Visualizzazione della formazione di Biofilm in Candida albicans utilizzando un dispositivo microfluidico automatizzato
14 dicembre 2017
Questo protocollo descrive l'uso di un dispositivo microfluidico automatico personalizzabile per visualizzare la formazione di biofilm in Candida albicans in condizioni fisiologiche host.
L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di visualizzare la formazione del biofilm di Candida albicans in tempo reale in condizioni fisiologiche dell'ospite. Questo metodo consente di osservare la formazione di biofilm mentre si sviluppa in tempo reale e può essere utilizzato per testare l'efficacia di agenti antimicrobici o per valutare mutanti genetici. Questa tecnica può essere utilizzata per lo screening di potenziali terapie per l'attività contro i biofilm in modo ad alto rendimento e la loro efficacia può essere misurata, visualizzata e confrontata con i trattamenti attuali.
Il vantaggio principale di questa tecnica è che può essere utilizzata per analizzare la formazione di biofilm in diverse condizioni che sono di interesse per i ricercatori. Sebbene questo metodo sia stato sviluppato specificamente per studiare la formazione di biofilm di Candida albicans, può essere applicato anche ad altri microrganismi che formano biofilm, comprese altre specie fungine e batteri. Per iniziare, preparare colture di singole colonie di diversi ceppi di C. albicans da cellule piastrate su estratto di lievito, peptone, destrosio o YPD medium agar seguendo pratiche microbiologiche standard.
Quindi, accendi il sistema microfluidico che include il controller, le due unità di alimentazione, il microscopio, la fotocamera e il computer collegati al sistema. Una volta caricato il computer, apri il software che controlla il sistema. Individuare il numero del codice a barre della lastra in uso e inserire il numero quando richiesto dal software.
Quindi, nel modulo di controllo, impostare la temperatura del sistema microfluidico a 37 gradi Celsius. Quindi, fare clic sui pozzetti di ingresso I1, I7, I13 e I19 e far fluire aria sterile attraverso i tubi della piastra di interfaccia per cinque minuti per rimuovere la condensa. Quando tutta la condensa evapora, posizionare la piastra microfluidica dyne 0-20 a 48 pozzetti sul tavolino del microscopio.
Per un esperimento di formazione di biofilm di 12 ore, iniziare aggiungendo 600 microlitri di terreno preriscaldato ai pozzetti di ingresso. Abbassare lentamente la piastra di interfaccia pulita sopra la piastra microfluidica a 48 pozzetti. Quindi far scorrere leggermente la piastra di interfaccia verso sinistra fino a quando i tubi non sono posizionati sopra i pozzetti di ingresso e uscita e sono bloccati in posizione.
Nella sezione di controllo del taglio del software, impostare la modalità di flusso su costante e impostare il taglio massimo su un dyne per centimetro quadrato. Quindi fare clic sui pozzetti di ingresso con il fluido per iniziare il flusso del fluido dall'ingresso ai pozzi di uscita al fine di adescare il canale. Dopo cinque minuti di flusso, fare clic sul pulsante di arresto nella sezione di controllo della piastra a pozzetti del software.
Quindi rimuovere la piastra di interfaccia e osservare i pozzetti della piastra microfluidica. Solo una piccola goccia di fluido dovrebbe essere visibile nei pozzetti di uscita. Per testare i ceppi di C. albicans wild-type e mutanti, aggiungere 50 microlitri di coltura cellulare SC5314 wild-type in terreni di ragno a due pozzetti di uscita, aggiungere il mutante bcr1 in terreni di ragno a due pozzetti di uscita e aggiungere il mutante EFG1 in terreni di ragno a due pozzetti di uscita.
Riposizionare la piastra di interfaccia sulla piastra microfluidica e bloccare il coperchio in posizione. Tornando alla sezione di controllo del taglio del software, impostare la modalità di flusso su costante e impostare il taglio massimo su due dyne per centimetro quadrato. Fare clic sui pozzetti di uscita con le celle per iniziare il flusso di terreno dai pozzi di uscita a quelli di ingresso per iniziare la semina di C.albicans.
Dopo tre secondi, fare clic sul pulsante di arresto nella sezione di controllo della piastra del pozzetto per evitare che le celle entrino nei pozzetti di ingresso. Lasciare che le cellule rimangano ferme senza flusso per 10-20 minuti nel canale di visualizzazione per l'adesione iniziale delle cellule. Nella finestra del modulo di imaging, aprire il modulo di acquisizione multidimensionale e fare clic sulla scheda stage nel menu a sinistra.
Nella sezione dello stadio, caricare l'elenco degli stadi master per la piastra microfluidica dyne 0-20 a 48 pozzetti. Quindi, aprire la regolazione della ricarica del campione e spostare il tavolino sui moduli di posizione assoluta. Nel modulo di regolazione della ricarica del campione, premere il pulsante live per visualizzare un'anteprima dell'immagine con il mirino.
Utilizzando il joystick, posizionare la piastra del pozzetto in modo che la punta della freccia adiacente al canale di visualizzazione quattro sia allineata con il mirino sul software. Quindi vai al menu di spostamento della fase in posizione assoluta e premi il pulsante di impostazione dell'origine. Quindi, torna al modulo di regolazione della ricarica del campione, fai clic sulla sezione del punto di riferimento iniziale nel menu a sinistra e carica il file per la piastra microfluidica dyne 0-20 a 48 pozzetti.
Nella sezione del tavolino del modulo di acquisizione multidimensionale, fare doppio clic sulla posizione del tavolino 22.2 per portare il tavolino di visualizzazione del microscopio e la messa a fuoco della telecamera in prossimità dell'indicatore della freccia tramite il canale di visualizzazione 22. Quindi utilizzare il joystick per posizionare la piastra del pozzetto in modo tale che la punta della freccia adiacente al canale di visualizzazione 22 si allinei con il mirino. Copiare la coordinata Y nel modulo di acquisizione multidimensionale nella posizione Y di.
2 nella scheda Aggiorna punti di riferimento del modulo di regolazione della ricarica del campione. Infine, nella scheda di aggiornamento delle posizioni delle fasi del modulo di regolazione della ricarica dei campioni, fare clic su applica all'elenco delle fasi MDA. Nella finestra del modulo di imaging, utilizzare il modulo di ripresa multidimensionale e fare clic sulla scheda Salva nel menu a sinistra.
Quindi seleziona il nome del file per l'esperimento e la cartella in cui archiviare le immagini acquisite sul computer. Quindi, fai clic sulla scheda timelapse e impostala per acquisire 145 immagini totali cinque minuti tra ogni immagine. Quindi, nella scheda Lunghezze d'onda, impostare il numero di lunghezze d'onda su uno e acquisire al 50% di campo chiaro e al 50% della fotocamera con un tempo di esposizione di 12-20 millisecondi.
Imposta il guadagno su 0,6 e il digitalizzatore su 20 milliHertz. Dopo aver impostato la messa a fuoco come descritto nel protocollo di testo allegato, selezionare acquisisci per iniziare a catturare immagini pre-lavaggio delle cellule aderenti per tutti i sottostadi. Nella sezione di controllo del taglio, impostare la modalità di flusso su costante e il taglio massimo su un dyne per centimetro quadrato.
Quindi fare clic sui pozzetti di ingresso per iniziare il flusso di fluidi dai pozzetti di ingresso a quelli di uscita al fine di rimuovere eventuali cellule non aderenti. Dopo cinque minuti, fare clic sul pulsante di arresto nella sezione di controllo della piastra a pozzetti. Consentire l'acquisizione di un secondo ciclo di immagini e poi, nella sezione di controllo del taglio, regolare il flusso di taglio massimo a 0,5 dyne per centimetro quadrato e confermare la modifica.
Nella finestra del modulo di imaging, selezionare la scheda degli strumenti di analisi e fare clic su Rivedi dati multidimensionali dal menu a discesa. Quindi fare clic su seleziona file di base. Si aprirà la finestra delle utilità del set di dati multidimensionale.
Quindi, fai clic sul pulsante Seleziona directory e scegli la cartella utilizzata per salvare l'esperimento. Nell'elenco dei set di dati, seleziona il log del file dell'esperimento. Una volta caricato il registro, fare clic sul pulsante Visualizza.
Seleziona la lunghezza d'onda facendo clic sulle opzioni nel menu delle lunghezze d'onda a sinistra e scegli la posizione del palco da visualizzare da un menu a discesa. Scegli l'immagine da caricare tra i numeri nella parte superiore del modulo facendo clic con il pulsante destro del mouse sul numero dell'immagine. Quindi seleziona tutte le immagini per realizzare un video timelapse.
Le immagini selezionate si apriranno come video in una nuova finestra. Fare clic sulla scheda file nella finestra del modulo di imaging e scegliere Salva con nome dal menu a discesa. Salva il video risultante come formato di file predefinito.
Infine, apri e carica il file video salvato nell'immagine J.In immagine J, fai clic sulla scheda del file e quindi fai clic su Salva con nome. Scegli AVI dal menu a discesa e converti il file in un file AVI utilizzando la conversione JPEG impostata su 10 fotogrammi al secondo. In condizioni wild-type in terreni RPMI 1640, diverse celle hanno aderito fortemente al canale.
Formano ife e si può osservare uno spesso biofilm con ife intercalanti e cellule di lievito. Verso la fine dell'esperimento microfluidico, il biofilm wild-type riempie completamente questo canale di visualizzazione. La presenza di amfotericina B, tuttavia, ha un effetto pronunciato sulla riduzione della formazione di biofilm.
In particolare, l'aderenza delle cellule è diminuita e si possono vedere diverse cellule che fluiscono via con il flusso di taglio del mezzo. Le cellule di controllo wild-type, questa volta cresciute in terreni di ragno, hanno formato un biofilm simile a quello appena mostrato crescere in RPMI. In questo terreno sono cresciuti anche due mutanti difettosi del biofilm.
Entrambi i ceppi mostrano una formazione di biofilm gravemente ridotta rispetto al controllo. In questa popolazione cellulare, le cellule aderenti non formano ife e il biofilm risultante è gravemente difettoso. Quest'altro ceppo è difettoso sia nella formazione del biofilm che nella sua capacità di aderire al canale.
Una volta padroneggiato, questo esperimento può essere impostato in meno di un'ora. Utilizzando questo metodo, si può imparare molto su una serie di aspetti diversi della formazione del biofilm, tra cui l'adesione iniziale delle cellule, la maturazione del biofilm e la dispersione cellulare. Questo protocollo è altamente personalizzabile e versatile.
Può essere regolato per valutare diverse specie microbiche nei vari regni. Le portate, le temperature, i tempi di incubazione e i terreni possono essere utilizzati anche per studiare i biofilm di specie miste. Consigliamo vivamente questo test del biofilm microfluidico come test in vitro da utilizzare prima dei test sugli animali in vivo.
Nella nostra esperienza, i risultati di questo test si correlano molto bene con i saggi di biofilm in vivo esistenti.
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Panoramica
Questo protocollo descrive un metodo per visualizzare in tempo reale la formazione di biofilm da parte di Candida albicans in condizioni fisiologiche dell'ospite. La tecnica consente la valutazione dell'efficacia antimicrobica e dei mutanti genetici.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Microbiologia
- Micologia
- Ricerca sui biofilm
Sfondo
- I biofilm sono comunità complesse di microrganismi.
- Candida albicans è un patogeno fungino comune.
- Comprendere la formazione dei biofilm è fondamentale per lo sviluppo di trattamenti.
- Questo metodo può essere adattato per diversi microrganismi.
Scopo dello studio
- Visualizzare la formazione del biofilm in tempo reale.
- Verificare l'efficacia di agenti antimicrobici.
- Valutare mutanti genetici di Candida albicans.
Metodi Utilizzati
- Preparazione di colture da singola colonia su mezzo YPD.
- Utilizzo di un dispositivo microfluidico automatizzato personalizzabile.
- Osservazione in tempo reale dello sviluppo del biofilm.
- Screening ad alto rendimento per terapie potenziali.
Risultati principali
- Visualizzazione in tempo reale della formazione del biofilm.
- Capacità di confrontare l'efficacia dei trattamenti.
- Applicazione ad altri microrganismi formatori di biofilm.
- Metodo versatile adattabile a diverse condizioni sperimentali.
Conclusioni
- Questo metodo fornisce informazioni sulle dinamiche dei biofilm.
- Può contribuire allo sviluppo di nuove terapie antifungine.
- Potenzialità per applicazioni più ampie nella ricerca microbiologica.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La visualizzazione in tempo reale della formazione del biofilm in condizioni di flusso fisiologicamente rilevanti colma un'importante lacuna nella validazione di bersagli antifungini, consentendo una riduzione del rischio meccanicistica dei percorsi di virulenza. Questo approccio aumenta la fiducia predittiva nell'identificazione dei composti promettenti, collegando perturbazioni genetiche o farmacologiche a fenotipi dinamici del biofilm. Il metodo migliora la continuità traslazionale dalla fase di scoperta alla valutazione preclinica, fornendo letture quantitative e riproducibili per decisioni di avanzamento o interruzione del progetto.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Permette l'analisi di ipotesi terapeutiche visualizzando in tempo reale la dinamica dello sviluppo del biofilm sotto stress di taglio controllato.
- Valore scientifico: Supporta la validazione funzionale di bersagli confrontando la formazione del biofilm tra ceppi di tipo selvatico e mutanti genetici come bcr1 ed EFG1.
- Valore operativo: Facilita la standardizzazione dei saggi mediante controllo microfluidico automatizzato di temperatura, portata e composizione del mezzo.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera dati quantitativi di imaging a intervalli temporali per valutare gli effetti antimicrobici, come l'inibizione del biofilm mediata da anfotericina B.
- Valore operativo: Consente lo screening ad alto rendimento di potenziali terapie mediante metriche riproducibili di formazione del biofilm in condizioni di flusso laminare.
- Valore operativo: Permette l'adattamento del saggio a diverse specie microbiche, inclusi batteri e altri funghi, ampliando l'utilizzo della piattaforma.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Fornisce informazioni rilevanti per le malattie simulando le condizioni dell'ospite riscontrate nei cateteri vascolari e negli strati mucosi.
- Valore operativo: Offre una valutazione predittiva per la riduzione dei rischi correlando la dinamica del biofilm in vitro con risultati consolidati di saggi in vivo.
- Valore strategico: Guida le decisioni di avanzamento con adeguamento del rischio identificando mutanti difettosi nel biofilm o composti con attività inibitoria.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il saggio di biofilm microfluidico si integra nel percorso di scoperta, dalla validazione del bersaglio all'identificazione del capostazione fino al supporto preclinico, consentendo cicli iterativi di progettazione, produzione e test.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi sui fattori di virulenza mediante la visualizzazione della formazione di ife e dello sviluppo della matrice intercellulare nel tempo.
- Screening: Garantisce la prontezza del saggio attraverso l'acquisizione standardizzata di immagini e la generazione di video in time-lapse per analisi comparative.
- Analisi: Permette il confronto quantitativo dell'architettura del biofilm, dell'adesione e della dispersione in condizioni variabili di stress di taglio ed esposizione a farmaci.
- Ricerca traslazionale: Collega i risultati della scoperta alla continuità preclinica modellando la formazione del biofilm su superfici abiotiche rilevanti per dispositivi medici.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per lo screening di composti antifungini e antibiofilm in diversi ambiti terapeutici.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione degli obiettivi riducendo l'ambiguità meccanicistica nei percorsi di formazione del biofilm.
- Valore operativo: Migliora la riproducibilità e la scalabilità grazie al controllo automatizzato dei flussi e a protocolli di imaging standardizzati.
- Valore strategico: Migliora l'efficienza del capitale consentendo la riduzione dei rischi in fase precoce di composti attivi contro i biofilm prima di costosi studi in vivo.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione corretta per rischio collegando perturbazioni genetiche o chimiche a difetti del biofilm quantificabili.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella preparazione di colture microbiologiche e nell'uso di sistemi microfluidici.
- È subordinato all'accesso a piattaforme microfluidiche automatizzate dotate di controllo preciso dello sforzo di taglio e della temperatura.
- Necessita di una standardizzazione congiunta tra gruppi di lavoro per l'acquisizione delle immagini, l'analisi e l'interpretazione dei dati da parte dei team di biologia e di imaging.
- Comporta considerazioni di adattamento qualora il metodo venga esteso a biofilm misti o a regni microbici alternativi.
- I limiti pratici includono la necessità di agenti di contrasto o di colorazioni ottimizzati per migliorare la visualizzazione di specifici componenti del biofilm.
Domande frequenti sulla biofarmaceutica
Chapters in this video
0:05
Title
1:02
Preparation of Microfluidic Channels of the Microfluidic Plate
2:08
Candida albicans Biofilm Formation in the Microfluidic System
4:06
Setting Up the Stage Positions for the Microfluidic Experiment
6:01
Microfluidic Experiment Image Acquisition
7:38
Analyzing the Results
9:07
Results: Drug Exposure and Genetic Mutations Can Alter Biofilm Formation
10:20
Conclusion
