Rilevamento di fosforilazione di Rab10 di LRRK2 attività mediante SDS-PAGE con un Tag di fosfato-binding

L'obiettivo generale di questo esperimento è quello di rilevare la fosforilazione di Rab10 da parte di LRRK2 utilizzando SDS-PAGE con un tag di legame con il fosfato. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della ricerca sul Parkinson, come ad esempio il modo in cui le mutazioni della malattia in LRRK2 influenzano la fosforilazione di Rab10. Il vantaggio principale di questa tecnica è che si può avere una stima approssimativa della stechiometria della fosforilazione di Rab10 utilizzando un semplice western blot.

Molti dei passaggi di questo protocollo sono abbastanza standard e sono descritti in modo sufficientemente dettagliato dal protocollo di testo che accompagna questo video. Qui, vogliamo mostrarti i passaggi che beneficiano maggiormente dell'istruzione visiva. Preparare piastre di cellule HEK293 trasfettate come descritto nel protocollo di testo.

Con le piastre sul ghiaccio, aspirare e scartare il terreno. Quindi, aggiungere con cautela due millilitri di DPBS all'angolo di ciascuna piastra e far oscillare le piastre per distribuire la soluzione. Quindi rimuovere ed eliminare il DPBS.

Successivamente, a ciascuna piastra aggiungere 100 microlitri di tampone di lisi. Inclinare la piastra e utilizzare un raschietto per stendere il tampone e rilasciare il lisato cellulare. Aspirare quindi i lisati e trasferirli in provette di microfuge preraffreddate su ghiaccio e attendere 10 minuti.

Successivamente, raccogliere i lisati cellulari privi di detriti centrifugando le provette e trasferendo i surnatanti in nuove provette su ghiaccio. Quindi misurare le concentrazioni proteiche dei lisati eliminati utilizzando il saggio di Bradford. Per i dati di concentrazione, preparare campioni da 100 microlitri di lisati per l'analisi su gel.

Preparare lisati più densi per misurare la Rab10 endogena rispetto all'emoagglutinina Rab10 sovraespressa. Terminare la preparazione dei campioni incubandoli a 100 gradi Celsius per cinque minuti. Quindi conservare i campioni a una temperatura inferiore a meno 20 gradi Celsius fino al momento del bisogno per un massimo di sei mesi o più.

Per iniziare, prepara le celle SDS-PAGE secondo il protocollo di testo. Quindi caricare il gel nel serbatoio e fissarlo con le clip del raccoglitore. Quindi, riempire il serbatoio con il tampone di scorrimento e rimuovere le bolle d'aria nei pozzetti e sotto il gel utilizzando un ago attaccato a una siringa.

Ora aggiungi cloruro di manganese ai campioni e centrifugali per rimuovere i precipitati. Quindi caricare il gel con volumi uguali di campione, 10 microgrammi di proteine per analizzare l'emoagglutinina Rab10 sovraespressa o 30 microgrammi di proteine per analizzare Rab10 endogeno. Caricare le corsie vuote con un tampone per campioni contenente cloruro di manganese.

Integrare anche il marcatore di peso molecolare con tampone e cloruro di manganese per renderlo dello stesso volume dei campioni. Ora inizia a far funzionare il gel a 50 volt. Dopo la pila di campioni, aumentare la tensione a 120 per ottenere la separazione.

Quando il fronte del colorante raggiunge il fondo dei gel, uccidi la tensione. Quindi, lavare il gel tre volte come segue. Caricare il gel di separazione in un bagno di tampone di trasferimento pulito con l'aggiunta di EDTA e SDS.

Lasciate poi oscillare su uno shaker per 10 minuti a temperatura ambiente. Dopo tre lavaggi, eseguire un altro lavaggio utilizzando il buffer di trasferimento con l'aggiunta di SDS ma senza EDTA. Quindi trasferire il gel utilizzando un serbatoio umido.

Caricare il serbatoio in una scatola di schiuma riempita con acqua ghiacciata, collegare il serbatoio a una presa di corrente e avviare il trasferimento. Un lungo trasferimento con un raffreddamento efficiente è essenziale per la procedura. Dopo il trasferimento, controllare il trasferimento colorando la membrana con Ponceau S, seguito da un lavaggio in TBST secondo il protocollo di testo.

Quindi, applica un blocco. Immergere la macchia in TBST lattiginoso e agitare la macchia su uno shaker per un'ora a temperatura ambiente. Quindi rimuovere e scartare la soluzione bloccante e applicare la soluzione di anticorpi primari.

Ora fai oscillare la membrana durante la notte a quattro gradi Celsius. Il giorno successivo, rimuovere la soluzione di anticorpi primari. Quindi lavare la membrana con TBST fresco tre volte come prima.

Dopo i lavaggi, immergere il blot in una soluzione di anticorpi secondari e incubare la membrana su un bilanciere per circa un'ora a temperatura ambiente. Dopo l'incubazione, lavare nuovamente la membrana con TBST tre volte. Ora sviluppa la membrana.

Aggiungere un millilitro di soluzione ECL a un grande foglio di pellicola trasparente. Quindi appoggiare la membrana nell'ECL e capovolgerla rapidamente per bagnare entrambi i lati. Quindi, solleva la membrana e lasciala scolare.

Dopo averlo drenato, lascia che un bordo tocchi un tovagliolo di carta per circa cinque secondi per aiutare a rimuovere la soluzione in eccesso. Quindi avvolgere la membrana in una pellicola rigida trasparente senza pieghe e trasferirla in un vassoio nero per l'imaging. Le cellule HEK293 sono state trasfettate con emoagglutinina Rab10 wild-type e 3xFLAG-LRRK2.

Sono state testate chinasi wild-type inattive nelle mutazioni familiari di LRRK2 nella malattia di Parkinson. La co-sovraespressione di LRRK2 e Rab10 ha determinato un importante spostamento di banda nel gel P-tag. Al contrario, la co-espressione con un mutante inattivo della chinasi non ha portato a cambiamenti nella mobilità di Rab10, implicando la chinasi come causa dello spostamento della banda.

Inoltre, come previsto, le mutazioni familiari del PD hanno tutte aumentato lo spostamento di banda. Il sistema P-tag gel è stato utilizzato anche per analizzare cellule di fibroblasti embrionali albini di topo 3T3-Swiss trattate con un inibitore LRRK2. Lo spostamento di banda corrispondente al Rab10 endogeno fosforilato è scomparso quando le cellule sono state trattate con GSK2578215A.

Lo stesso test è stato eseguito anche utilizzando cellule umane A549. In questi esperimenti, l'efficacia dell'inibitore LRRK2 è stata convalidata utilizzando l'anticorpo LRRK2 anti-p serina 935, che è un marcatore ben consolidato dell'inibizione di LRRK2. Una volta padroneggiata, questa tecnica richiede solo 14 minuti in più rispetto a una normale procedura di western blotting che consiste nel lavare i gel prima del trasferimento.

Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come la spettrometria di massa per rispondere a ulteriori domande, come ad esempio se i mutanti FPD fosforilano lo stesso residuo di Rab10. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della ricerca sul Parkinson per esplorare i livelli endogeni di fosforilazione di Rab10 nelle cellule in coltura e nei tessuti. Non dimenticare che lavorare con la microcistina aggiunta al tampone di lisi può essere estremamente pericoloso e che durante la preparazione dei lisati cellulari è necessario prendere sempre precauzioni come indossare dispositivi di protezione individuale adeguati.