Name: Un protocollo per il monitoraggio in tempo reale 3D singola particella (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Scopri il monitoraggio in tempo reale 3D di singole particelle per la virologia. Questo metodo consente l'osservazione continua di virioni individuali durante l'infezione, migliorando la comprensione dei processi virali.

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Questo lavoro è stato supportato dal National Institute of General Medical Sciences del National Institutes of Health, sotto numero premio R35GM124868 e dalla Duke University.

1. impostare il Layout e l'allineamento
<ol>
	<li>Installazione e collimazione dell'eccitazione rilevamento laser<ol>
		<li>Apporre il laser alla tabella ottico usando un montaggio autocostruite. Il Monte è un piatto semplice in alluminio con fori per la testa del laser e la tabella ottica di montaggio. Il laser deve essere ben fissato a un supporto di metallo per stabilità e dissipazione del calore. Per questo lavoro, è necessario utilizzare un laser a stato solido 488 nm per l'illuminazione (Figura 1), anche se la lunghezza d'onda può essere selezionata per soddisfare un fluoroforo particolare o sperimentare. Un fattore critico è che la lunghezza d'onda laser corrispondono all'intervallo di lavoro 2D-EOD, che è determinata principalmente dalla piastra di onda tra i due deflettori (Figura 1: W2). Il laser di 488 nm efficacemente può eccitare il verde o gialla fluorescente proteine (GFP/YFP), che sono comuni tag fluorescente in esperimenti di cellule vive.</li>
		<li>Regolare l'altezza del fascio laser e la direzione utilizzando una coppia di specchi dielettrici (Figura 1: M). Assicurarsi che il raggio laser è parallelo alla tabella ottica e regolare a un'altezza adeguata. Nota: L'altezza dovrebbe essere scelto sulla base della piattaforma di microscopio. Questa altezza deve essere mantenuta per tutte le successivi specchi utilizzati nel presente protocollo, anche se non sarà esplicitamente indicato.</li>
		<li>Collimare il fascio con un paio di lenti (Figura 1: L1 e L2). Le lunghezze focali delle lenti dovrebbe essere scelta con attenzione per evitare il punto laser ritagliato dal diaframma di 2D-EOD. Ritaglio è evidente da un cambiamento della forma del fascio laser dopo aver attraversato il 2D-EOD. La qualità di collimazione qui è molto importante perché aberrazioni saranno amplificate mediante successivi lenti e qualsiasi divergenza si deteriora le prestazioni della deflessione 2D-EOD. Idealmente, collimare il fascio mettendo a fuoco il fascio a un punto di almeno 20 m di distanza.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Posizionare un foro stenopeico (Figura 1: PH) di dimensioni adeguate al fuoco del primo obiettivo di collimazione (Figura 1: L1).<ol>
		<li>Scegliere un foro stenopeico di dimensione appropriate. La dimensione del foro stenopeico può essere scelto in base al seguente calcolo: 
		<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56711/56711eq1.jpg"> Dove λ è la lunghezza d'onda del laser, f è la lunghezza focale della lente prima, e D è il diametro del fascio di input.</li>
		<li>Montare il foro stenopeico su un palco di traslazione 3D in modo che può essere collocato proprio al centro della prima lente di collimazione.</li>
		<li>Regolare la posizione del foro stenopeico. Inserire un misuratore di potenza laser dopo il foro stenopeico e regolare la posizione del foro stenopeico in XYZ per massimizzare la lettura del misuratore di potenza. Se si osserva un anello di diffrazione, bloccarlo con un iride inserito prima il 2D-EOD.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Installazione di polarizzatore Glan-Thompson<ol>
		<li>Mettere il polarizzatore Glan-Thompson (Figura 1: GP) dopo la seconda lente di collimazione (Figura 1: L2) per pulire la polarizzazione del fascio laser. Ruotare il polarizzatore per trovare la massima trasmissione con il misuratore di potenza.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Installazione di EODs<ol>
		<li>Utilizzare 2 EODs (Figura 1: EOD1 &amp; EOD2) per deviare il laser nelle direzioni X e Y. Massimizzare la trasmissione laser regolando l'imbardata, beccheggio e altezza di ogni EOD.</li>
		<li>Allineare le due EODs rispetto a altro utilizzando il marcatore di allineamento fornito dal produttore sul lato di ogni deflettore.</li>
		<li>Applicare un modello di test al controller di 2D-EOD per esaminare l'output del EOD. Questo può essere tour il cavaliere del (Figura 2) tramite FPGA descritto di seguito o una semplice sinusoide fornita da un generatore di funzioni. Per prestazioni ottimali, la deflessione da ogni deflettore deve essere parallela alla direzione X o Y della nanopositioner piezo. Questa direzione è dettata dalla direzione angolare i deflettori attorno all'asse di trasmissione. Per ruotare la direzione di deflessione senza spostare il 2D-EOD, posizionare un prisma colomba dopo il 2D-EOD per allineare gli assi di flessione per gli assi di nanopositioner piezo.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Installazione della piastra di mezza onda<ol>
		<li>Posizionare un piatto semionda (Figura 1: W1) tra il polarizzatore Glan-Thompson (Figura 1: GP) ed il 2D-EOD per allineare il laser in arrivo polarizzazione del fascio con gli assi di deflessione del 2D-EOD. Posto una lunga focale (300mm) dopo il 2D-EOD e posto una fotocamera sCMOS presso il fuoco del laser. Successivamente, accendere l'EOD 2D per generare tour il cavaliere del descritto di seguito (Figura 2). Ruotare la piastra di mezza onda fino a quando si osserva una distribuzione di laser del quadrato in modo uniforme sulla fotocamera.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Installazione di un fascio spendendo lente coppia e coppia di lente di relè<ol>
		<li>Posto un paio di lenti (Figura 1: L3 e L4) dopo il 2D-EOD per espandere il raggio per riempire l'apertura posteriore dell'obiettivo (Figura 1: OL) e un altro paio di lenti (Figura 1: L5 e L6) per inoltro il piano focale dell'obiettivo del microscopio. Assicuratevi di lasciare abbastanza spazio tra queste due coppie di lenti come la lente di TAG verrà installata tra di loro in un passaggio successivo.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Installare il filtro dicroico, divisore di fascio 10/90, messa a fuoco lente, APD, obiettivo e filtro di emissione di fluorescenza per completare il percorso di rilevamento.<ol>
		<li>Installare il filtro dicroico (Figura 1: DC) per riflettere il laser verso la lente dell'obiettivo. Allineare il laser per andare dritto attraverso il centro della lente dell'obiettivo utilizzando due iridi sulla parte superiore e inferiore di un tubo di obiettivo a lungo.</li>
		<li>Installare un divisore di fascio 10/90 (Figura 1: BS) da cui il 10% della luce è riflessa per l'imaging da un sCMOS fotocamera (descritta sotto) e il 90% di passa attraverso per l'APD per l'inseguimento.</li>
		<li>Allineare l'APD. Mettere a fuoco il laser su un vetrino coprioggetti la lente dell'obiettivo. Utilizzare la riflessione dal coprioggetto per allineare gli elementi tutti a valle mettendo un vetrino coprioggetto al fuoco oggettivo e controllando l'intensità della lettura APD. Dopo il divisore di fascio, installare l'APD lente di messa a fuoco (Figura 1: L7) seguita da APD su un palco di traslazione 3D. Posizionare la lente in modo tale che la riflessione laser dall'obiettivo passa attraverso il centro della lente.</li></ol></li></ol>La posizione di APD può essere ottimizzata regolando la posizione 3D per massimizzare l'intensità dalla riflessione laser sul vetrino coprioggetti. La posizione di APD è nella posizione ottimale quando una mossa della posizione rivelatore in qualsiasi direzione diminuisce l'intensità.
		<li>Installare un filtro di emissione di fluorescenza longpass (Figura 1: F) prima il divisore di fascio per rimuovere la luce riflessa e sparsa.</li>
	
	
	<li>Installazione della lente TAG<ol>
		<li>Posizionare la lente a TAG tra le due coppie di lenti (tra Figura 1: L4 e L5) come accennato prima ed è mostrata nella Figura 1. Regolare l'imbardata, beccheggio, altezza e posizione laterale in modo che il fascio passa perpendicolarmente attraverso la lente del centro di TAG.</li>
	</ol>
	</li>

2. preparazione del campione.
<ol>
	<li>Preparazione delle particelle fisse<ol>
		<li>Diluire 190 perline fluorescenti nm a ~ 5 × 108 perline/mL in PBS. Aggiungere 400 µ l di soluzione di perline su di un vetrino coprioggetto e montare il supporto del campione della fase piezoelettrica (il volume di perline dipenderà molto il portacampioni; il diametro della camera di supporto del campione utilizzato qui è di 18 mm). Per le perline usate qui, PBS fa sì che le particelle a depositare il coprivetrino.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Preparazione delle particelle movimento libero<ol>
		<li>Diluire 110 perline fluorescenti nm a ~ 5 × 108 perline/mL con acqua deionizzata. Aggiungere 400 µ l di soluzione di perline su un vetrino coprioggetto e montare sul supporto del campione della fase piezoelettrica.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. ottimizzare i parametri di verifica dei
<ol>
	<li>Scansione raster fissata particelle<ol>
		<li>Mettere un campione di particelle fisse sul microscopio.</li>
		<li>Accendere il laser, micropositioner controller, controller di nanopositioner di piezo, controllo lenti TAG e controller di EOD. Si noti che l'ordine non è critico. Eseguire il nanopositioner piezo in circuito chiuso.</li>
		<li>Raster esplorare il campione in XYZ utilizzando un programma personalizzato di software scansione (Figura S3, il software disponibile su richiesta da parte degli autori), che spinge il 2D-EOD in tour di un cavaliere (Figura 2), raccoglie i conteggi da APD, spinge il piezo nanopositioner ed esegue il calcolo della posizione (Figura S2). La dimensione del passo è di 40 nm e l'intervallo di scansione è di 2 µm.<ol>
			<li>Per posizionare il vetrino coprioggetto al fuoco dell'obiettivo, rimuovere il filtro di emissione di fluorescenza e utilizzare la riflessione del laser dal coprioggetto per massimizzare l'intensità del segnale in funzione della posizione Z della micropositioner. Dopo aver posizionato il campione al piano focale, riposizionare il filtro di emissione di fluorescenza.</li>
			<li>Aprire il programma di scansione. Impostare l'intervallo di scansione e dimensione del passaggio digitando il numero in 'start', 'fine' e 'passo'. Prima di impostare un grande intervallo di scansione e le dimensioni di passo per individuare una particella (ad esempio, 10 x 10 µm gamma con dimensioni di passaggio 200 nm). Dopo aver trovato la particella, ridurre l'intervallo di scansione e diminuire la dimensione di passaggio (ad esempio, 2 x 2 µm gamma con dimensioni di passo 100 nm). Fare clic sul pulsante 'scansione' per eseguire una scansione 3D raster per trovare la messa a fuoco fluorescente.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Impostazioni di lente di TAG (Vedi anche Figura 3)<ol>
		<li>Scegliere il software di controllo di TAG lente. In sequenza, fare clic su 'connect', 'accendere'.</li>
		<li>Per modificare la fase di uscita dei segnali trigger, è necessario modificare la modalità di trigger di uscita. Prima di cambiare la modalità da 'RGB' a 'Multiplane' e poi cambiare di nuovo. Ora la fase può essere cambiato (Figura 3b).</li>
		<li>Impostare la fase di uscita da 0 °, 90 ° e 270 °. Mentre possono essere utilizzate qualsiasi tre fasi che coprono lo spazio delle fasi, questi tre sono trovati a lavorare bene empiricamente (Figura 3C).</li>
		<li>Selezionare l'impostazione di frequenza Hz 68.500.</li>
		<li>Per trovare la frequenza ottima è spesso necessario cambiare la frequenza di ricerca. Fare clic su 'avanzate', 'impostazioni'. Cambiamento del ' Max. Freq (hertz) ' della colonna 0 da 70.000 Hz a 71.500 Hz. Questo può essere regolato a qualsiasi gamma di frequenza è appropriato. Fare clic su 'Salva calibrazione', 'uscita calibrazione' (figura 3d).</li>
		<li>Per rendere effettiva la nuova taratura, passare la risonanza su un'altra frequenza (ad esempio, 189.150 Hz) e quindi passa l'impostazione di frequenza Hz 68.500 (Figura 3e).</li>
		<li>Modificare l'ampiezza gradualmente al 35%. Fare clic su 'Blocca risonanza'. Dopo la frequenza è bloccata, fare clic su 'Sbloccare risonanza' (Figura 3e). La lente di TAG è pronta per l'uso in questo momento.</li>
		<li>Per calibrare, modificare i parametri che vengono utilizzati nella stima per rendere la posizione stimata uguale alla posizione reale, come mostrato nella Figura 4e, f. Input la scansione intervallo di x, y e z e quindi fare clic su 'scansione' pulsante per esplorare il campione in XYZ per spostare il delle particelle attraverso il movimento spot laser. La posizione della particella come questa viene analizzata attraverso il fuoco del laser deve concordare con la posizione stimata della particella determinata dal ciclo di stima di posizione (Figura S1). Il rapporto tra la posizione stimata e la reale posizione (Figura 4D) possa essere estratti dalle immagini posizione stimata (Figura 4f). Se non si accettano le posizioni, regolare i valori di posizione del laser (ck) utilizzato nel ciclo di stima di posizione (Figura S1).</li>
		<li>Allineare la lente TAG<ol>
			<li>Quando il controllo di lenti di TAG è disattivata, il raster scannerizzate delle particelle (descritta sotto) prelevati prima di installare la lente di TAG e dopo l'installazione prodotto TAG lente dovrebbe essere identico. Successivamente, eseguire dello stack fluorescente particella Z scansione spostando l'obiettivo con il nanopositioner di z per ottimizzare la posizione e l'angolazione dell'obiettivo di TAG (Figura 4). Regolare la posizione della lente TAG finché non ci sarà nessuna deriva nelle immagini delle particelle nel piano XY lungo la direzione Z, che è raggiunta quando non c'è alcun cambiamento nella posizione XY della particella in funzione della posizione Z (Figura 4D). Il sistema di tracciamento è pronto all'uso dopo l'allineamento dell'obiettivo TAG.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Installazione della macchina fotografica di sCMOS per il monitoraggio delle particelle<ol>
		<li>Installare una telecamera sCMOS per visualizzare le particelle mentre che vengono monitorati. Installare il sCMOS solo dopo che tutti i componenti del sistema di rilevamento sono stati installati e ottimizzati.</li></ol></li></ol>Caricare un campione fisso delle particelle fluorescenti sul microscopio ed eseguire il programma di monitoraggio per bloccare una particella nel volume focale obiettivo. Quindi, installare la lente di lunghezza focale 100 mm (Figura 1: L8) e sCMOS. Regolare la posizione di sCMOS in modo che l'immagine della particella è focalizzata sul posto più piccolo e più brillanti.
	
	

4. Real-Time Tracking 3D liberamente diffondere le nanoparticelle
<ol>
	<li>Mettere il 110 nm libero movimento campione di particelle sul microscopio.</li>
	<li>Accendere il laser, micro-posizionatore controller, controller di nanopositioner di piezo, controllo lenti TAG e controller di EOD. Eseguire il nanopositioner piezo in anello aperto. Impostare il software di lente di TAG secondo punto 3.2.</li>
	<li>Aprire ed eseguire il software di monitoraggio (disponibile su richiesta da parte degli autori). Impostare la posizione di parametri di stima i valori ottimizzati, che trovate nella sezione 3.</li>
	<li>Per posizionare il vetrino coprioggetto al fuoco dell'obiettivo, rimuovere il filtro di emissione di fluorescenza e utilizzare la riflessione del laser dal coprioggetto per massimizzare l'intensità del segnale in funzione della posizione Z della micropositioner. Dopo aver trovato il vetrino coprioggetto, aumentare la messa a fuoco posizione 15 µm per mettere a fuoco il laser lontano il vetrino coprioggetto e nella soluzione. Riposizionare il filtro di emissione di fluorescenza.</li>
	<li>Impostare le costanti di controllo integrale. Le costanti di controllo integrale possono essere impostate a partire da un valore basso e aumentando lentamente fino a quando le oscillazioni possono essere visto in letture di posizione della particella. Una volta si osservano oscillazioni, è possibile impostare le costanti di controllo integrale all'80% del valore causando le oscillazioni. Valori tipici sarà di circa 0,012 per il 'guadagno integrale' XY e 0,004 per Z 'guadagno integrale'.</li>
	<li>Impostare le soglie di rilevamento in «Soglia di pista» e «Track minimo» e iniziare l'esperimento di rilevamento facendo clic su 'Cerca' e 'Auto Track'. La soglia per il rilevamento di terminazione è impostata leggermente superiore al livello di sfondo e la soglia per l'innesco di rilevamento è circa due volte superiore rispetto allo sfondo. Qui, la soglia per l'innesco di rilevamento è 3kHz e la soglia per terminare la traiettoria è 1,5 kHz.</li>
</ol>

<ol><li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+%28STORM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nat. Methods. 3 (10), 793-796 (2006).</li>
<li>Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-Dimensional+Super-Resolution+Imaging+by+Stochastic+Optical+Reconstruction+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Three-Dimensional Super-Resolution Imaging by Stochastic Optical Reconstruction Microscopy.</a> Science. 319 (5864), 810-813 (2008).</li>
<li>Jones, S. A., Shim, S. H., He, J., Fast Zhuang, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast%2C+three-dimensional+super-resolution+imaging+of+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Fast, three-dimensional super-resolution imaging of live cells.</a> Nat. Methods. 8 (6), 499-505 (2011).</li>
<li>Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-high+resolution+imaging+by+fluorescence+photoactivation+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy.</a> Biophys. J. 91 (11), 4258-4272 (2006).</li>
<li>Shtengel, G., Galbraith, J. A., Galbraith, C. G., Lippincott-Schwartz, J., Gillette, J. M., Manley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferometric+fluorescent+super-resolution+microscopy+resolves+3D+cellular+ultrastructure%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Interferometric fluorescent super-resolution microscopy resolves 3D cellular ultrastructure.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (9), 3125-3130 (2009).</li>
<li>Betzig, E., Patterson, G. H., Sougrat, R., Lindwasser, O. W., Olenych, S., Bonifacino, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Intracellular+Fluorescent+Proteins+at+Nanometer+Resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at Nanometer Resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li>
<li>Shroff, H., Galbraith, C. G., Galbraith, J. A., Betzig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+photoactivated+localization+microscopy+of+nanoscale+adhesion+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Live-cell photoactivated localization microscopy of nanoscale adhesion dynamics.</a> Nat. Methods. 5 (5), 417(2008).</li>
<li>Shao, L., Kner, P., Rego, E. H., Gustafsson, M. G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+3D+microscopy+of+live+whole+cells+using+structured+illumination%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Super-resolution 3D microscopy of live whole cells using structured illumination.</a> Nat. Methods. 8 (12), 1044(2011).</li>
<li>Kner, P., Chhun, B. B., Griffis, E. R., Winoto, L., Gustafsson, M. G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+video+microscopy+of+live+cells+by+structured+illumination%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Super-resolution video microscopy of live cells by structured illumination.</a> Nat. Methods. 6 (5), 339(2009).</li>
<li>Schermelleh, L., Carlton, P. M., Haase, S., Shao, L., Winoto, L., Kner, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subdiffraction+multicolor+imaging+of+the+nuclear+periphery+with+3D+structured+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Subdiffraction multicolor imaging of the nuclear periphery with 3D structured illumination microscopy.</a> Science. 320 (5881), 1332-1336 (2008).</li>
<li>Gustafsson, M. G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surpassing+the+lateral+resolution+limit+by+a+factor+of+two+using+structured+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy.</a> J. Microsc. 198, 82-87 (2000).</li>
<li>Persson, F., Bingen, P., Staudt, T., Engelhardt, J., Tegenfeldt, J. O., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+Nanoscopy+of+Single+DNA+Molecules+by+Using+Stimulated+Emission+Depletion+%28STED%29%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem%22%5BJournal%5D)">Fluorescence Nanoscopy of Single DNA Molecules by Using Stimulated Emission Depletion (STED).</a> Angew. Chem. 50 (24), 5581-5583 (2011).</li>
<li>Hein, B., Willig, K. I., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulated+emission+depletion+%28STED%29+nanoscopy+of+a+fluorescent+protein-labeled+organelle+inside+a+living+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Stimulated emission depletion (STED) nanoscopy of a fluorescent protein-labeled organelle inside a living cell.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (38), 14271-14276 (2008).</li>
<li>Klar, T. A., Jakobs, S., Dyba, M., Egner, A., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+microscopy+with+diffraction+resolution+barrier+broken+by+stimulated+emission%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Fluorescence microscopy with diffraction resolution barrier broken by stimulated emission.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (15), 8206-8210 (2000).</li>
<li>Welsher, K., Yang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-resolution+3D+visualization+of+the+early+stages+of+cellular+uptake+of+peptide-coated+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Nano%22%5BJournal%5D)">Multi-resolution 3D visualization of the early stages of cellular uptake of peptide-coated nanoparticles.</a> Nat. Nano. 9 (3), 198-203 (2014).</li>
<li>Welsher, K., Yang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+behavior+of+molecules+in+biological+systems%3A+breaking+the+3D+speed+barrier+with+3D+multi-resolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Faraday+Discuss%22%5BJournal%5D)">Imaging the behavior of molecules in biological systems: breaking the 3D speed barrier with 3D multi-resolution microscopy.</a> Faraday Discuss. 184 (0), 359-379 (2015).</li>
<li>Xu, C. S., Cang, H., Montiel, D., Yang, H. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/jp0671796">Rapid and quantitative sizing of nanoparticles using three-dimensional single-particle tracking.</a> J. Phys. Chem. C. 111 (1), 32-35 (2007).</li>
<li>Cang, H., Xu, C. S., Montiel, D., Yang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guiding+a+confocal+microscope+by+single+fluorescent+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Guiding a confocal microscope by single fluorescent nanoparticles.</a> Opt. Lett. 32 (18), 2729-2731 (2007).</li>
<li>Cang, H., Wong, C. M., Xu, C. S., Rizvi, A. H., Yang, H. <a target="_blank" href="http://aip.scitation.org/doi/abs/10.1063/1.2204652">Confocal three dimensional tracking of a single nanoparticle with concurrent spectroscopic readouts.</a> Appl. Phys. Lett. 88 (22), 223901(2006).</li>
<li>Han, J. J., Kiss, C., Bradbury, A. R. M., Werner, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-Resolved%2C+Confocal+Single-Molecule+Tracking+of+Individual+Organic+Dyes+and+Fluorescent+Proteins+in+Three+Dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Time-Resolved, Confocal Single-Molecule Tracking of Individual Organic Dyes and Fluorescent Proteins in Three Dimensions.</a> ACS Nano. 6 (10), 8922-8932 (2012).</li>
<li>Wells, N. P., Lessard, G. A., Goodwin, P. M., Phipps, M. E., Cutler, P. J., Lidke, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-Resolved+Three-Dimensional+Molecular+Tracking+in+Live+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Time-Resolved Three-Dimensional Molecular Tracking in Live Cells.</a> Nano Lett. 10 (11), 4732-4737 (2010).</li>
<li>Lessard, G. A., Goodwin, P. M., Werner, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+tracking+of+individual+quantum+dots%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Phys.+Lett%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional tracking of individual quantum dots.</a> Appl. Phys. Lett. 91 (22), (2007).</li>
<li>McHale, K., Mabuchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intramolecular+Fluorescence+Correlation+Spectroscopy+in+a+Feedback+Tracking+Microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Intramolecular Fluorescence Correlation Spectroscopy in a Feedback Tracking Microscope.</a> Biophys. J. 99 (1), 313-322 (2010).</li>
<li>McHale, K., Mabuchi, H. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ja906979j">Precise Characterization of the Conformation Fluctuations of Freely Diffusing DNA: Beyond Rouse and Zimm.</a> J. Am. Chem. Soc. 131 (49), 17901-17907 (2009).</li>
<li>McHale, K., Berglund, A. J., Mabuchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantum+Dot+Photon+Statistics+Measured+by+Three-Dimensional+Particle+Tracking%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Quantum Dot Photon Statistics Measured by Three-Dimensional Particle Tracking.</a> Nano Lett. 7 (11), 3535-3539 (2007).</li>
<li>Juette, M. F., Bewersdorf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-Dimensional+Tracking+of+Single+Fluorescent+Particles+with+Submillisecond+Temporal+Resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Three-Dimensional Tracking of Single Fluorescent Particles with Submillisecond Temporal Resolution.</a> Nano Lett. 10 (11), 4657-4663 (2010).</li>
<li>Katayama, Y., Burkacky, O., Meyer, M., Bräuchle, C., Gratton, E., Lamb, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-Time+Nanomicroscopy+via+Three-Dimensional+Single-Particle+Tracking%5BTitle%5D)+AND+%22ChemPhysChem%22%5BJournal%5D)">Real-Time Nanomicroscopy via Three-Dimensional Single-Particle Tracking.</a> ChemPhysChem. 10 (14), 2458-2464 (2009).</li>
<li>Perillo, E. P., Liu, Y. -L., Huynh, K., Liu, C., Chou, C. -K., Hung, M. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+and+high-resolution+three-dimensional+tracking+of+single+particles+using+nonlinear+and+multiplexed+illumination%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Deep and high-resolution three-dimensional tracking of single particles using nonlinear and multiplexed illumination.</a> Nat Commun. 6, (2015).</li>
<li>Hou, S., Lang, X., Welsher, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+real-time+3D+single-particle+tracking+using+a+dynamically+moving+laser+spot%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Robust real-time 3D single-particle tracking using a dynamically moving laser spot.</a> Opt. Lett. 42 (12), 2390-2393 (2017).</li>
<li>Chenouard, N., Smal, I., de Chaumont, F., Maska, M., Sbalzarini, I. F., Gong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Objective+comparison+of+particle+tracking+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Objective comparison of particle tracking methods.</a> Nat Meth. 11 (3), 281-289 (2014).</li>
<li>Shechtman, Y., Weiss, L. E., Backer, A. S., Sahl, S. J., Moerner, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+3D+scan-free+multiple-particle+tracking+over+large+axial+ranges+with+Tetrapod+point+spread+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Precise 3D scan-free multiple-particle tracking over large axial ranges with Tetrapod point spread functions.</a> Nano Lett. 15 (6), 4194-4199 (2015).</li>
<li>Lee, H. -lD., Sahl, S. J., Lew, M. D., Moerner, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+double-helix+microscope+super-resolves+extended+biological+structures+by+localizing+single+blinking+molecules+in+three+dimensions+with+nanoscale+precision%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Phys.+Lett%22%5BJournal%5D)">The double-helix microscope super-resolves extended biological structures by localizing single blinking molecules in three dimensions with nanoscale precision.</a> Appl. Phys. Lett. 100 (15), 153701(2012).</li>
<li>Pavani, S. R. P., Thompson, M. A., Biteen, J. S., Lord, S. J., Liu, N., Twieg, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional%2C+single-molecule+fluorescence+imaging+beyond+the+diffraction+limit+by+using+a+double-helix+point+spread+function%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional, single-molecule fluorescence imaging beyond the diffraction limit by using a double-helix point spread function.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (9), 2995-2999 (2009).</li>
<li>Sancataldo, G., Scipioni, L., Ravasenga, T., Lanzanò, L., Diaspro, A., Barberis, A., et al. <a target="_blank" href="https://www.osapublishing.org/optica/abstract.cfm?uri=optica-4-3-367">Three-dimensional multiple-particle tracking with nanometric precision over tunable axial ranges.</a> Optica. 4 (3), 367-373 (2017).</li>
<li>Balzarotti, F., Eilers, Y., Gwosch, K. C., Gynnå, A. H., Westphal, V., Stefani, F. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanometer+resolution+imaging+and+tracking+of+fluorescent+molecules+with+minimal+photon+fluxes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Nanometer resolution imaging and tracking of fluorescent molecules with minimal photon fluxes.</a> Science. 355 (6325), 606(2017).</li>
<li>Duocastella, M., Theriault, C., Arnold, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+particle+tracking+via+tunable+color-encoded+multiplexing%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional particle tracking via tunable color-encoded multiplexing.</a> Opt. Lett. 41 (5), 863-866 (2016).</li>
<li>Duocastella, M., Sun, B., Arnold, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+imaging+of+multiple+focal+planes+for+three-dimensional+microscopy+using+ultra-high-speed+adaptive+optics%5BTitle%5D)+AND+%22BIOMEDO%22%5BJournal%5D)">Simultaneous imaging of multiple focal planes for three-dimensional microscopy using ultra-high-speed adaptive optics.</a> BIOMEDO. 17 (5), (2012).</li>
<li>Mermillod-Blondin, A., McLeod, E., Arnold, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-speed+varifocal+imaging+with+a+tunable+acoustic+gradient+index+of+refraction+lens%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">High-speed varifocal imaging with a tunable acoustic gradient index of refraction lens.</a> Opt. Lett. 33 (18), 2146-2148 (2008).</li>
<li>Wang, Q., Moerner, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+strategy+for+trapping+single+fluorescent+molecules+in+solution+using+the+ABEL+trap%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Phys.+B%22%5BJournal%5D)">Optimal strategy for trapping single fluorescent molecules in solution using the ABEL trap.</a> Appl. Phys. B. 99 (1), 23-30 (2010).</li>
<li>Fields, A. P., Cohen, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+tracking+of+a+Brownian+particle%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Express%22%5BJournal%5D)">Optimal tracking of a Brownian particle.</a> Opt. Express. 20 (20), 22585-22601 (2012).</li>
<li>Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+Nanometer+Localization+Analysis+for+Individual+Fluorescent+Probes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Precise Nanometer Localization Analysis for Individual Fluorescent Probes.</a> Biophys. J. 82 (5), 2775-2783 (2002).</li>
</ol>

Gli autori non dichiarano concorrenti interessi finanziari.

Anche se molte varietà di 3D singola particella metodi di monitoraggio sono emerse negli ultimi anni, robusto tracking in tempo reale di diffusione 3D ad alta velocità al prezzo di conteggio basso del fotone con un semplice programma di installazione è ancora una sfida, che limita la sua applicazione al biologico importante problemi. Il metodo 3D-DyPLoT descritto in questo protocollo indirizzi queste sfide in vari modi. In primo luogo, le vie di eccitazione e di rilevamento vengono semplificate notevolmente rispetto ad a...

L'emergere di tecniche avanzate di imaging ha aperto una finestra per vedere la struttura sempre più dettagliata dei fenomeni cellulari, tutta la strada fino al livello molecolare. Metodi quali stocastici ricostruzione ottica microscopia (tempesta)1,2,3, foto-attivata localizzazione microscopia (PALM)4,5,6,7 , strutturato illuminazione microscopia (SIM)8,9,10,11e stimolato emissione svuotamento microscopia (STED)12,13, 14 vanno ben oltre il limite di diffrazione per consegnare un dettaglio senza precedenti nella struttura e nella funzione delle cellule vive. Tuttavia, la comprensione completa di come questi sistemi si comportano richiede informazioni dinamiche, nonché informazioni strutturali. I metodi di Super-risoluzione sopra elencati implicano un compromesso tra la risoluzione spaziale e temporale ad alta risoluzione, limitando la precisione temporale con cui possono essere sondati processi dinamici. Un metodo che fornisce sia alta precisione spaziale e temporale ad alta risoluzione è RT-3D-SPT15,16,17,18,19,20, 21,22,23,24,25,26,27,28,29. Qui, abbiamo una distinzione tra tradizionale 3D-SPT30 e RT-3D-TSS. tradizionale 3D-SPT richiede semplicemente una serie temporale di dati di immagine tridimensionale (che possono essere acquistati o utilizzando un microscopio confocale o un microscopio a epifluorescenza Data la configurazione giusta). In tradizionale 3D-SPT, le coordinate della particella sono determinate dopo la raccolta dei dati di individuazione della particella in ogni serie di immagini e concatenando le posizioni in volumi successivi a creare una traiettoria. Per questi metodi, l'ultima risoluzione temporale è determinata dal tasso di imaging volumetrico. Per microscopi confocali, questo è facilmente sulla scala dei secondi per decine di secondi. Per i metodi epifluorescenza, in cui il percorso ottico viene manipolato in modo che le informazioni di posizione assiale possono essere estratte, la risoluzione temporale è limitata con il tempo di esposizione o della lettura di fotocamera. Questi metodi di epifluorescente sono limitati nella gamma sopra cui assiale informazioni possono essere raccolte, anche se recenti progressi nella fase di Fourier aereo maschere design e ottica adattiva è allungabile questi intervalli di 10 µm o più31,32 , 33 , 34.
Al contrario, RT-3D-SPT non si basa su l'acquisizione di una serie di immagini 3D e trovare particelle dopo il fatto. Invece, informazioni sulla posizione in tempo reale viene estratta tramite rivelatori di singolo punto e feedback viene applicato in modo efficace "bloccare" la particella nel volume focale della lente dell'obiettivo attraverso l'uso di una fase piezoelettrico highspeed. Questo consente la misura continua della posizione della particella limitata solo da quanti fotoni possono essere raccolti. Inoltre, questo metodo consente spettrale interrogatorio della particella che si muove su lunghi tragitti. RT-3D-SPT in effetti funziona simile a una forza-libero ottica trappola per oggetti su scala nanometrica, in cui la particella è continuamente sondata e misurata in tempo reale senza la necessità di alimentazioni grandi laser o ottico le forze. Dato che RT-3D-SPT fornisce un mezzo per l'interrogatorio continuo di oggetti veloce diffusivo (fino a 20 µm2/s)25,29 in tre dimensioni a basso fotone conteggio tariffe20,29, 35, dovrebbe fornire una finestra in processi biologici veloci o transitori come trasporto cargo intracellulare, legame ligando-recettore e la dinamica extracellulare dei virions singolo. Tuttavia, a questo punto, l'applicazione di RT-3D-SPT è stato limitato per la manciata di gruppi di lavoro per far progredire questa tecnologia.
Una barriera è la complessità del layout ottico richieste dai metodi RT-3D-SPT, che sono di vario tipo. Per la maggior parte dei metodi, il feedback ottico è fornito da una fase piezoelettrica. Come il particella fa piccoli movimenti in X, Y, o Z, letture da singolo punto rilevatori vengono convertite in funzioni di errore e alimentato a ad alta velocità per un nanopositioner piezoelettrico, che a sua volta muove il campione per contrastare efficacemente il movimento della particella, bloccandola rispetto alla lente dell'obiettivo. Per misurare piccoli movimenti posizionali in X, Y e Z, o più rivelatori (4 o 5 a seconda dell'implementazione)15,18,21 o punti multipli dell'eccitazione (2-4, il più basso dei quali può essere applicato se una amplificatore di lock-in è utilizzato per estrarre X e posizione Y utilizzando un rotante laser spot)25,28 vengono applicate. La sovrapposizione di questi punti di rilevamento ed emissione multipli rendono difficile allineare e mantenere i sistemi.
Qui, presentiamo un metodo ad alta velocità 3D destinazione-bloccato-SPT con un design ottico semplificato denominato 3D-DyPLoT29. 3D-DyPLoT utilizza un 2D-EOD e un TAG lente36,37,38 per spostare dinamicamente un punto laser focalizzato attraverso il volume focale obiettivo ad un ritmo elevato (50 kHz XY, 70 kHz Z). La posizione di messa a fuoco del laser e l'orario di arrivo del fotone la combinazione consente la posizione della particella 3D di ottenere rapidamente anche a tassi di conteggio basso del fotone. 2D-EOD spinge il fuoco del laser di un cavaliere tour modello39 con un quadrato di 1 x 1 µm nel piano X-Y e la lente di TAG si sposta il fuoco del laser in direzione assiale con una gamma di 2-4 µm. La posizione di particelle 3D si ottiene con una posizione ottimizzata stima algoritmo29,40 in 3D. Il controllo del 3D in modo dinamico movimento laser spot, fotone contando dal fotodiodo a valanga (APD), calcolo della posizione in tempo reale delle particelle, fase piezoelettrico feedback e registrazione dei dati vengono eseguite su un allineamento di cancello programmabile del campo (FPGA).In questo protocollo, descriviamo come costruire un microscopio 3D-DyPLoT passo dopo passo, compreso l'allineamento ottico, calibrazione con particelle fisse e finalmente libero il rilevamento di particelle. Come dimostrazione, perline fluorescenti di 110 nm sono stati monitorati continuamente in acqua per minuti alla volta.
Il metodo qui descritto è la scelta ideale per qualsiasi applicazione dove si desidera monitorare continuamente una sonda fluorescente veloci a bassi livelli di luce, tra cui virus, nanoparticelle e vescicole come gli endosomi. Contrariamente ai metodi precedenti, c'è solo una singola eccitazione e via sola rilevazione, rendendo semplice l'allineamento e la manutenzione. Inoltre, l'area di rilevamento grande consente questo microscopio raccogliere facilmente diffondere rapidamente le particelle, mentre la possibilità di monitorare a livello di segnale basso (fino a 10 kHz) rende questo metodo ideale per applicazioni di basso-luce29.

<table><tbody><tr><td>Deflettore elettro-ottico 2D&nbsp;</td><td>ConOptics</td><td>M310A</td><td>2 alimentatore richiesto</td></tr><tr><td>per EOD</td><td>ConOptics</td><td>412</td><td>converte l'uscita FPGA in alta tensione per EOD</td></tr><tr><td>TAG&nbsp; Lente</td><td>TAG Ottica</td><td>TAG 2.0</td><td>Utilizzato per deviare il laser lungo la direzione assiale</td></tr><tr><td>XY nanoposizionatore piezoelettrico</td><td>MadCity Labs</td><td>Nano-PDQ275HS</td><td>Utilizzato per spostare il campione per bloccare la particella nel volume focale dell'obiettivo in&nbsp;</td></tr><tr><td>Z piezoelettrico nanoposiitoner</td><td>MadCity Labs</td><td>Nano-OP65HS</td><td>Utilizzato per spostare la lente dell'obiettivo per seguire il</td></tr><tr><td>microposizionatore</td> di particelle diffondenti <td>MadCity Labs</td><td>MicroDrive</td><td>Utilizzato per posizionare grossolanamente il campione e valutare</td></tr><tr><td>l'obiettivo Lente</td><td>dell'obiettivo Zeiss</td><td>PlanApo</td><td>Elevata apertura numerica richiesta per la migliore sensibilità. 100X, 1.49 NA, M27, Zeiss</td></tr><tr><td>sCMOS</td><td>fotocamera PCO</td><td>pco.edge 4.2</td><td>Utilizzato per monitorare la posizione della particella</td></tr><tr><td>APD</td><td>Excelitas</td><td>SPCM-ARQH-15</td><td>Riduzione dei conteggi oscuri vantaggioso</td></tr><tr><td>Array di gate programmabile sul campo</td><td>National Instruments</td><td>NI-7852r</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td>National Instruments</td><td>LabVIEW</td><td></td></tr><tr><td>Laser di eccitazione a tracciamento</td><td>JDSU</td><td>FCD488-30</td><td></td></tr><tr><td>Lens</td><td>ThorLabs</td><td>AC254-150-A-ML</td><td>L1</td></tr><tr><td>Lente</td><td>ThorLabs</td><td>AC254-200-A-ML</td><td>L2</td></tr><tr><td>Pinhole</td><td>ThorLabs</td><td>P75S</td><td>PH</td></tr><tr><td>Glan-Thompson Polarizzatore</td><td>ThorLabs</td><td>GTH5-A</td><td>GT</td></tr><tr><td>Piastra a semionda</td><td>ThorLabs</td><td>WPH05M-488</td><td>WP</td></tr><tr><td>Lente</td><td>ThorLabs</td><td>AC254-75-A-ML</td><td></td></tr><tr><td>L3 Lente</td><td>ThorLabs</td><td>AC254-250-A-ML</td><td>L4</td></tr><tr><td>Lente</td><td>ThorLabs</td><td>AC254-200-A-ML</td><td>L5</td></tr><tr><td>Lente</td><td>ThorLabs</td><td>AC254-200-A-ML</td><td>L6</td></tr><tr><td>Specchio dicroico</td><td>Chroma</td><td>ZT405/488/561/640rpc</td><td></td></tr><tr><td>Filtro di emissione a fluorescenza</td> CC <td>Chroma</td><td>D535/40m</td><td>F</td></tr><tr><td>10/90 beamsplitter</td><td>Chroma</td><td>21012</td><td>BS</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>190 nm nanoparticelle fluorescenti</td><td>Bangs laboratories</td><td>FC02F/9942</td><td></td></tr><tr><td>110 nm nanoparticelle</td><td>fluorescenti Bangs laboratories</td><td>FC02F/10617</td><td></td></tr><tr><td>Vetrino coprioggetti</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545A</td><td></td></tr><tr><td>Powermeter</td><td>Thorlabs</td><td>PM100D</td><td></td></tr><tr><td>CMOS</td><td>Thorlabs</td><td>DCC1545M</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio Iris</td><td>Thorlabs</td><td>SM1D12D</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Mad City Labs</td><td>RM21</td><td></td></tr></tbody></table>

un protocollo per il monitoraggio in tempo reale 3d singola particella

A Protocol for Real-time 3D Single Particle Tracking

Particelle singole tridimensionale in tempo reale (RT-3D-SPT) di rilevamento ha il potenziale per far luce sui processi veloci, 3D in sistemi cellulari. Anche se vari metodi di RT-3D-SPT sono state presentate negli ultimi anni, alta velocità inseguimento 3D diffondente particelle al prezzo di conteggio basso fotone rimane una sfida. Inoltre, configurazioni di RT-3D-SPT sono generalmente complessi e difficili da implementare, limitando la loro diffusa applicazione a problemi biologici. Questo protocollo presenta un sistema di RT-3D-SPT denominato 3D dinamico del fotone localizzazione Tracking (3D-DyPLoT), che permette di monitorare le particelle con diffusiva ad alta velocità (fino a 20 µm2/s) al prezzo di conteggio basso fotone (fino a 10 kHz). 3D-DyPLoT si avvale di un deflettore di elettro-ottica 2D (2D-EOD) e una lente sintonizzabile sfumatura acustica (TAG) all'unità un singolo focalizzato punto dinamicamente in 3D laser. In combinazione con un algoritmo di stima della posizione ottimizzata, 3D-DyPLoT può agganciare di singole particelle con inseguimento ad alta velocità e precisione di localizzazione alta. Grazie alla singola eccitazione e la struttura dei percorsi sola rilevazione, 3D-DyPLoT è robusto e facile da configurare. Questo protocollo viene descritto come costruire 3D-DyPLoT passo per passo. In primo luogo, è descritto il layout ottico. Successivamente, il sistema è calibrato e ottimizzato da raster di scansione una perlina fluorescente di 190 nm con la nanopositioner piezoelettrico. Infine, per dimostrare la capacità di tracciatura in tempo reale 3D, perline fluorescenti di 110 nm sono tracciati in acqua.

Particella fissa scansione (Figura 4) e liberamente diffondente 110 nm fluorescente particella di rilevamento (Figura 5) sono stati effettuati seguendo il protocollo di cui sopra. La particella di scansione è stata eseguita spostando i fotoni piezoelettrici nanopositioner e bin mentre simultaneamente calcolo della particella stimato posizione ad ogni punto nella scansione. L'immagine di scansione mostra un quadrato di intensità a...

Questo dettagli del protocollo la costruzione e il funzionamento di un microscopio di rilevamento in tempo reale 3D singola particella capace di rilevamento su scala nanometrica fluorescente sonde ad alta velocità diffusiva e tassi di conteggio basso del fotone.

Un protocollo per il monitoraggio in tempo reale 3D singola particella

Real-time three-dimensional single particle tracking (RT-3D-SPT) has the potential to shed light on fast, 3D processes in cellular systems. Although ...

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di implementare un microscopio 3D in tempo reale per il tracciamento di singole particelle. Il vantaggio principale di questa tecnica è che un singolo oggetto diffondente su scala nanometrica può essere monitorato continuamente con una risoluzione temporale limitata dai fotoni. Questa tecnica può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della virologia, come seguire un singolo virione attraverso l'intero processo di infezione.Preparare l'apparecchio su un tavolo ottico. Questa configurazione è pronta per la calibrazione. I componenti chiave includono un laser a stato solido a 488 nanometri, due deflettori elettro-ottici che si trovano lungo il percorso del raggio, una lente a gradiente acustico sintonizzabile e uno stadio di campionamento con micro e nano posizionatori.Questo schema della configurazione fornisce ulteriori dettagli. Ecco il percorso del raggio laser verso lo stadio del campione. I deflettori elettro-ottici e la lente acustica sintonizzabile si trovano lungo il percorso del fascio.Questi dispositivi guidano dinamicamente lo spot laser allo stadio di campionamento. I fotoni del campione vengono contati da un fotodiodo a valanga. Una telecamera monitora la posizione della particella.La posizione del campione viene impostata utilizzando micro e nano controllori. Un gate array programmabile sul campo controlla il punto laser, il calcolo della posizione delle particelle in tempo reale, il feedback dello stadio e il conteggio dei fotoni. Devono essere preparati due campioni.Il primo, richiede perle fluorescenti a 190 nanometri diluite in soluzione salina tamponata con fosfato. Utilizzare un vetrino coprioggetto per preparare un campione di particelle fissate. Mettere 400 microlitri della soluzione di perline sul vetrino coprioggetti.Ora, produci il campione di particelle in movimento libero. Richiede perle fluorescenti a 110 nanometri diluite in acqua. Creare un campione di particelle in movimento libero posizionando 400 microlitri della soluzione su un vetrino coprioggetti.Portare il campione di particelle fissate al microscopio per montarlo. Il campione si trova sul posizionatore nano XY. Accendere il laser, il fotorilevatore, i controller per gli elementi della linea del raggio e per i posizionatori.Far funzionare il posizionatore Piezo nano in un circuito chiuso. Quindi, rimuovere il filtro di emissione della fluorescenza davanti al fotorilevatore. Quindi, variare la posizione z del campione con il micro posizionatore.Al variare della posizione, utilizzare il fotorilevatore per monitorare l'intensità della riflessione del laser. Massimizza l'intensità per identificare il piano focale dell'obiettivo. Con il campione sul piano focale, sostituire il filtro di emissione della fluorescenza.Ora, lavora con il software di controllo del computer. Utilizza un software personalizzato per eseguire la scansione raster del campione. Innanzitutto, imposta un ampio intervallo di scansione, la differenza tra l'inizio e la fine.Qui, l'intervallo è di 10 micrometri in Y e 10 micrometri in X.Inoltre, impostare una grande dimensione del passo in ogni direzione. Qui, 200 nanometri. Impostare entrambi i campi Z sulla posizione precedentemente identificata del piano focale.Premendo il pulsante di scansione si avvia la scansione raster. Avviare la scansione. Il software aziona i deflettori elettro-ottici in un tour notturno, raccoglie i conteggi dal fotorilevatore, aziona il nano posizionatore ed esegue calcoli di posizione.La scansione troverà una particella identificabile nel software attraverso una fluorescenza di plata. Per ogni sito della scansione, il software determinerà anche le stime della posizione delle particelle in X e Y, rispetto al centro della scansione del deflettore dell'elettro-oggetto. Dopo aver trovato la particella, ridurre il campo di scansione attorno ad essa a due micrometri in X e Y.Inoltre, diminuire la dimensione del passo per entrambi a 100 nanometri.Aggiungere un intervallo di scansione nella direzione Z di due micrometri per eseguire il bracketing della messa a fuoco fluorescente. Imposta la dimensione del passo Z su 200 nanometri. Avvia la scansione raster 3D per trovare la messa a fuoco fluorescente.I dati prodotti dalla scansione mostrano il piano focale prima dell'accensione della lente a gradiente acustico regolabile. Passa a lavorare con l'impostazione della lente acustica sintonizzabile all'interno del suo software di controllo. Innanzitutto, fai clic su Connetti, quindi accendi.Vai alla sezione di controllo degli impulsi e del gating, cambia la modalità di trigger dell'uscita da RGB a multipiano. Quindi, riportalo a RGB per consentire la modifica della fase di uscita. Utilizzare i cursori per impostare la fase di output tra zero gradi, 90 gradi e 270 gradi.Quindi, vai alla sezione di controllo della frequenza. Lì, seleziona una frequenza di risonanza di 68, 500 hertz. Spostati nella parte superiore dello schermo e fai clic su Avanzate.Quindi, scegli la scheda delle impostazioni. Nella nuova schermata, trova la frequenza massima della colonna zero. Regolarlo per modificare l'intervallo di ricerca della frequenza.Fare clic su, salvare la calibrazione, quindi uscire dalla calibrazione. Torna ai controlli di frequenza e modifica la frequenza di risonanza. Modificarlo immediatamente a 68.500 hertz per rendere effettiva la calibrazione.Nella sezione di controllo dell'ampiezza, usa il cursore per aumentare lentamente l'ampiezza al 35%Successivamente, fai clic su blocca risonanza. Quando la frequenza è bloccata, fare clic su sblocca risonanza. Torna al software di scansione raster.Inserire due intervalli di scansione micrometrica centrati sulla particella in X e Y.Utilizzare una dimensione del passo di 100 nanometri. Centrare la particella in un intervallo di quattro micrometri in Z, con una dimensione del passo di 200 nanometri. Nell'immagine di scansione che ne risulta la regione di illuminazione che rappresenta la particella è larga circa un micrometro.Sulla base di ciò, regolare il parametro della scala XY in modo che le posizioni stimate in X e Y vadano da 0,5 a 0,5 micrometri negativi. Dopo una procedura simile con la scala Z, impostare il posizionatore nano sulla posizione zero. Spegnere il posizionatore nano prima di continuare.Sostituire il campione di particelle fisse con il campione di particelle che si muove liberamente. Quindi, assicurati che tutta l'attrezzatura sia accesa. Esegui il posizionatore Piezo nano in circuito aperto.Al computer, impostare il software della lente sfumata acustica sintonizzabile come prima. Rimuovere il filtro di emissione della fluorescenza dal percorso del fotorilevatore. Trova il piano focale variando la posizione Z del campione e massimizzando l'intensità della riflessione laser, dal vetrino coprioggetto.Dopo aver trovato il piano focale, aumentare la posizione di messa a fuoco di 15 micrometri nella soluzione. Sostituire il filtro di emissione della fluorescenza. Apri il software di tracciamento personalizzato.Impostare i parametri di stima della posizione sui valori trovati durante l'ottimizzazione. Ora, imposta le costanti di controllo integrali, che determinano la velocità di risposta del nano posizionatore. Inizia con la costante X.Immettere un valore basso e aumentarlo lentamente. Quando iniziano le oscillazioni nella lettura della posizione delle particelle, annotare il valore della costante di controllo. Ridurre la costante di controllo integrale a circa il 70% del suo valore all'inizio dell'oscillazione.Ripetere i passaggi con le costanti di controllo Y e Z. Imposta il trigger per iniziare a tracciare la soglia della traccia su tre kilohertz. Imposta il minimo della traccia, il trigger per terminare l'inseguimento, a 1,5 kilohertz.Avvia l'esperimento facendo clic su Cerca e quindi su Rilevamento automatico. Questo filmato mostra il risultato dell'utilizzo del microscopio tridimensionale dinamico per la localizzazione dei fotoni per tracciare il movimento diffusivo di una nanoparticella fluorescente a 110 nanometri in acqua. La posizione della particella, misurata utilizzando la lettura della posizione del nano posizionatore, viene mostrata sugli assi 3D.Il riquadro è la lettura della telecamera scientifica per il muschio marino. Dimostra che la particella è trattenuta, bloccata nel volume focale, dal sistema di tracciamento. La particella è stata tracciata e la sua posizione registrata per più di due minuti.Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in meno di 50 minuti, se il sistema è correttamente allineato e i parametri di calibrazione impostati. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica aiuterà i ricercatori nel campo della somministrazione di farmaci a esplorare le vie di internalizzazione e trasporto del carico cellulare. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare un microscopio 3D a tracciamento di particelle singole a tempo zero.

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Bioingegneria

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