Un protocollo per il monitoraggio in tempo reale 3D singola particella
January 3rd, 2018
Questo dettagli del protocollo la costruzione e il funzionamento di un microscopio di rilevamento in tempo reale 3D singola particella capace di rilevamento su scala nanometrica fluorescente sonde ad alta velocità diffusiva e tassi di conteggio basso del fotone.
L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di implementare un microscopio 3D in tempo reale per il tracciamento di singole particelle. Il vantaggio principale di questa tecnica è che un singolo oggetto diffondente su scala nanometrica può essere monitorato continuamente con una risoluzione temporale limitata dai fotoni. Questa tecnica può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della virologia, come seguire un singolo virione attraverso l'intero processo di infezione.
Preparare l'apparecchio su un tavolo ottico. Questa configurazione è pronta per la calibrazione. I componenti chiave includono un laser a stato solido a 488 nanometri, due deflettori elettro-ottici che si trovano lungo il percorso del raggio, una lente a gradiente acustico sintonizzabile e uno stadio di campionamento con micro e nano posizionatori.
Questo schema della configurazione fornisce ulteriori dettagli. Ecco il percorso del raggio laser verso lo stadio del campione. I deflettori elettro-ottici e la lente acustica sintonizzabile si trovano lungo il percorso del fascio.
Questi dispositivi guidano dinamicamente lo spot laser allo stadio di campionamento. I fotoni del campione vengono contati da un fotodiodo a valanga. Una telecamera monitora la posizione della particella.
La posizione del campione viene impostata utilizzando micro e nano controllori. Un gate array programmabile sul campo controlla il punto laser, il calcolo della posizione delle particelle in tempo reale, il feedback dello stadio e il conteggio dei fotoni. Devono essere preparati due campioni.
Il primo, richiede perle fluorescenti a 190 nanometri diluite in soluzione salina tamponata con fosfato. Utilizzare un vetrino coprioggetto per preparare un campione di particelle fissate. Mettere 400 microlitri della soluzione di perline sul vetrino coprioggetti.
Ora, produci il campione di particelle in movimento libero. Richiede perle fluorescenti a 110 nanometri diluite in acqua. Creare un campione di particelle in movimento libero posizionando 400 microlitri della soluzione su un vetrino coprioggetti.
Portare il campione di particelle fissate al microscopio per montarlo. Il campione si trova sul posizionatore nano XY. Accendere il laser, il fotorilevatore, i controller per gli elementi della linea del raggio e per i posizionatori.
Far funzionare il posizionatore Piezo nano in un circuito chiuso. Quindi, rimuovere il filtro di emissione della fluorescenza davanti al fotorilevatore. Quindi, variare la posizione z del campione con il micro posizionatore.
Al variare della posizione, utilizzare il fotorilevatore per monitorare l'intensità della riflessione del laser. Massimizza l'intensità per identificare il piano focale dell'obiettivo. Con il campione sul piano focale, sostituire il filtro di emissione della fluorescenza.
Ora, lavora con il software di controllo del computer. Utilizza un software personalizzato per eseguire la scansione raster del campione. Innanzitutto, imposta un ampio intervallo di scansione, la differenza tra l'inizio e la fine.
Qui, l'intervallo è di 10 micrometri in Y e 10 micrometri in X.Inoltre, impostare una grande dimensione del passo in ogni direzione. Qui, 200 nanometri. Impostare entrambi i campi Z sulla posizione precedentemente identificata del piano focale.
Premendo il pulsante di scansione si avvia la scansione raster. Avviare la scansione. Il software aziona i deflettori elettro-ottici in un tour notturno, raccoglie i conteggi dal fotorilevatore, aziona il nano posizionatore ed esegue calcoli di posizione.
La scansione troverà una particella identificabile nel software attraverso una fluorescenza di plata. Per ogni sito della scansione, il software determinerà anche le stime della posizione delle particelle in X e Y, rispetto al centro della scansione del deflettore dell'elettro-oggetto. Dopo aver trovato la particella, ridurre il campo di scansione attorno ad essa a due micrometri in X e Y.Inoltre, diminuire la dimensione del passo per entrambi a 100 nanometri.
Aggiungere un intervallo di scansione nella direzione Z di due micrometri per eseguire il bracketing della messa a fuoco fluorescente. Imposta la dimensione del passo Z su 200 nanometri. Avvia la scansione raster 3D per trovare la messa a fuoco fluorescente.
I dati prodotti dalla scansione mostrano il piano focale prima dell'accensione della lente a gradiente acustico regolabile. Passa a lavorare con l'impostazione della lente acustica sintonizzabile all'interno del suo software di controllo. Innanzitutto, fai clic su Connetti, quindi accendi.
Vai alla sezione di controllo degli impulsi e del gating, cambia la modalità di trigger dell'uscita da RGB a multipiano. Quindi, riportalo a RGB per consentire la modifica della fase di uscita. Utilizzare i cursori per impostare la fase di output tra zero gradi, 90 gradi e 270 gradi.
Quindi, vai alla sezione di controllo della frequenza. Lì, seleziona una frequenza di risonanza di 68, 500 hertz. Spostati nella parte superiore dello schermo e fai clic su Avanzate.
Quindi, scegli la scheda delle impostazioni. Nella nuova schermata, trova la frequenza massima della colonna zero. Regolarlo per modificare l'intervallo di ricerca della frequenza.
Fare clic su, salvare la calibrazione, quindi uscire dalla calibrazione. Torna ai controlli di frequenza e modifica la frequenza di risonanza. Modificarlo immediatamente a 68.500 hertz per rendere effettiva la calibrazione.
Nella sezione di controllo dell'ampiezza, usa il cursore per aumentare lentamente l'ampiezza al 35%Successivamente, fai clic su blocca risonanza. Quando la frequenza è bloccata, fare clic su sblocca risonanza. Torna al software di scansione raster.
Inserire due intervalli di scansione micrometrica centrati sulla particella in X e Y.Utilizzare una dimensione del passo di 100 nanometri. Centrare la particella in un intervallo di quattro micrometri in Z, con una dimensione del passo di 200 nanometri. Nell'immagine di scansione che ne risulta la regione di illuminazione che rappresenta la particella è larga circa un micrometro.
Sulla base di ciò, regolare il parametro della scala XY in modo che le posizioni stimate in X e Y vadano da 0,5 a 0,5 micrometri negativi. Dopo una procedura simile con la scala Z, impostare il posizionatore nano sulla posizione zero. Spegnere il posizionatore nano prima di continuare.
Sostituire il campione di particelle fisse con il campione di particelle che si muove liberamente. Quindi, assicurati che tutta l'attrezzatura sia accesa. Esegui il posizionatore Piezo nano in circuito aperto.
Al computer, impostare il software della lente sfumata acustica sintonizzabile come prima. Rimuovere il filtro di emissione della fluorescenza dal percorso del fotorilevatore. Trova il piano focale variando la posizione Z del campione e massimizzando l'intensità della riflessione laser, dal vetrino coprioggetto.
Dopo aver trovato il piano focale, aumentare la posizione di messa a fuoco di 15 micrometri nella soluzione. Sostituire il filtro di emissione della fluorescenza. Apri il software di tracciamento personalizzato.
Impostare i parametri di stima della posizione sui valori trovati durante l'ottimizzazione. Ora, imposta le costanti di controllo integrali, che determinano la velocità di risposta del nano posizionatore. Inizia con la costante X.
Immettere un valore basso e aumentarlo lentamente. Quando iniziano le oscillazioni nella lettura della posizione delle particelle, annotare il valore della costante di controllo. Ridurre la costante di controllo integrale a circa il 70% del suo valore all'inizio dell'oscillazione.
Ripetere i passaggi con le costanti di controllo Y e Z. Imposta il trigger per iniziare a tracciare la soglia della traccia su tre kilohertz. Imposta il minimo della traccia, il trigger per terminare l'inseguimento, a 1,5 kilohertz.
Avvia l'esperimento facendo clic su Cerca e quindi su Rilevamento automatico. Questo filmato mostra il risultato dell'utilizzo del microscopio tridimensionale dinamico per la localizzazione dei fotoni per tracciare il movimento diffusivo di una nanoparticella fluorescente a 110 nanometri in acqua. La posizione della particella, misurata utilizzando la lettura della posizione del nano posizionatore, viene mostrata sugli assi 3D.
Il riquadro è la lettura della telecamera scientifica per il muschio marino. Dimostra che la particella è trattenuta, bloccata nel volume focale, dal sistema di tracciamento. La particella è stata tracciata e la sua posizione registrata per più di due minuti.
Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in meno di 50 minuti, se il sistema è correttamente allineato e i parametri di calibrazione impostati. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica aiuterà i ricercatori nel campo della somministrazione di farmaci a esplorare le vie di internalizzazione e trasporto del carico cellulare. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare un microscopio 3D a tracciamento di particelle singole a tempo zero.
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Panoramica
Questo protocollo descrive l'implementazione di un microscopio di tracciamento di particelle singole in 3D in tempo reale progettato per monitorare sonde fluorescenti su scala nanometrica. Questa tecnica consente l'osservazione continua di singoli oggetti diffusivi, anche in condizioni limitate da fotoni.
Componenti principali dello studio
Area della scienza
- Microscopia
- Tracciamento di particelle singole
- Virologia
Sfondo
- Il tracciamento in tempo reale di particelle su scala nanometrica è cruciale in vari campi scientifici.
- Comprendere le dinamiche di singoli virioni può fornire informazioni sui processi di infezione.
- Questa tecnica migliora la capacità di studiare particelle ad alte velocità di diffusione.
- I limiti del conteggio dei fotoni sono affrontati attraverso setup ottici avanzati.
Obiettivo dello studio
- Sviluppare un microscopio in grado di tracciare particelle singole in tempo reale.
- Facilitare lo studio delle infezioni virali monitorando singoli virioni.
- Migliorare la risoluzione temporale del tracciamento di oggetti su scala nanometrica.
Metodi utilizzati
- Costruzione di un microscopio di tracciamento di particelle singole in 3D.
- Utilizzo di un laser a stato solido da 488 nanometri.
- Incorporazione di deflettори elettro-ottici e una lente acustica gradiente regolabile.
- Calibrazione dell'apparato su un tavolo ottico con posizionamento preciso.
Risultati principali
- Il microscopio traccia con successo sonde fluorescenti su scala nanometrica.
- Capacità dimostrata di monitorare particelle a bassi tassi di conteggio dei fotoni.
- Ha permesso l'osservazione continua di singoli virioni durante l'infezione.
- Ha fornito informazioni sulle dinamiche dei processi virali.
Conclusioni
- Questo protocollo stabilisce un metodo robusto per il tracciamento di particelle in tempo reale.
- Apri nuove strade per la ricerca in virologia e campi correlati.
- La tecnica può migliorare significativamente la nostra comprensione del comportamento virale.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Real-time 3D single particle tracking enables continuous monitoring of nanoscale objects under photon-limited conditions, addressing a critical gap in observing fast, three-dimensional cellular processes. This capability supports mechanistic de-risking in early discovery by providing high-resolution dynamic data on molecular interactions and trafficking pathways. The method enhances predictive confidence in target validation and lead identification by delivering quantitative, reproducible spatiotemporal data essential for informed go/no-go decisions in drug delivery and virology research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by tracking single virions or nanoparticles through infection processes with high spatiotemporal resolution.
- Operational Value: Provides functional target validation through direct observation of molecular dynamics in near-native environments.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by generating quantitative data on particle diffusion, binding, and transport kinetics under physiologically relevant conditions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers quantitative dependent variable measurements (position, trajectory, diffusion coefficient) essential for assay standardization and hit confirmation.
- Operational Value: Enables preparation of validated biological systems for downstream screening via precise 3D localization and tracking of fluorescent probes.
- Scalability: Supports platform reuse through robust single-excitation/single-detection layout and calibrated electro-optic and acoustic gradient lens control.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical work by enabling real-time observation of cellular cargo internalization and transport pathways relevant to drug delivery.
- Mechanistic De-risking: Reduces ambiguity in viral entry and intracellular trafficking models through direct visualization of single-particle behavior in solution.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by providing reproducible, high-fidelity data on nanoparticle behavior under low photon flux conditions.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from hypothesis testing through lead identification to preclinical validation, particularly for studies requiring dynamic, nanoscale resolution in three dimensions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling continuous tracking of single particles in 3D space under physiological mimicry.
- Screening: Enhances assay readiness through reproducible particle localization and tracking, facilitating reliable compound or nanoparticle evaluation.
- Analytics: Generates quantitative outputs (position, velocity, confinement) that allow objective comparison of experimental conditions and therapeutic candidates.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by modeling drug delivery pathways and viral infection dynamics in biologically relevant systems.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform capability due to its modular optical layout, calibration protocol, and adaptability to different sample types and tracking objectives.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in nanoscale biological processes.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through calibrated raster scanning, position estimation algorithms, and feedback-controlled nano-positioning.
- Strategic Value: Improves capital efficiency and reduces late-stage biological risk by enabling early, data-driven decisions on target druggability and delivery mechanism feasibility.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization through quantitative, high-resolution tracking data that inform advancement criteria in drug delivery and antiviral development.
Implementation Considerations
- Requires expertise in optical alignment, laser safety, and real-time control systems including FPGA-based feedback loops.
- Depends on specialized instrumentation: 488 nm solid-state laser, 2D electro-optic deflectors, tunable acoustic gradient lens, avalanche photodiode, and nano-positioning stages.
- Necessitates cross-team standardization for calibration protocols, position estimation parameters, and integral control constant tuning across users and labs.
- Involves adaptation considerations when transitioning from fixed bead samples to freely moving particles in viscous or complex biological media.
- Practical limitations include sensitivity to photon count rates and the need for careful optimization of tracking thresholds (e.g., 3 kHz start, 1.5 kHz end) to maintain lock-on under low-signal conditions.
