Un protocollo per il monitoraggio in tempo reale 3D singola particella
3 gennaio 2018
Questo dettagli del protocollo la costruzione e il funzionamento di un microscopio di rilevamento in tempo reale 3D singola particella capace di rilevamento su scala nanometrica fluorescente sonde ad alta velocità diffusiva e tassi di conteggio basso del fotone.
L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di implementare un microscopio 3D in tempo reale per il tracciamento di singole particelle. Il vantaggio principale di questa tecnica è che un singolo oggetto diffondente su scala nanometrica può essere monitorato continuamente con una risoluzione temporale limitata dai fotoni. Questa tecnica può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della virologia, come seguire un singolo virione attraverso l'intero processo di infezione.
Preparare l'apparecchio su un tavolo ottico. Questa configurazione è pronta per la calibrazione. I componenti chiave includono un laser a stato solido a 488 nanometri, due deflettori elettro-ottici che si trovano lungo il percorso del raggio, una lente a gradiente acustico sintonizzabile e uno stadio di campionamento con micro e nano posizionatori.
Questo schema della configurazione fornisce ulteriori dettagli. Ecco il percorso del raggio laser verso lo stadio del campione. I deflettori elettro-ottici e la lente acustica sintonizzabile si trovano lungo il percorso del fascio.
Questi dispositivi guidano dinamicamente lo spot laser allo stadio di campionamento. I fotoni del campione vengono contati da un fotodiodo a valanga. Una telecamera monitora la posizione della particella.
La posizione del campione viene impostata utilizzando micro e nano controllori. Un gate array programmabile sul campo controlla il punto laser, il calcolo della posizione delle particelle in tempo reale, il feedback dello stadio e il conteggio dei fotoni. Devono essere preparati due campioni.
Il primo, richiede perle fluorescenti a 190 nanometri diluite in soluzione salina tamponata con fosfato. Utilizzare un vetrino coprioggetto per preparare un campione di particelle fissate. Mettere 400 microlitri della soluzione di perline sul vetrino coprioggetti.
Ora, produci il campione di particelle in movimento libero. Richiede perle fluorescenti a 110 nanometri diluite in acqua. Creare un campione di particelle in movimento libero posizionando 400 microlitri della soluzione su un vetrino coprioggetti.
Portare il campione di particelle fissate al microscopio per montarlo. Il campione si trova sul posizionatore nano XY. Accendere il laser, il fotorilevatore, i controller per gli elementi della linea del raggio e per i posizionatori.
Far funzionare il posizionatore Piezo nano in un circuito chiuso. Quindi, rimuovere il filtro di emissione della fluorescenza davanti al fotorilevatore. Quindi, variare la posizione z del campione con il micro posizionatore.
Al variare della posizione, utilizzare il fotorilevatore per monitorare l'intensità della riflessione del laser. Massimizza l'intensità per identificare il piano focale dell'obiettivo. Con il campione sul piano focale, sostituire il filtro di emissione della fluorescenza.
Ora, lavora con il software di controllo del computer. Utilizza un software personalizzato per eseguire la scansione raster del campione. Innanzitutto, imposta un ampio intervallo di scansione, la differenza tra l'inizio e la fine.
Qui, l'intervallo è di 10 micrometri in Y e 10 micrometri in X.Inoltre, impostare una grande dimensione del passo in ogni direzione. Qui, 200 nanometri. Impostare entrambi i campi Z sulla posizione precedentemente identificata del piano focale.
Premendo il pulsante di scansione si avvia la scansione raster. Avviare la scansione. Il software aziona i deflettori elettro-ottici in un tour notturno, raccoglie i conteggi dal fotorilevatore, aziona il nano posizionatore ed esegue calcoli di posizione.
La scansione troverà una particella identificabile nel software attraverso una fluorescenza di plata. Per ogni sito della scansione, il software determinerà anche le stime della posizione delle particelle in X e Y, rispetto al centro della scansione del deflettore dell'elettro-oggetto. Dopo aver trovato la particella, ridurre il campo di scansione attorno ad essa a due micrometri in X e Y.Inoltre, diminuire la dimensione del passo per entrambi a 100 nanometri.
Aggiungere un intervallo di scansione nella direzione Z di due micrometri per eseguire il bracketing della messa a fuoco fluorescente. Imposta la dimensione del passo Z su 200 nanometri. Avvia la scansione raster 3D per trovare la messa a fuoco fluorescente.
I dati prodotti dalla scansione mostrano il piano focale prima dell'accensione della lente a gradiente acustico regolabile. Passa a lavorare con l'impostazione della lente acustica sintonizzabile all'interno del suo software di controllo. Innanzitutto, fai clic su Connetti, quindi accendi.
Vai alla sezione di controllo degli impulsi e del gating, cambia la modalità di trigger dell'uscita da RGB a multipiano. Quindi, riportalo a RGB per consentire la modifica della fase di uscita. Utilizzare i cursori per impostare la fase di output tra zero gradi, 90 gradi e 270 gradi.
Quindi, vai alla sezione di controllo della frequenza. Lì, seleziona una frequenza di risonanza di 68, 500 hertz. Spostati nella parte superiore dello schermo e fai clic su Avanzate.
Quindi, scegli la scheda delle impostazioni. Nella nuova schermata, trova la frequenza massima della colonna zero. Regolarlo per modificare l'intervallo di ricerca della frequenza.
Fare clic su, salvare la calibrazione, quindi uscire dalla calibrazione. Torna ai controlli di frequenza e modifica la frequenza di risonanza. Modificarlo immediatamente a 68.500 hertz per rendere effettiva la calibrazione.
Nella sezione di controllo dell'ampiezza, usa il cursore per aumentare lentamente l'ampiezza al 35%Successivamente, fai clic su blocca risonanza. Quando la frequenza è bloccata, fare clic su sblocca risonanza. Torna al software di scansione raster.
Inserire due intervalli di scansione micrometrica centrati sulla particella in X e Y.Utilizzare una dimensione del passo di 100 nanometri. Centrare la particella in un intervallo di quattro micrometri in Z, con una dimensione del passo di 200 nanometri. Nell'immagine di scansione che ne risulta la regione di illuminazione che rappresenta la particella è larga circa un micrometro.
Sulla base di ciò, regolare il parametro della scala XY in modo che le posizioni stimate in X e Y vadano da 0,5 a 0,5 micrometri negativi. Dopo una procedura simile con la scala Z, impostare il posizionatore nano sulla posizione zero. Spegnere il posizionatore nano prima di continuare.
Sostituire il campione di particelle fisse con il campione di particelle che si muove liberamente. Quindi, assicurati che tutta l'attrezzatura sia accesa. Esegui il posizionatore Piezo nano in circuito aperto.
Al computer, impostare il software della lente sfumata acustica sintonizzabile come prima. Rimuovere il filtro di emissione della fluorescenza dal percorso del fotorilevatore. Trova il piano focale variando la posizione Z del campione e massimizzando l'intensità della riflessione laser, dal vetrino coprioggetto.
Dopo aver trovato il piano focale, aumentare la posizione di messa a fuoco di 15 micrometri nella soluzione. Sostituire il filtro di emissione della fluorescenza. Apri il software di tracciamento personalizzato.
Impostare i parametri di stima della posizione sui valori trovati durante l'ottimizzazione. Ora, imposta le costanti di controllo integrali, che determinano la velocità di risposta del nano posizionatore. Inizia con la costante X.
Immettere un valore basso e aumentarlo lentamente. Quando iniziano le oscillazioni nella lettura della posizione delle particelle, annotare il valore della costante di controllo. Ridurre la costante di controllo integrale a circa il 70% del suo valore all'inizio dell'oscillazione.
Ripetere i passaggi con le costanti di controllo Y e Z. Imposta il trigger per iniziare a tracciare la soglia della traccia su tre kilohertz. Imposta il minimo della traccia, il trigger per terminare l'inseguimento, a 1,5 kilohertz.
Avvia l'esperimento facendo clic su Cerca e quindi su Rilevamento automatico. Questo filmato mostra il risultato dell'utilizzo del microscopio tridimensionale dinamico per la localizzazione dei fotoni per tracciare il movimento diffusivo di una nanoparticella fluorescente a 110 nanometri in acqua. La posizione della particella, misurata utilizzando la lettura della posizione del nano posizionatore, viene mostrata sugli assi 3D.
Il riquadro è la lettura della telecamera scientifica per il muschio marino. Dimostra che la particella è trattenuta, bloccata nel volume focale, dal sistema di tracciamento. La particella è stata tracciata e la sua posizione registrata per più di due minuti.
Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in meno di 50 minuti, se il sistema è correttamente allineato e i parametri di calibrazione impostati. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica aiuterà i ricercatori nel campo della somministrazione di farmaci a esplorare le vie di internalizzazione e trasporto del carico cellulare. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare un microscopio 3D a tracciamento di particelle singole a tempo zero.
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Panoramica
Questo protocollo descrive l'implementazione di un microscopio per il tracciamento in tempo reale di singole particelle in 3D, progettato per monitorare sonde fluorescenti su scala nanometrica. Questa tecnica consente l'osservazione continua di singoli oggetti diffondenti, anche in condizioni limitate in termini di fotoni.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Microscopia
- Tracciamento di singole particelle
- Virologia
Contesto
- Il monitoraggio in tempo reale di particelle a scala nanometrica è fondamentale in diversi ambiti scientifici.
- Comprendere la dinamica di singoli virioni può fornire informazioni sui processi infettivi.
- Questa tecnica migliora la capacità di studiare particelle a elevate velocità diffusive.
- I limiti nel conteggio dei fotoni sono superati grazie a configurazioni ottiche avanzate.
Scopo dello studio
- Sviluppare un microscopio in grado di tracciare singole particelle in tempo reale.
- Facilitare lo studio delle infezioni virali monitorando singoli virioni.
- Migliorare la risoluzione temporale nel tracciamento di oggetti su scala nanometrica.
Metodi Utilizzati
- Costruzione di un microscopio tridimensionale per il tracciamento di singole particelle.
- Utilizzo di un laser a stato solido a 488 nanometri.
- Incorporazione di deflettori elettro-ottici e di una lente a gradiente acustico regolabile.
- Calibrazione dell'apparato su un tavolo ottico con posizionamento preciso.
Risultati principali
- Il microscopio riesce a tracciare sonde fluorescenti su scala nanometrica.
- Dimostrata capacità di monitorare particelle a bassi tassi di conteggio di fotoni.
- Consentito l'osservazione continua di singoli virioni durante l'infezione.
- Fornito informazioni sui meccanismi dinamici dei processi virali.
Conclusioni
- Questo protocollo stabilisce un metodo robusto per il tracciamento in tempo reale delle particelle.
- Apre nuove strade per la ricerca in virologia e in campi correlati.
- La tecnica può migliorare significativamente la nostra comprensione del comportamento virale.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Il tracciamento in tempo reale di singole particelle in 3D consente il monitoraggio continuo di oggetti su scala nanometrica in condizioni di limitata disponibilità di fotoni, colmando una lacuna fondamentale nell'osservazione di processi cellulari tridimensionali rapidi. Questa capacità supporta la riduzione del rischio meccanicistica nella fase iniziale della scoperta fornendo dati dinamici ad alta risoluzione sulle interazioni molecolari e sui percorsi di traffico intracellulare. Il metodo aumenta la fiducia predittiva nella validazione del bersaglio e nell'identificazione dei composti promettenti, offrendo dati spaziotemporali quantitativi e riproducibili essenziali per prendere decisioni informate di avanzamento o interruzione nella ricerca sul rilascio di farmaci e sulla virologia.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo di Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche monitorando singoli virioni o nanoparticelle durante i processi infettivi con elevata risoluzione spaziotemporale.
- Valore operativo: Fornisce una validazione funzionale delle molecole bersaglio attraverso l'osservazione diretta della dinamica molecolare in ambienti quasi nativi.
- Valore predittivo: Supporta la selezione di portafogli progettuali generando dati quantitativi sulla diffusione, legame e cinetica di trasporto delle particelle in condizioni fisiologicamente rilevanti.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Fornisce misurazioni quantitative di variabili dipendenti (posizione, traiettoria, coefficiente di diffusione) essenziali per la standardizzazione del saggio e la conferma dei risultati positivi.
- Valore operativo: Consente la preparazione di sistemi biologici validati per analisi successive mediante localizzazione e tracciamento precisi in 3D di sonde fluorescenti.
- Scalabilità: Supporta il riutilizzo della piattaforma grazie a una configurazione robusta con singola eccitazione e singola rilevazione, e al controllo calibrato di lenti elettro-ottiche e con gradiente acustico.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità Translazionale: Collega la scoperta al lavoro preclinico consentendo l'osservazione in tempo reale dell'internalizzazione del carico cellulare e dei percorsi di trasporto rilevanti per la somministrazione di farmaci.
- De-risking Meccanicistico: Riduce l'ambiguità nei modelli di ingresso virale e di traffico intracellulare attraverso la visualizzazione diretta del comportamento di singole particelle in soluzione.
- Avanzamento Basato sul Rischio: Orienta le decisioni di proseguimento o interruzione fornendo dati riproducibili e ad alta fedeltà sul comportamento delle nanoparticelle in condizioni di bassa intensità luminosa.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nel percorso di scoperta, dalla verifica delle ipotesi all'identificazione dei composti promettenti fino alla validazione preclinica, in particolare per studi che richiedono una risoluzione dinamica a scala nanometrica in tre dimensioni.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi consentendo il tracciamento continuo di singole particelle nello spazio 3D in condizioni fisiologiche simulate.
- Screening: Migliora la prontezza dei saggi attraverso la localizzazione e il tracciamento riproducibile delle particelle, facilitando la valutazione affidabile di composti o nanoparticelle.
- Analisi: Produce risultati quantitativi (posizione, velocità, confinamento) che permettono un confronto oggettivo tra condizioni sperimentali e candidati terapeutici.
- Ricerca traslazionale: Si collega alla continuità preclinica modellando i percorsi di somministrazione dei farmaci e la dinamica delle infezioni virali in sistemi biologicamente rilevanti.
- Riutilizzo aziendale: Funziona come capacità di piattaforma riutilizzabile grazie alla sua configurazione ottica modulare, al protocollo di calibrazione e all'adattabilità a diversi tipi di campioni e obiettivi di tracciamento.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione degli obiettivi riducendo l'ambiguità meccanicistica nei processi biologici su scala nanometrica.
- Valore operativo: Garantisce standardizzazione e riproducibilità attraverso scansioni raster calibrate, algoritmi di stima della posizione e posizionamento nano-controllato con retroazione.
- Valore strategico: Migliora l'efficienza del capitale e riduce i rischi biologici in fase avanzata, consentendo decisioni precoci basate sui dati riguardo alla farmacabilità dell'obiettivo e alla fattibilità del meccanismo di somministrazione.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione adeguata al rischio grazie a dati quantitativi ad alta risoluzione che informano i criteri di avanzamento nello sviluppo di sistemi di somministrazione di farmaci e di agenti antivirali.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nell'allineamento ottico, nella sicurezza laser e nei sistemi di controllo in tempo reale, inclusi loop di retroazione basati su FPGA.
- Si basa su strumentazione specializzata: laser a stato solido a 488 nm, deflettori elettro-ottici 2D, lente a gradiente acustico accordabile, fotodiodo a valanga e piattaforme di nano-posizionamento.
- Necessita di standardizzazione tra gruppi di lavoro per i protocolli di calibrazione, i parametri di stima della posizione e la taratura della costante di controllo integrale tra utenti e laboratori.
- Comporta considerazioni di adattamento nel passaggio da campioni con perline fisse a particelle in movimento libero in mezzi biologici viscosi o complessi.
- I limiti pratici includono la sensibilità ai tassi di conteggio dei fotoni e la necessità di un'attenta ottimizzazione delle soglie di tracciamento (ad esempio, inizio a 3 kHz, fine a 1,5 kHz) per mantenere il blocco del segnale in condizioni di basso segnale.
