Name: Rilevamento di fosforilazione di Rab10 di LRRK2 attività mediante SDS-PAGE con un Tag di fosfato-binding (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: Impara a rilevare la fosforilazione di Rab10 da parte di LRRK2 mediante SDS-PAGE con tag di legame al fosfato. Questo metodo consente di stimare la stechiometria della fosforilazione in cellule HEK293.

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Si ringrazia il Dr. Takeshi Iwatsubo (Università di Tokyo, Giappone) per gentilmente fornire i plasmidi codifica 3xFLAG-LRRK2 WT e mutanti. Ringraziamo anche il Dr. Dario Alessi (Università di Dundee, UK) per fornire gentilmente MLi-2 ed il plasmide che codifica HA-Rab10. Questo lavoro è stato supportato dalla società Giappone per la promozione della scienza (JSPS) KAKENHI Grant numero JP17K08265 (G.I.).

<ol><li>Sveinbjornsdottir, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+clinical+symptoms+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">The clinical symptoms of Parkinson's disease.</a> J. Neurochem. 139 (Suppl. 1), 318-324 (2016).</li>
<li>Hernandez, D. G., Reed, X., Singleton, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+in+Parkinson+disease%3A+Mendelian+versus+non-Mendelian+inheritance%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Genetics in Parkinson disease: Mendelian versus non-Mendelian inheritance.</a> J. Neurochem. 139 (Suppl. 1), 59-74 (2016).</li>
<li>Paisán-Ruíz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+of+the+gene+containing+mutations+that+cause+PARK8-linked+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Cloning of the gene containing mutations that cause PARK8-linked Parkinson's disease.</a> Neuron. 44 (4), 595-600 (2004).</li>
<li>Zimprich, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+LRRK2+cause+autosomal-dominant+parkinsonism+with+pleomorphic+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mutations in LRRK2 cause autosomal-dominant parkinsonism with pleomorphic pathology.</a> Neuron. 44 (4), 601-607 (2004).</li>
<li>Gilks, W. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+common+LRRK2+mutation+in+idiopathic+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">A common LRRK2 mutation in idiopathic Parkinson's disease.</a> Lancet. 365 (9457), 415-416 (2005).</li>
<li>Satake, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+association+study+identifies+common+variants+at+four+loci+as+genetic+risk+factors+for+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Genome-wide association study identifies common variants at four loci as genetic risk factors for Parkinson's disease.</a> Nat. Genet. 41 (12), 1303-1307 (2009).</li>
<li>Simón-Sánchez, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+association+study+reveals+genetic+risk+underlying+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Genome-wide association study reveals genetic risk underlying Parkinson's disease.</a> Nat. Genet. 41 (12), 1308-1312 (2009).</li>
<li>Klein, C., Ziegler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imputation+of+sequence+variants+for+identification+of+genetic+risks+for+Parkinson%27s+disease%3A+a+meta-analysis+of+genome-wide+association+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Imputation of sequence variants for identification of genetic risks for Parkinson's disease: a meta-analysis of genome-wide association studies.</a> Lancet. 377 (9766), 641-649 (2011).</li>
<li>Cookson, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+leucine-rich+repeat+kinase+2+%28LRRK2%29+in+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The role of leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) in Parkinson's disease.</a> Nat. Rev. Neurosci. 11 (12), 791-797 (2010).</li>
<li>Ozelius, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LRRK2+G2019S+as+a+Cause+of+Parkinson%E2%80%99s+Disease+in+Ashkenazi+Jews%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">LRRK2 G2019S as a Cause of Parkinson’s Disease in Ashkenazi Jews.</a> N. Engl. J. Med. 354 (4), 424-425 (2006).</li>
<li>Lesage, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LRRK2+G2019S+as+a+Cause+of+Parkinson%E2%80%99s+Disease+in+North+African+Arabs%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">LRRK2 G2019S as a Cause of Parkinson’s Disease in North African Arabs.</a> N. Engl. J. Med. 354 (4), 422-423 (2006).</li>
<li>Bouhouche, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LRRK2+G2019S+Mutation%3A+Prevalence+and+Clinical+Features+in+Moroccans+with+Parkinson%27s+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Parkinsons.+Dis%22%5BJournal%5D)">LRRK2 G2019S Mutation: Prevalence and Clinical Features in Moroccans with Parkinson's Disease.</a> Parkinsons. Dis. , 1-7 (2017).</li>
<li>West, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkinson%27s+disease-associated+mutations+in+leucine-rich+repeat+kinase+2+augment+kinase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Parkinson's disease-associated mutations in leucine-rich repeat kinase 2 augment kinase activity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102 (46), 16842-16847 (2005).</li>
<li>Ito, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GTP+binding+is+essential+to+the+protein+kinase+activity+of+LRRK2%2C+a+causative+gene+product+for+familial+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">GTP binding is essential to the protein kinase activity of LRRK2, a causative gene product for familial Parkinson's disease.</a> Biochemistry. 46 (5), 1380-1388 (2007).</li>
<li>Steger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphoproteomics+reveals+that+Parkinson%27s+disease+kinase+LRRK2+regulates+a+subset+of+Rab+GTPases%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Phosphoproteomics reveals that Parkinson's disease kinase LRRK2 regulates a subset of Rab GTPases.</a> Elife. 5, (2016).</li>
<li>Ito, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phos-tag+analysis+of+Rab10+phosphorylation+by+LRRK2%3A+a+powerful+assay+for+assessing+kinase+function+and+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Phos-tag analysis of Rab10 phosphorylation by LRRK2: a powerful assay for assessing kinase function and inhibitors.</a> Biochem. J. 473, 2671-2685 (2016).</li>
<li>Kinoshita, E., Kinoshita-Kikuta, E., Takiyama, K., Koike, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphate-binding+tag%2C+a+new+tool+to+visualize+phosphorylated+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Phosphate-binding tag, a new tool to visualize phosphorylated proteins.</a> Mol. Cell. Proteomics. 5 (4), 749-757 (2006).</li>
<li>Database, J. S. E. Using a Hemacytometer to Count Cells. J. Vis. Exp. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5048/using-a-hemacytometer-to-count-cells">https://www.jove.com/science-education/5048/using-a-hemacytometer-to-count-cells</a> (2017).</li>
<li>Ni, D., Xu, P., Gallagher, S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27038386">Immunoblotting and Immunodetection.</a> Curr. Protoc. Mol. Biol. (114), 10.8.1-10.8.37 (2016).</li>
<li>Reith, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GSK2578215A%3B+a+potent+and+highly+selective+2-arylmethyloxy-5-substitutent-N-arylbenzamide+LRRK2+kinase+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg.+Med.+Chem.+Lett%22%5BJournal%5D)">GSK2578215A; a potent and highly selective 2-arylmethyloxy-5-substitutent-N-arylbenzamide LRRK2 kinase inhibitor.</a> Bioorg. Med. Chem. Lett. 22 (17), 5625-5629 (2012).</li>
<li>Fell, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MLi-2%2C+a+potent%2C+selective+and+centrally+active+compound+for+exploring+the+therapeutic+potential+and+safety+of+LRRK2+kinase+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Exp.+Ther%22%5BJournal%5D)">MLi-2, a potent, selective and centrally active compound for exploring the therapeutic potential and safety of LRRK2 kinase inhibition.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 355, 397-409 (2015).</li>
<li>Dzamko, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+LRRK2+kinase+activity+leads+to+dephosphorylation+of+Ser%28910%29%2FSer%28935%29%2C+disruption+of+14-3-3+binding+and+altered+cytoplasmic+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Inhibition of LRRK2 kinase activity leads to dephosphorylation of Ser(910)/Ser(935), disruption of 14-3-3 binding and altered cytoplasmic localization.</a> Biochem. J. 430 (3), 405-413 (2010).</li>
<li>Thévenet, J., Pescini Gobert, R., Hooft van Huijsduijnen , R., Wiessner, C., Sagot, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+LRRK2+expression+points+to+a+functional+role+in+human+monocyte+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Regulation of LRRK2 expression points to a functional role in human monocyte maturation.</a> PLoS One. 6 (6), e21519(2011).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Qui, descriviamo un metodo facile e robusto di rilevazione Rab10 fosforilazione di LRRK2 a livelli endogeni basata sulla metodologia P-tag. Poiché l'anticorpo attualmente disponibile contro fosforilato Rab10 funziona solo con proteine overexpressed15, il presente metodo utilizzando tag P SDS-PAGE è l'unico modo per valutare i livelli endogeni di Rab10 fosforilazione. Inoltre, il presente metodo consente la stima della stechiometria di Rab10 fosforilazione nelle cellule. Perché la metodologia P-tag...

PD è una delle più comuni malattie neurodegenerative, che interessa principalmente i neuroni dopaminergici nel midbrain, conseguente disfunzione dei sistemi motore in persone anziane1. Mentre la maggior parte dei pazienti sviluppano PD in maniera sporadica, ci sono famiglie di ereditare la malattia. Mutazioni in diversi geni sono state trovate per essere collegati con FPD2. Uno dei geni causativi per FPD è LRRK2, in cui otto mutazioni di senso sbagliato (N1437H, R1441C/G/H/S, Y1699C, G2019S e I2020T) collegate a un dominante ereditato FPD chiamato PARK8 finora sono stati segnalati3,4,5. Diversi studi di associazione genome-wide (GWAS) di pazienti sporadici di PD sono identificati varianti genomiche del locus LRRK2 come un fattore di rischio per PD, suggerendo che l'anomalia nella funzione di LRRK2 è una causa comune di neurodegenerazione in entrambi sporadici e PARK8 FPD6,7,8.
LRRK2 è una grossa proteina (2.527 aminoacidi) costituito da un dominio ripetizione leucina-ricche, un Ras GTP-legante del dominio di proteine complesse (ROC), un C-terminale del dominio, un dominio della chinasi serina/treonina proteina e un dominio ripetere di WD409ROC (COR). Le mutazioni di FPD otto individuare in questi domini funzionali; N1437H e R1441C/G/H/S nel dominio di ROC, Y1699C nel dominio COR, G2019S e I2020T nel dominio chinasico. Poiché la mutazione G2019S, che è trovato il più delle volte la mutazione del PD pazienti10,11,12, aumenta l'attività della chinasi di LRRK2 da 2-3 volte in vitro13, è supposto che l'aumento anormale nella fosforilazione di LRRK2 overesprimessero è tossico ai neuroni. Tuttavia, è Impossibile studiare se la fosforilazione di substrati LRRK2 fisiologicamente rilevanti è alterata nei pazienti del palladio familiare/sporadici a causa della mancanza di metodi valutarla nei campioni derivati.
Fosforilazione della proteina viene generalmente rilevata dal immunoblotting o enzima-collegata dell'immunosorbente (ELISA) utilizzando anticorpi che riconoscono specificamente lo stato fosforilato di proteine o dall'analisi di spettrometria di massa. Tuttavia, la strategia ex a volte non può essere applicata a causa delle difficoltà nella creazione di anticorpi specifici per fosforilazione. Etichettatura metabolica delle cellule con fosfato radioattivo è un'altra opzione per esaminare i livelli fisiologici di fosforilazione quando fosforilazione specifici anticorpi non sono prontamente disponibili. Tuttavia, esso richiede una grande quantità di materiali radioattivi e quindi comporta alcune attrezzature specializzate per la protezione dalle radiazioni14. Analisi di spettrometria di massa è più sensibile rispetto a questi metodi immunochimici ed è diventato popolare nell'analizzare la fosforilazione della proteina. Tuttavia, la preparazione del campione è che richiede tempo e costosi strumenti sono necessari per l'analisi.
Un sottoinsieme della famiglia Rab GTPase tra cui Rab10 e Tab8 recentemente è stato segnalato come substrati fisiologici diretti per LRRK2 basano sul risultato di analisi su larga scala fosfoproteomica15. Abbiamo quindi dimostrato che la fosforilazione Rab10 è stata aumentata da mutazioni di FPD in fibroblasti embrionali di topo e nei polmoni dei topi16di knockin. In questo rapporto, abbiamo scelto di impiegare un'elettroforesi del gel di poliacrilammide sodio dodecil solfato (SDS-PAGE)-basato su metodo in cui è co-polimerizzata in gel di SDS-PAGE (tag P SDS-PAGE) per rilevare i livelli endogeni di Rab10 fosforilazione, una molecola di tag P perché un anticorpo altamente sensibile di Rab10 fosforilato era ancora carente. Non siamo riusciti a rilevare la fosforilazione di endogeno Tab8 a causa della scarsa selettività di anticorpi attualmente disponibili per Tab8 totale. Pertanto, abbiamo deciso di concentrarsi sulla fosforilazione di Rab10. LRRK2 fosforila Rab10 alle Thr73 di posizionamento al centro della regione altamente conservata "passare II". Alta conservazione dei siti di fosforilazione tra proteine Rab potrebbe essere uno dei motivi per cui phosphospecific anticorpi riconoscendo distinte proteine Rab sono difficili da fare.
La fosforilazione di Rab8A di LRRK2 inibisce il legame di Rabin8, un fattore di scambio di nucleotide della guanina (GEF) che attiva Rab8A scambiando il PIL associato con GTP15. Fosforilazione di Rab10 e Rab8A di LRRK2 inibisce anche il legame degli inibitori di PIL-dissociazione (GDIs), che sono essenziali per l'attivazione delle proteine Rab estraendo le proteine Rab PIL associati da membrane15. Collettivamente, è supposto che la fosforilazione delle proteine Rab di LRRK2 impedisce loro di attivazione anche se il preciso meccanismo molecolare e conseguenze fisiologiche della fosforilazione rimangono poco chiare.
P-tag SDS-PAGE è stato inventato da Kinoshita et nel 2006: In questo metodo, acrilammide in covalenza è stato accoppiato con tag P, una molecola catturando fosfati con alta affinità, che copolymerized in SDS-PAGE gel17. Poiché le molecole di P-tag in un gel di SDS-PAGE ritardano selettivamente mobilità elettroforetica delle proteine fosforilate, tag P SDS-PAGE possibile separare proteine fosforilate da quelli non-fosforilate (Figura 1). Se la proteina di interesse è fosforilata su residui multipli, sarà osservata una scaletta delle bande corrispondenti alle forme differenzialmente fosforilate. Nel caso di Rab10, osserviamo soltanto una fascia spostata, che indica che Rab10 è fosforilata solo a Thr73. Il vantaggio principale di SDS-PAGE tag P sopra immunoblotting con anticorpi specifici per fosforilazione è che Rab10 fosforilata può essere rilevato dall'immunoblotting con gli anticorpi non specifici di fosforilazione (cioè, riconoscendo Rab10 totale) Dopo essere stato trasferito sulle membrane, che è generalmente più specifico, sensibile e disponibile da fonti commerciali/accademico. Un altro vantaggio dell'utilizzo di tag P SDS-PAGE è che si può ottenere una stima approssimativa della stechiometria di fosforilazione, che è impossibile da immunoblotting con anticorpi specifici per fosforilazione o mediante marcatura metabolica delle cellule con radioattivo fosfati.
Oltre all'uso di poco costoso tag P acrilammide e alcune piccole modifiche ad esso correlati, il presente metodo per il rilevamento di Rab10 fosforilazione di LRRK2 segue un protocollo generale di immunoblotting.Di conseguenza, dovrebbe essere semplice e facilmente eseguibile in qualsiasi laboratorio dove immunoblotting è una pratica abituale, con tutti i tipi di campioni tra cui proteine purificate, lisati cellulari e degli omogeneati del tessuto.

<table><tbody><tr><td><forte>Reagenti</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (DPBS)</td><td>fatto in casa</td><td></td><td>150 mM NaCl, 8 mM Na2HPO4-12H2O, 2,7 mM KCl, 1,5 mM KH2PO4 in acqua MilliQ e sterilizzato in autoclave</td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Nacalai Tesque</td><td>31320-34</td><td></td></tr><tr><td>Sodio disodico idrogenofosfato 12-Acqua</td><td>Wako</td><td>196-02835</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di potassio</td><td>Wako</td><td>163-03545</td><td></td></tr><tr><td>Potassio diidrogeno fosfato</td><td>Wako</td><td>169-04245</td><td></td></tr><tr><td>2,5% Tripsina (10X)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4549</td><td>Diluire 10 volte con DPBS sterile per la preparazione della soluzione</td></tr> <tr><td>di lavoroDulbecco's modified Eagle medium (DMEM)</td><td>Wako</td><td>044-29765</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>BioWest</td><td>S1560</td><td>Inattivato a caldo a 56 &deg; C per 30 min</td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina (100X)</td><td>Wako</td><td>168-23191</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Wako</td><td>342-01375</td><td></td></tr><tr><td>Idrossido di sodio</td><td>Wako</td><td>198-13765</td><td></td></tr><tr><td>Polietilenimmina HCl MAX, lineare, Mw 40.000 (PEI MAX 40000)</td><td>PolySciences, Inc.</td><td>24765-1</td> La <td>soluzione madre è stata preparata in 20 mM HEPES-NaOH pH 7.0 a 1 mg/mL e il pH è stato quindi regolato a 7.0 con NaOH</td></tr><tr><td>Dimetil solfossido</td><td>Wako</td><td>045-28335</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>STAR</td><td>RSP-THA500G</td><td></td></tr><tr><td>Acido cloridrico</td><td>Wako</td><td>080-01066</td><td></td></tr><tr><td>Poliossietilene(10) Ottilfenil etere</td><td>Wako</td><td>160-24751</td><td>Equivalente a Triton X-100</td></tr><tr><td>Glicole etilenico-bis(2-amminoetiletere)-N,N,N',N'-acido tetraacetico (EGTA)</td><td>Wako</td><td>346-01312</td><td></td></tr><tr><td>Ortovanadato di sodio(V)</td><td>Wako</td><td>198-09752</td><td></td></tr><tr><td>Fluoruro di sodio</td><td>Kanto Chemical</td><td>37174-20</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Acido glicerofosforico Sale disodico Pentaidrato</td><td>Nacalai Tesque</td><td>17103-82</td><td></td></tr><tr><td>Sodio pirofosfato decaidrato</td><td>Kokusan Chemical</td><td>2113899</td><td></td></tr><tr><td>Microcystin-LR</td><td>Wako</td><td>136-12241</td><td></td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>Wako</td><td>196-00015</td><td></td></tr><tr><td>Cocktail completo di inibitori della proteasi senza EDTA</td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td>Sciogliere una compressa in 1 ml di acqua, che può essere conservata a -20 &deg; C per un mese. Usalo a diluizione 1:50 per la lisi cellulare</td></tr><tr><td>Kit di analisi delle proteine Pierce Coomassie (Bradford)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23200</td><td></td></tr><tr><td>Sodio dodecil solfato</td><td>Nacalai Tesque</td><td>31607-65</td><td></td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>Wako</td><td>075-00616</td><td></td></tr><tr><td>Blu di bromofenolo</td><td>Wako</td><td>021-02911</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoetanolo</td><td>Kanto Chemical</td><td>25099-00</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>Wako</td><td>056-06967</td><td></td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>Wako</td><td>136-01837</td><td></td></tr><tr><td>Etichetta legante il fosfato acrilammide</td><td>Wako</td><td>AAL-107</td><td>P-tag acrilammide</td></tr><tr><td>40% (p/v) soluzione acrilammidica</td><td>Nacalai Tesque</td><td>06119-45</td><td>Acrilammide:Bis = 29:1</td></tr><tr><td>Tetrametiletilendiammina (TEMED)</td><td>Nacalai Tesque</td><td>33401-72</td><td></td></tr><tr>La soluzione di <td>persolfato di ammonio (APS)</td><td>Wako</td><td>016-08021</td><td>al 10% (p/v) è stata preparata sciogliendo la polvere di persolfato di ammonio in acqua MilliQ</td></tr><tr><td>2-propanolo</td><td>Wako</td><td>166-04831</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di manganese tetraidrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3634</td><td></td></tr><tr><td>Precision Plus Protein Prestained Standard</td><td>Bio-Rad</td><td>1610374, 1610373, 1610377</td><td>Marcatore di peso molecolare utilizzato nel protocollo</td></tr><tr><td>WIDE-VIEW Prestained Protein Size Marker III</td><td>Wako</td><td>230-02461</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Nacalai Tesque</td><td>17109-64</td><td></td></tr><tr><td>Amersham Protran NC 0.45</td><td>GE Healthcare</td><td>10600007</td><td>Membrana in nitrocellulosa</td></tr><tr><td>Filtro a membrana Durapore</td><td>EMD Millipore</td><td>GVHP00010</td><td>Membrana PVDF</td></tr><tr><td>Carte filtranti n. 1</td><td>Advantec</td><td>00013600</td><td></td></tr><tr><td>Ponceau S</td><td>Nacalai Tesque</td><td>28322-72</td><td></td></tr><tr><td>Acido acetico</td><td>Wako</td><td>017-00251</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td>poliossietilenesorbitano monolaurato</td></tr><tr><td>Acido etilendiamminotetraacetico (EDTA)</td><td>Wako</td><td>345-01865</td><td></td></tr><tr><td>Latte scremato in polvere</td><td>Difco Laboratories</td><td>232100</td><td></td></tr><tr><td>Immunostar</td><td>Wako</td><td>291-55203</td><td>Soluzione ECL (sensibilità normale)</td></tr><tr><td>Immunostar LD</td><td>Wako</td><td>290-69904</td><td>Soluzione ECL (Alta sensibilità)</td></tr><tr><td>Soluzione colorante CBB</td><td>fatta in casa</td><td></td><td>1 g CBB R-250, metanolo al 50% (v/v), acido acetico al 10% (v/v) in 1 litro di acqua MilliQ</td></tr><tr><td>CBB R-250</td><td>Wako</td><td>031-17922</td><td></td></tr><tr><td>Decolorazione CBB soluzione</td><td>fatta in casa</td><td></td><td>12% (v/v) metanolo, 7% (v/v) acido acetico in 1 L MilliQ acqua</td></tr><tr><td><forte>Nome</forte></td><td><forte>Azienda</forte></td><td><forte>Numero di catalogo</forte></td><td><forte>Commenti</forte></td></tr><tr><td><forte>Anticorpi</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-HA anticorpo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11583816001</td><td>Usato a 0,2 &mu; g/mL per l'immunoblotting.</td></tr><tr><td>anti-Rab10 anticorpo</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>#8127</td><td>Utilizzato a 1:1000 per l'immunoblotting. La specificità è stata confermata da CRISPR KO in Ito et al., Biochem J, 2016.</td></tr><tr><td>anticorpo anti-pSer935</td><td>Abcam</td><td>ab133450</td><td>Usato a 1 &mu; g/mL per l'immunoblotting.</td></tr><tr><td>anticorpo anti-LRRK2</td><td>Abcam</td><td>ab133518</td><td>Usato a 1 &mu; g/mL per l'immunoblotting.</td></tr><tr><td>anticorpo anti-&alfa;-tubulina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9026</td><td>Usato a 1 &mu; g/mL per l'immunoblotting.</td></tr><tr><td>anticorpo anti-GAPDH</td><td>Santa-Cruz</td><td>sc-32233</td><td>Usato a 0,02 &mu; g/mL per l'immunoblotting.</td></tr><tr><td>Perossidasi AffiniPuro IgG di Pecora Anti-Topo (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>515-035-003</td><td>Usato a 0,16 &mu; g/mL per l'immunoblotting.</td></tr><tr><td>Perossidasi AffiniIgG anti-coniglio di capra pura (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-035-003</td><td>Utilizzato a 0,16 &mu; g/mL per l'immunoblotting.</td></tr><tr><td>Name</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Inibitori</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GSK2578215A</td> La soluzione madre <td>MedChem Express</td><td>HY-13237</td><td>è stata preparata in DMSO a 10 mM e conservata a -80 &deg; C</td></tr><tr><td>MLi-2</td><td>Fornito dal Dott. Dario Alessi (Università di Dundee)</td><td></td><td>La soluzione madre è stata preparata in DMSO a 10 mM e conservata a -80 gradi; C</td></tr><tr><td>Name</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Plasmidi</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rab10/pcDNA5 FRT TO HA</td><td>Fornito dal Dr. Dario Alessi (Università di Dundee)</td><td></td><td>Questo plasmide esprime Rab10 umano marcato con HA amino-terminale.</td></tr><tr><td>LRRK2 WT/p3xFLAG-CMV-10</td><td>Fornito dal Dr Takeshi Iwatsubo (Università di Tokyo)</td><td></td><td>Ito et al., Biochimica, 46: 1380&ndash; 1388 (2007). Questo plasmide esprime amino-terminale 3xFLAG-taged wild-type umano LRRK2.</td></tr><tr><td>LRRK2 K1906M/p3xFLAG-CMV-10</td><td>Fornito dal Dr Takeshi Iwatsubo (Università di Tokyo)</td><td></td><td>Ito et al., Biochimica, 46: 1380&ndash; 1388 (2007). Questo plasmide esprime un mutante inattivo della chinasi K1906M marcato con 3xFLAG amino-terminale di LRRK2 umano.</td></tr><tr><td>LRRK2 N1437H/p3xFLAG-CMV-10</td><td></td><td></td><td>Questo documento. Questo plasmide esprime il mutante FPD N1437H marcato con 3xFLAG amino-terminale di LRRK2 umano.</td></tr><tr><td>LRRK2 R1441C/p3xFLAG-CMV-10</td><td>Fornito dal Dr Takeshi Iwatsubo (Università di Tokyo)</td><td></td><td>Kamikawaji et al., Biochimica, 48: 10963&ndash; 10975 (2013). Questo plasmide esprime il mutante Amino-terminale 3xFLAG-taged R1441C FPD di LRRK2 umano.</td></tr><tr><td>LRRK2 R1441G/p3xFLAG-CMV-10</td><td>Fornito dal Dr Takeshi Iwatsubo (Università di Tokyo)</td><td></td><td>Kamikawaji et al., Biochimica, 48: 10963&ndash; 10975 (2013). Questo plasmide esprime il mutante Amino-terminale 3xFLAG-taged R1441G FPD di LRRK2 umano.</td></tr><tr><td>LRRK2 R1441H/p3xFLAG-CMV-10</td><td>Fornito dal Dr Takeshi Iwatsubo (Università di Tokyo)</td><td></td><td>Kamikawaji et al., Biochimica, 48: 10963&ndash; 10975 (2013). Questo plasmide esprime amino-terminale il mutante R1441H FPD marcato con 3xFLAG di LRRK2 umano.</td></tr><tr><td>LRRK2 R1441S/p3xFLAG-CMV-10</td><td></td><td></td><td>Questo documento. Questo plasmide esprime il mutante Amino-terminale R1441S FPD marcato con 3xFLAG di LRRK2 umano.</td></tr><tr><td>LRRK2 Y1699C/p3xFLAG-CMV-10</td><td>Fornito dal Dr Takeshi Iwatsubo (Università di Tokyo)</td><td></td><td>Kamikawaji et al., Biochimica, 48: 10963&ndash; 10975 (2013). Questo plasmide esprime il mutante Y1699C FPD amino-terminale marcato con 3xFLAG di LRRK2 umano.</td></tr><tr><td>LRRK2 G2019S/p3xFLAG-CMV-10</td><td>Fornito dal dottor Takeshi Iwatsubo (Università di Tokyo)</td><td></td><td>Kamikawaji et al., Biochimica, 48: 10963&ndash; 10975 (2013). Questo plasmide esprime il mutante FPD G2019S marcato con 3xFLAG amino-terminale di LRRK2 umano.</td></tr><tr><td>LRRK2 I2020T/p3xFLAG-CMV-10</td><td>Fornito dal dottor Takeshi Iwatsubo (Università di Tokyo)</td><td></td><td>Kamikawaji et al., Biochimica, 48: 10963&ndash; 10975 (2013). Questo plasmide esprime il mutante Amino-terminale 3xFLAG-taged I2020T FPD di LRRK2 umano.</td></tr><tr><td>Name</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Equipments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO2 incubatore</td><td>Thermo Fisher Scientific Forma</td><td>Series II 3110 Pipetta automatica con rivestimento</td><td></td>in acqua</tr><tr><td></td><td>Drummond</td><td>Pipet-Aid PA-400</td><td></td></tr><tr><td>Micropipetta P10</td><td>Nichiryo</td><td>00-NPX2-10</td><td>0.5&ndash; 10 &mu; </td></tr><tr><td>L Micropipetta P200</td><td>Nichiryo</td><td>00-NPX2-200</td><td>20&ndash; 200 &mu; </td></tr><tr><td>L Micropipetta P1000</td><td>Nichiryo</td><td>00-NPX2-1000</td><td>100&ndash; 1000 &mu; </td></tr><tr><td>L Puntali per micropipetta P10</td><td>STAR</td><td>RST-481LCRST</td><td>Puntali sterili</td></tr><tr><td>per micropipetta P200</td><td>FUKAEKASEI</td><td>1201-705YS</td><td>Puntali sterili</td></tr><tr><td>per micropipetta P1000</td><td>STAR</td><td>RST-4810BRST</td><td>Pipetta monouso sterile</td></tr><tr><td>da 5 mL</td><td>Greiner</td><td>606180</td><td>Pipetta monouso sterile</td></tr><tr><td>da 10 mL</td><td>Greiner</td><td>607180</td><td>Pipetta sterile</td></tr><tr><td>da 25 mL</td><td></td>Ematocitometro sterile <td>Falcon</td><td>357535</td></tr><tr><td></td><td>Sunlead Glass</td><td>A126</td><td>Microscopio Neubeuer migliorato</td></tr><tr><td></td><td>Olympus</td><td>CKX53</td><td></td></tr><tr><td>Piastre da 10 cm</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td>Per coltura tissutale</td></tr><tr><td>Piastre a 6 pozzetti</td><td>AGC Techno Glass</td><td>3810-006</td><td>Per coltura</td></tr> <tr><td>tissutaleMiscelatore a vortice</td><td>Scientific Industries</td><td>Vortex-Genie 2</td><td></td></tr><tr><td>raschiatori cellulari</td><td>Sumitomo bachelite</td><td>MS-93100</td><td></td></tr><tr><td>Provette da 1,5 mL</td><td>STAR</td><td>RSV-MTT1.5</td><td></td></tr><tr><td>Provette da 15 mL</td><td>AGC Techno Glass</td><td>2323-015</td><td></td></tr><tr><td>Provette da 50 mL</td><td>AGC Techno Glass</td><td>2343-050</td><td></td></tr><tr><td>Centrifughe</td><td>TOMY</td><td>MX-307</td><td></td></tr><tr><td>piastre a 96 pozzetti</td><td>Greiner</td><td>655061</td><td>Non per coltura tissutale</td></tr><tr><td>Lettore di piastre</td><td>Molecular Devices</td><td>SpectraMax M2e</td><td></td></tr><tr><td>SDS&ndash; Serbatoi PAGE</td><td>Nihon Eido</td><td>NA-1010</td><td></td></tr><tr><td>Serbatoi di trasferimento</td><td>Nihon</td><td>Eido NA-1510B</td><td></td></tr><tr><td>Piastre in gel (dentellate)</td><td>Nihon Eido</td><td>NA-1000-1</td><td></td></tr><tr><td>Piastre in gel (piatte)</td><td>Nihon Eido</td><td>NA-1000-2</td><td></td></tr><tr><td>Distanziatori in silicone</td><td>Nihon Eido</td><td>NA-1000-16</td><td></td></tr><tr><td>pettini a 17 pozzetti</td><td>Nihon Eido</td><td>Su</td><td></td> misura</tr><tr><td>Clip per legante</td><td>Nihon Eido</td><td>NA-1000-15</td><td></td></tr><tr><td>Siringa da 5 ml</td><td>Terumo</td><td>SS-05SZ</td><td></td></tr><tr><td>21G</td><td>Terumo</td><td>NN-2138R</td><td></td></tr><tr><td>Centrale elettrica 1000 VC</td><td>ATTO</td><td>AE-8450</td><td>Alimentatore per SDS&ndash; PAGINA e trasferimento</td></tr><tr><td>Grandi barche di pesatura</td><td>Ina Optika</td><td>AS-DL</td><td></td></tr><tr><td>Contenitori in plastica</td><td>COME UNA</td><td>VALIGETTA PS N.4</td><td>10 x 80 x 50 mm</td></tr><tr><td>Agitatore a dondolo</td><td>Titech</td><td>NR-10</td><td></td></tr><tr><td>Scatola in schiuma di stirene</td><td>generica</td><td></td><td>Le dimensioni interne devono contenere un serbatoio di trasferimento (200 x 250 x 250 mm).</td></tr><tr><td>ImageQuant LAS-4000</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td>Un imager dotato di una telecamera CCD raffreddata per il rilevamento dell'ECL</td></tr></tbody></table>

rilevamento di fosforilazione di rab10 di lrrk2 attività mediante sds-page con un tag di fosfato-binding

Rab10 Phosphorylation Detection by LRRK2 Activity Using SDS-PAGE with a Phosphate-binding Tag

Mutazioni in leucina-ricche ripetere chinasi 2 (LRRK2) sono state indicate per essere collegati con la malattia del Parkinson familiare (FPD). Poiché l'attivazione anormale di attività della chinasi di LRRK2 è stato implicato nella patogenesi del PD, è essenziale per stabilire un metodo per valutare i livelli fisiologici di attività della chinasi di LRRK2. Studi recenti hanno rivelato che LRRK2 fosforila membri della famiglia Rab GTPase, tra cui Rab10, in condizioni fisiologiche. Anche se la fosforilazione di Rab10 endogeni di LRRK2 in cellule coltivate potrebbe essere rilevata mediante spettrometria di massa, è stato difficile da rilevare a causa della scarsa sensibilità di anticorpi specifici per fosforilazione attualmente disponibili per immunoblotting Rab10. Qui, descriviamo un semplice metodo per rilevare i livelli endogeni di Rab10 fosforilazione di LRRK2 basato su immunoblotting utilizzando elettroforesi dodecilica del sodio solfato del gel di poliacrilammide (SDS-PAGE) combinato con un tag di fosfato-associazione (P-tag), che è N-(5-(2-aminoethylcarbamoyl)pyridin-2-ylmetyl) -N,N',N'- tris (piridin-2-yl-metil) - 1,3 - diaminopropan-2-ol. Il presente protocollo non solo fornisce un esempio della metodologia che utilizza il tag P ma consente anche la valutazione di come le mutazioni così come inibitore trattamento/amministrazione o altri fattori alterano la segnalazione a valle di LRRK2 in cellule e tessuti .

Sistema di sovraespressione: Fosforilazione di HA-Rab10 da 3 × bandiera-LRRK2 in HEK293 celle:
Cellule HEK293 transfected con 0,266 µ g di HA-Rab10 wild-type e 1,066 µ g di 3 × bandiera-LRRK2 (wild-type, chinasi-inattivo mutante (K1906M), o FPD mutanti). Fosforilazione di Rab10 è stata esaminata da tag P. SDS-PAGE seguita da immunoblotting utilizzando un anti-HA anticorpo (Figura 2). 10 µ g di proteine...

Lo studio presente descrive un metodo semplice per rilevare i livelli endogeni di Rab10 fosforilazione dalla leucina-ricche ripetere chinasi 2.

Rilevamento di fosforilazione di Rab10 di LRRK2 attività mediante SDS-PAGE con un Tag di fosfato-binding

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of ...

L'obiettivo generale di questo esperimento è quello di rilevare la fosforilazione di Rab10 da parte di LRRK2 utilizzando SDS-PAGE con un tag di legame con il fosfato. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della ricerca sul Parkinson, come ad esempio il modo in cui le mutazioni della malattia in LRRK2 influenzano la fosforilazione di Rab10. Il vantaggio principale di questa tecnica è che si può avere una stima approssimativa della stechiometria della fosforilazione di Rab10 utilizzando un semplice western blot.Molti dei passaggi di questo protocollo sono abbastanza standard e sono descritti in modo sufficientemente dettagliato dal protocollo di testo che accompagna questo video. Qui, vogliamo mostrarti i passaggi che beneficiano maggiormente dell'istruzione visiva. Preparare piastre di cellule HEK293 trasfettate come descritto nel protocollo di testo.Con le piastre sul ghiaccio, aspirare e scartare il terreno. Quindi, aggiungere con cautela due millilitri di DPBS all'angolo di ciascuna piastra e far oscillare le piastre per distribuire la soluzione. Quindi rimuovere ed eliminare il DPBS.Successivamente, a ciascuna piastra aggiungere 100 microlitri di tampone di lisi. Inclinare la piastra e utilizzare un raschietto per stendere il tampone e rilasciare il lisato cellulare. Aspirare quindi i lisati e trasferirli in provette di microfuge preraffreddate su ghiaccio e attendere 10 minuti.Successivamente, raccogliere i lisati cellulari privi di detriti centrifugando le provette e trasferendo i surnatanti in nuove provette su ghiaccio. Quindi misurare le concentrazioni proteiche dei lisati eliminati utilizzando il saggio di Bradford. Per i dati di concentrazione, preparare campioni da 100 microlitri di lisati per l'analisi su gel.Preparare lisati più densi per misurare la Rab10 endogena rispetto all'emoagglutinina Rab10 sovraespressa. Terminare la preparazione dei campioni incubandoli a 100 gradi Celsius per cinque minuti. Quindi conservare i campioni a una temperatura inferiore a meno 20 gradi Celsius fino al momento del bisogno per un massimo di sei mesi o più.Per iniziare, prepara le celle SDS-PAGE secondo il protocollo di testo. Quindi caricare il gel nel serbatoio e fissarlo con le clip del raccoglitore. Quindi, riempire il serbatoio con il tampone di scorrimento e rimuovere le bolle d'aria nei pozzetti e sotto il gel utilizzando un ago attaccato a una siringa.Ora aggiungi cloruro di manganese ai campioni e centrifugali per rimuovere i precipitati. Quindi caricare il gel con volumi uguali di campione, 10 microgrammi di proteine per analizzare l'emoagglutinina Rab10 sovraespressa o 30 microgrammi di proteine per analizzare Rab10 endogeno. Caricare le corsie vuote con un tampone per campioni contenente cloruro di manganese.Integrare anche il marcatore di peso molecolare con tampone e cloruro di manganese per renderlo dello stesso volume dei campioni. Ora inizia a far funzionare il gel a 50 volt. Dopo la pila di campioni, aumentare la tensione a 120 per ottenere la separazione.Quando il fronte del colorante raggiunge il fondo dei gel, uccidi la tensione. Quindi, lavare il gel tre volte come segue. Caricare il gel di separazione in un bagno di tampone di trasferimento pulito con l'aggiunta di EDTA e SDS.Lasciate poi oscillare su uno shaker per 10 minuti a temperatura ambiente. Dopo tre lavaggi, eseguire un altro lavaggio utilizzando il buffer di trasferimento con l'aggiunta di SDS ma senza EDTA. Quindi trasferire il gel utilizzando un serbatoio umido.Caricare il serbatoio in una scatola di schiuma riempita con acqua ghiacciata, collegare il serbatoio a una presa di corrente e avviare il trasferimento. Un lungo trasferimento con un raffreddamento efficiente è essenziale per la procedura. Dopo il trasferimento, controllare il trasferimento colorando la membrana con Ponceau S, seguito da un lavaggio in TBST secondo il protocollo di testo.Quindi, applica un blocco. Immergere la macchia in TBST lattiginoso e agitare la macchia su uno shaker per un'ora a temperatura ambiente. Quindi rimuovere e scartare la soluzione bloccante e applicare la soluzione di anticorpi primari.Ora fai oscillare la membrana durante la notte a quattro gradi Celsius. Il giorno successivo, rimuovere la soluzione di anticorpi primari. Quindi lavare la membrana con TBST fresco tre volte come prima.Dopo i lavaggi, immergere il blot in una soluzione di anticorpi secondari e incubare la membrana su un bilanciere per circa un'ora a temperatura ambiente. Dopo l'incubazione, lavare nuovamente la membrana con TBST tre volte. Ora sviluppa la membrana.Aggiungere un millilitro di soluzione ECL a un grande foglio di pellicola trasparente. Quindi appoggiare la membrana nell'ECL e capovolgerla rapidamente per bagnare entrambi i lati. Quindi, solleva la membrana e lasciala scolare.Dopo averlo drenato, lascia che un bordo tocchi un tovagliolo di carta per circa cinque secondi per aiutare a rimuovere la soluzione in eccesso. Quindi avvolgere la membrana in una pellicola rigida trasparente senza pieghe e trasferirla in un vassoio nero per l'imaging. Le cellule HEK293 sono state trasfettate con emoagglutinina Rab10 wild-type e 3xFLAG-LRRK2.Sono state testate chinasi wild-type inattive nelle mutazioni familiari di LRRK2 nella malattia di Parkinson. La co-sovraespressione di LRRK2 e Rab10 ha determinato un importante spostamento di banda nel gel P-tag. Al contrario, la co-espressione con un mutante inattivo della chinasi non ha portato a cambiamenti nella mobilità di Rab10, implicando la chinasi come causa dello spostamento della banda.Inoltre, come previsto, le mutazioni familiari del PD hanno tutte aumentato lo spostamento di banda. Il sistema P-tag gel è stato utilizzato anche per analizzare cellule di fibroblasti embrionali albini di topo 3T3-Swiss trattate con un inibitore LRRK2. Lo spostamento di banda corrispondente al Rab10 endogeno fosforilato è scomparso quando le cellule sono state trattate con GSK2578215A.Lo stesso test è stato eseguito anche utilizzando cellule umane A549. In questi esperimenti, l'efficacia dell'inibitore LRRK2 è stata convalidata utilizzando l'anticorpo LRRK2 anti-p serina 935, che è un marcatore ben consolidato dell'inibizione di LRRK2. Una volta padroneggiata, questa tecnica richiede solo 14 minuti in più rispetto a una normale procedura di western blotting che consiste nel lavare i gel prima del trasferimento.Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come la spettrometria di massa per rispondere a ulteriori domande, come ad esempio se i mutanti FPD fosforilano lo stesso residuo di Rab10. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della ricerca sul Parkinson per esplorare i livelli endogeni di fosforilazione di Rab10 nelle cellule in coltura e nei tessuti. Non dimenticare che lavorare con la microcistina aggiunta al tampone di lisi può essere estremamente pericoloso e che durante la preparazione dei lisati cellulari è necessario prendere sempre precauzioni come indossare dispositivi di protezione individuale adeguati.

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Chinasi Ripetere leucina Rich 2 è una chinasi multidominio grande, le cui mutazioni sono la causa genetica più comune della malattia di Parkinson. Analisi delle attività di questa proteina chinasi ha dimostrato di essere uno strumento fondamentale per comprendere la biologia e la disfunzione di questa proteina. In questo...

Saggiare l&#39;attività chinasi di LRRK2 In vitro</em

Questo video mostra una tecnica di quantificazione sensibile della fosforilazione delle proteine utilizzando un saggio di pull-down a singola molecola. La funzionalizzazione del polietilenglicole-biotina e l'uso di anticorpi marcati aumenta la rilevazione della tirosina fosforilata con specificità.

Saggio pull-down a singola molecola per l'analisi della fosforilazione delle proteine: una tecnica ad alto rendimento per quantificare la fosforilazione delle proteine nel lisato cellulare

Leucina ricca chinasi ripetizione 1 e 2 (LRRK1 e LRRK2) sono proteine ​​multidominio che codificano sia GTPase e domini di chinasi e che sono fosforilata nelle cellule. Qui vi presentiamo un protocollo per etichettare LRRK1 e LRRK2 in cellule con 32 P ortofosfato, fornendo così un mezzo per misurare i loro livelli complessivi di fosforilazione cellulare.

Metabolica Etichettatura di leucina Rich Repeat chinasi 1 e 2 con Radioactive fosfato

Qui descriviamo una procedura che permette un'analisi dettagliata dell'attivazione dipendente dalla fosforilazione del fattore di trascrizione IRF3. Ciò si ottiene attraverso la combinazione di una SDS-PAGE ad alta risoluzione e di una PAGE nativa accoppiata a immunoblot utilizzando più anticorpi fosfospecifici.

A High Resolution metodo per monitorare l&#39;attivazione fosforilazione-dipendente di IRF3

I test di concorrenza del peptide sono ampiamente usati in una varietà di esperimenti molecolari ed immunologici. Questo documento descrive un metodo dettagliato per un test in vitro di oligopeptide-concorrenza e le relative procedure di convalida, che possono essere utili per trovare siti specifici di fosforilazione.

Analisi della concorrenza oligopeptide per la determinazione del sito di fosforilazione

Le mutazioni nel gene della leucina ricca di parentesi 2 (LRRK2) causano il morbo di Parkinson ereditario. Abbiamo sviluppato un metodo semplice e robusto per valutare il fosfororylazione controllata da LRRK2 di Rab10 nei neutrofili del sangue periferici umani. Questo può aiutare a identificare gli individui con aumento dell'attività del percorso della chinasi LRRK2.

Isolamento del neutrofilo del sangue periferico umano per interrogare il percorso di LRRK2 Kinase associato al Parkinson valutando Rab10 Phosphorylation

L'obiettivo del presente protocollo è di etichettare, arricchire e identificare i substrati della chinasi di proteina CK2 da un campione biologico complesso come un lysate delle cellule o del tessuto omogeneizzato. Questo metodo sfrutta gli aspetti unici di CK2 biologia per questo scopo.

Identificazione dei substrati di chinasi CK2 romanzo utilizzando un approccio biochimico Versatile

Abbiamo caratterizzato una nuova proteina della chinasi utilizzando robusti approcci biochimici: analisi Western Blot con un anticorpo specifico dedicato su diverse linee cellulari e tessuti, interazioni con esperimenti di coimmunoprecipitazioni, attività della chinasi rilevata da Western Blot utilizzando un anticorpo specifico per ilfosforo e con l'etichettatura ATP di z[32 P].

Caratterizzazione a livello molecolare utilizzando robusti approcci biochimici di una nuova proteina Kinase

Questo protocollo descrive la quantificazione rapida e altamente sensibile di Förster trasferimento di energia di risonanza (FRET) i dati dei sensori utilizzando un analizzatore portatile FRET su misura. Il dispositivo è stato utilizzato per rilevare maltosio in un intervallo di temperatura critica che massimizza sensibilità di rilevamento, consentendo valutazione pratica ed efficiente del contenuto di zucchero.

Altamente sensibile e rapido fluorescenza Detection con un portatile FRET Analyzer

Questo studio descrive le tecniche biofisiche, biochimiche e molecolari per caratterizzare l'attività chaperone di Escherichia coli HdeB in condizioni di pH acido. Questi metodi sono stati applicati con successo per altri accompagnatori acido-protettivi come HdeA e può essere modificato a lavorare per altri accompagnatori e condizioni di stress.

Rilevamento del pH-dipendente attività di<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Chaperone HdeB<em&gt; In Vitro</em&gt; e<em&gt; In Vivo</em

Impara a rilevare la fosforilazione di Rab10 da parte di LRRK2 mediante SDS-PAGE con tag di legame al fosfato. Questo metodo consente di stimare la stechiometria della fosforilazione in cellule HEK293.

Rilevamento di fosforilazione di Rab10 di LRRK2 attività mediante SDS-PAGE con un Tag di fosfato-binding

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