionare gamma distribuita per descrivere le variazioni di velocità tra i siti, ad esempio dando più peso alle modifiche nei siti in lenta evoluzione.
Nella casella Sottoinsieme di dati selezionare l'eliminazione completa per rimuovere tutte le colonne contenenti trattini. Mantieni tutti gli altri parametri nei loro stati predefiniti. Dopo aver specificato questi parametri, fare clic sull'icona Calcola per avviare il calcolo.
Al termine del calcolo con MEGA sarà presentato un albero ML filogenetico. Nel menu a discesa dell'icona File nel pannello Struttura, scegliere Salva sessione corrente per salvare il risultato. Nel presente studio, il risultato è stato salvato come 35.mas.
Nel pannello Albero, vengono visualizzati molti parametri tra cui la lunghezza del clade, lo stile dell'albero, la topologia dell'albero, il carattere del nome del taxon, la dimensione e il colore, e possono essere impostati su diverse opzioni. Salva il file dell'albero finale facendo clic sull'icona Immagine e salva la figura in diversi formati o copia l'immagine come fonte per il fotoritocco. Procedere con l'analisi della relazione tra SWEET e semiSWEET e utilizzando la costruzione dell'albero filogenetico di allineamento della sequenza con MR Base come dettagliato nel protocollo di testo.
Gli alberi filogenetici mostrano che tutti i primi domini di saliva MtN3 delle 35 sequenze SWEET si raggruppavano in un unico clade e i secondi domini di saliva MtN3 delle sequenze SWEET raggruppavano in un altro clade. Inoltre, i risultati dell'allineamento dei SWEET e dei semiSWEET mostrano che alcuni semiSWEET degli Alpha-Proteobacteria si sono allineati con il primo dominio salivare MtN3 delle sequenze SWEET, mentre i semiSWEET dei Methanobacteria si sono allineati con il secondo dominio salivare MtN3 delle sequenze SWEET. Questi risultati insieme suggeriscono che i due domini salivari MtN3 contenenti SWEET potrebbero essere derivati da una fusione evolutiva di un semiSWEET batterico e di un archeo.
Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in un'ora o diversi giorni a seconda della complessità dei dati. Durante il tentativo di questo protocollo, è importante raccogliere in anticipo sequenze di alta qualità. Dopo il suo sviluppo, questo protocollo ha aperto la strada ai ricercatori in evoluzione per esplorare le relazioni tra geni omologhi.
Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come costruire un albero filogenetico.
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Panoramica
Questo articolo descrive un metodo per la costruzione di un albero filogenetico basato sull'omologia di sequenza dei SWEET da eucarioti e dei SemiSWEET da procarioti. La tecnica è di facile utilizzo e aiuta a comprendere le relazioni evolutive tra proteine o geni omologhi.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Fitogenetica
- Evoluzione delle proteine
- Analisi delle sequenze
Sfondo
- L'analisi filogenetica aiuta a spiegare le relazioni evolutive.
- Comprendere le proteine SWEET e SemiSWEET è fondamentale per gli studi evolutivi.
- Chi si approccia per la prima volta potrebbe avere difficoltà nella gestione dei dati a causa della mancanza di conoscenze di base.
- Le dimostrazioni visive migliorano la comprensione del metodo.
Scopo dello studio
- Fornire una metodologia chiara per la costruzione di alberi filogenetici.
- Facilitare la selezione di modelli computazionali appropriati.
- Assistere i ricercatori nella raccolta e nell'analisi dei dati di sequenza.
Metodi Utilizzati
- Selezione di 35 proteine SWEET candidate da eucarioti unicellulari.
- Allineamento dei geni SWEET eucariotici.
- Utilizzo di diverse impostazioni per gli aspetti dell'allineamento.
- Dimostrazioni visive per guidare gli utenti attraverso il processo.
Risultati principali
- Il metodo semplifica il processo di analisi filogenetica.
- Fornisce un quadro per comprendere l'evoluzione delle proteine.
- Gli utenti possono gestire efficacemente i dati di sequenza con un'adeguata guida.
- Gli ausili visivi migliorano significativamente i risultati dell'apprendimento.
Conclusioni
- Questo metodo è accessibile per i ricercatori alle prime armi con la filogenetica.
- Colma il divario tra conoscenza teorica e applicazione pratica.
- Studi futuri possono basarsi su questa metodologia fondamentale.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
L'analisi filogenetica di famiglie proteiche come i trasportatori SWEET consente una riduzione del rischio meccanicistica nella fase iniziale di scoperta, chiarificando le origini evolutive e la divergenza funzionale. Questo approccio supporta la validazione degli obiettivi distinguendo i domini conservati dalle innovazioni specifiche della linea evolutiva, riducendo l'ambiguità nella generazione di ipotesi. Le informazioni sugli eventi di fusione genica guidano le strategie di biomarcatori traslazionali e la selezione di modelli preclinici per percorsi correlati al trasporto.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Interroga ipotesi terapeutiche tracciando l'architettura dei domini fino ai progenitori procariotici e archeici.
- Valore operativo: Chiarisce la validazione del bersaglio funzionale attraverso la conservazione evolutiva dei domini MtN3 saliva nelle proteine SWEET.
- Valore predittivo: Supporta la selezione del portafoglio identificando regioni vincolate dall'evoluzione, meno soggette a meccanismi compensativi.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Prepara sistemi biologici validati definendo i confini dei domini per la costruzione di proteine chimere.
- Valore operativo: Permette la standardizzazione dei saggi utilizzando domini MtN3 allineati per sequenza come letture quantitative dell'attività dei trasportatori.
- Scalabilità: Facilita il riutilizzo della piattaforma mediante pipeline basate su Clustal Omega e MEGA per lo screening interspecifico della famiglia SWEET.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità Translazionale: Collega la scoperta alla validazione preclinica confermando la conservazione dei domini tra eucarioti e procarioti.
- Allineamento dei Biomarcatori: Supporta la riduzione del rischio meccanicistico correlando la divergenza del dominio SWEET con gli esiti fenotipici del trasporto degli zuccheri.
- Avanzamento Basato sul Rischio: Guida le decisioni di proseguimento o interruzione dello sviluppo evidenziando i vincoli evolutivi sulla tolleranza alle mutazioni del bersaglio.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nel percorso di scoperta, dal test dell'ipotesi sul bersaglio fino all'identificazione del composto attivo, fornendo un contesto evolutivo per la funzione proteica.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi chiarendo se la funzione osservata di SWEET derivi da eredità verticale o da trasferimento orizzontale di geni.
- Screening: Descrive la prontezza del saggio attraverso domini MtN3 allineati come unità stabili e quantificabili per lo screening ad alto rendimento.
- Analisi: Evidenzia i risultati della Massima Verosimiglianza e dell'Inferenza Bayesiana come misure statistiche della fiducia nei cladi ai fini della priorizzazione degli obiettivi.
- Ricerca traslazionale: Si collega alla continuità preclinica validando la conservazione dei domini come indicatore della preservazione funzionale nei modelli di malattia.
- Riutilizzo aziendale: Presenta il flusso di lavoro Clustal Omega-MEGA-MrBayes come una capacità riutilizzabile per ridurre i rischi associati alle famiglie di trasportatori in diversi progetti.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Affidabilità predittiva nella selezione delle target grazie alla riduzione del rischio evolutivo delle assunzioni meccanicistiche.
- Valore operativo: Standardizzazione e riproducibilità mediante parametri di allineamento fissi e criteri di selezione del modello (LG+G+F).
- Valore strategico: Decisioni più efficaci su proseguire o meno il progetto, riducendo il rischio di fallimento in fasi avanzate dovuto a un'errata attribuzione del meccanismo della target.
- Impatto sul portafoglio: Prioritizzazione aggiustata per il rischio basata su punteggi di vincolo evolutivo derivati dal supporto filogenetico dei cladi.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nell'allineamento di sequenze, nel test dei modelli filogenetici e nell'interpretazione degli alberi filogenetici.
- Presuppone l'accesso a Clustal Omega, MEGA e MrBayes per l'allineamento e la costruzione degli alberi.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro sui protocolli di cura delle sequenze e sulla selezione dei modelli.
- Comporta considerazioni di adattamento quando applicato a famiglie di proteine non trasportatrici con architetture di dominio diverse.
- È limitato dall'impossibilità di confermare l'equivalenza funzionale degli stati ancestrali inferiti senza una validazione sperimentale.
