Name: Visualizzazione della formazione di Biofilm in Candida albicans utilizzando un dispositivo microfluidico automatizzato (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 14 s
Description: Scopri la formazione di biofilm in Candida albicans in tempo reale utilizzando un dispositivo microfluidico automatizzato. Questo metodo consente di testare l'efficacia di agenti antimicrobici e valutare mutanti genetici.

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Ringraziamo tutti i membri del laboratorio Nobile per utili discussioni su saggi di biofilm. Questo studio è stato finanziato dal National Institutes of Health (NIH) sovvenzione R21 AI125801 (C.J.N.). DLR è stato sostenuto da una borsa di studio di dottorato presso l'Università di California Institute per il Messico e gli Stati Uniti (UC-MEXUS) e il Consejo Nacional de Ciencia y Technologia (CONACYT).

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Clarissa J. Nobile è dei fondatori di BioSynesis, Inc., una società di sviluppo di inibitori e diagnostica dei albicans del c. biofilm.

Il dosaggio di biofilm microfluidici personalizzabile descritto qui permette per la visualizzazione della formazione del biofilm in tempo reale a livello di singola cellula quando esposti ad un tasso fisso a flusso laminare e temperatura costante. Fornisce un mezzo potente per studiare lo sviluppo di biofilm in ceppi wild-type e mutanti, e gli effetti dei trattamenti di agente antimicrobico su biofilm in condizioni che mimano condizioni fisiologiche osservate nelle regolazioni cliniche. A differenza della maggior parte <...

Candida albicans è un commensali membri del microbiota umano, tuttavia è anche un agente patogeno opportunistico, in grado di causare infezioni fungine superficiali e severa1,2. Un tratto di maggiore virulenza dei albicans del c. è la sua capacità di modulo resiliente e biofilm resistente alla droga, comunità di cellule aderito ad una superficie e racchiuso in una matrice extracellulare del materiale1,3. C. albicans biofilm sono altamente strutturato, contenente diversi strati di più tipi di cellule (lievito germogliante-forma tondeggiante cellule, cellule ovali pseudoifale e cellule tubulari ifale)4. Albicans del c. sviluppo di biofilm inizia con l'aderenza delle cellule di lievito-forma rotonda ad una superficie (semina il biofilm), seguita dalla proliferazione di queste cellule sulla superficie, e quindi la maturazione del biofilm acerbo strutturare in un biofilm ben formato che è circondato da matrice extracellulare materiale4. Il biofilm maturo è composto principalmente di cellule hyphal allungate che formano reti dense e comunicanti, fornendo la stabilità architettonica al biofilm4. Tutto il ciclo di vita del biofilm, tondo lievito gemmante cellule disperdono dal biofilm maturo e possono viaggiare ad altre regioni del corpo per causare le infezioni diffuse o seme nuovo biofilm presso altri siti4,5. C. albicans può formare biofilm su superfici biotiche, ad esempio superfici mucose e nel tessuto ospite e su superfici abiotiche, quali cateteri, pacemaker, protesi dentarie e protesi articolari. A causa delle proprietà ricalcitrante del biofilm, sono estremamente difficili da sradicare, e in molti casi la strategia unico trattamento efficace è la rimozione del dispositivo infetto4. È dunque fondamentale per studiare la formazione di biofilm in condizioni simili a quelle osservate nelle regolazioni cliniche.
Ci sono parecchi critici in vivo modelli di animali utilizzati per lo studio di c. albicans biofilm formazione6,7,8; Tuttavia, questi studi possono essere costosa, richiede tempo e sono limitati dal numero di ceppi e agenti antimicrobici che possono essere testati in un dato momento. In vitro biofilm saggi, d'altra parte, consentire la valutazione rapida, ad alta produttività di composti Antifungini e ceppi mutanti e sono molto più redditizi ed etici di biofilm saggi trasportati fuori in animale modelli9, 10,11,12,13,14. Qui descriviamo un test in vitro che abbiamo sviluppato e ottimizzato per osservare la formazione di biofilm temporaneamente sotto flusso laminare usando un personalizzabile microfluidici dispositivo14,15. Il test consente la visualizzazione di ogni fase della formazione del biofilm, compreso il passaggio di adesione iniziale, proliferazione, maturazione del biofilm e dispersione delle cellule. Il dosaggio è anche utile per visualizzare i cambiamenti di morfologia delle cellule durante lo sviluppo di un biofilm.
Piastre di microtitolazione, che vengono in genere utilizzati per in vitro biofilm saggi, mentre a resa elevata, non consentono per condizioni di flusso controllato. Sistemi cellulari tradizionali a flusso laminare consentono la valutazione continua di formazione di biofilm in condizioni di flusso controllato, ma questi sono spesso molto tempo per impostare e tendono ad avere un limitato controllo gamma dinamica e velocità effettiva. Il dispositivo di microfluidica utilizzato qui supera queste limitazioni mediante la combinazione di piastre di throughput elevato (contenente 48 pozzetti) con una camera di flusso laminare incorporato ed è altamente riproducibile, versatile e personalizzabile.
Qui, descriviamo un protocollo per l'uso di un dispositivo microfluidico automatizzati disponibili in commercio per valutare la formazione di biofilm di un selvaggio-tipo albicans del c. ceppo, gli effetti di un noto agente antifungino sullo sviluppo di un biofilm e biofilm formazione in due ceppi mutanti (bcr1Δ/Δ ed efg1 Δ/Δ) che precedentemente sono stati segnalati per avere biofilm difetti in vitro e in vivo16,17,18. Il protocollo descritto può essere utilizzato per testare l'efficacia degli agenti antimicrobici nell'inibire la formazione di biofilm in tutto lo sviluppo di un biofilm e per identificare geni richiesti per la sviluppo di biofilm normale mediante screening di librerie mutante.

<table><tbody><tr><td>BioFlux 1000z</td><td>Fluxion</td><td></td><td>Dispositivo microfluidico automatizzato per l'analisi di cellule vive</td></tr><tr><td>Piastra a 48 pozzetti 0-20 dyne</td><td>Fluxion</td><td>910-0047</td> Software di montaggio <td>su piastra microfluidica</td></tr><tr><td></td><td>Fluxion</td><td>Versione 7.8.4.0</td><td>Software di analisi di visualizzazione</td></tr><tr><td>Software NIH</td><td></td><td>https://imagej.nih.gov/ij/</td><td></td></tr> <tr><td>Yeast Extract</td><td>Criterio:</td><td>C7341</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Peptone</td><td>, BD Biosciences,</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>Destrosio (D-glucosio)</td><td>Fisher Scientific</td>, <td>D163</td><td></td></tr>, <tr><td>Fosfato di potassio monobasico</td>, <td>Fisher Scientific</td><td>P285-500</td><td></td></tr>, <tr><td>RPMI-1640</td>, <td>Sigma-Aldrich</td><td>R6504</td><td></td></tr>, <tr><td>MOPS</td>, <td>Sigma-Aldrich,</td><td>M3183</td><td></td></tr><tr><td>Criterio del brodo nutriente</td><td></td><td>C6471</td><td></td></tr><tr><td>Difco D-mannitolo</td><td>BD Biosciences</td><td>217020</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Criterio</td><td>C5001</td><td></td></tr><tr><td>Amfotericina B</td><td>Corning</td><td>30-003-CF</td><td></td></tr><tr><td>Anelli di inoculazione sterili</td><td>VWR</td><td>30002-094</td><td></td></tr><tr><td>Piastre di Petri con coperchio trasparente</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>Cuvette monouso</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-955-127</td><td></td></tr><tr><td>Carta per lenti</td><td>VWR</td><td>52846-001</td><td></td></tr><tr><td>Spettrofotometro per micropiastre e cuvette</td><td>BioTek</td><td>EPOCH2TC</td><td></td></tr><tr><td>Incubatore a scuotimento</td><td>Eppendorf</td><td>M12820004</td><td></td></tr></tbody></table>

visualizzazione della formazione di biofilm in candida albicans utilizzando un dispositivo microfluidico automatizzato

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Candida albicans è il più comune agente patogeno fungoso degli esseri umani, causando circa il 15% dei casi di sepsi nosocomiali. Un attributo di maggiore virulenza dei albicans del c. è la sua capacità di forma biofilm comunità strutturata delle cellule allegate alle superfici biotiche e abiotiche. C. albicans biofilm può formare su tessuti dell'ospite, come ad esempio strati mucosi e sui dispositivi medici, quali cateteri, pacemaker, protesi dentarie e protesi articolari. Biofilm pongono sfide cliniche significative perché sono altamente resistenti alle perturbazioni fisiche e chimiche e può agire come serbatoi per seme diffuse infezioni. Vari saggi in vitro sono state utilizzate per studiare la formazione di biofilm di albicans del c. , come saggi di piastra di microtitolo, misurazioni di peso secco, saggi di vitalità cellulare e confocale microscopia a scansione laser. Tutte queste analisi sono saggi single end-point, dove la formazione di biofilm è valutata a un momento specifico. Qui, descriviamo un protocollo per studiare la formazione di biofilm in tempo reale utilizzando un dispositivo microfluidico automatizzati in condizioni di flusso laminare. Questo metodo permette l'osservazione della formazione di biofilm come biofilm si sviluppa nel tempo, con condizioni personalizzabili che imitano quelli di host, ad esempio quelle incontrate in cateteri vascolari. Questo protocollo può essere utilizzato per valutare i difetti di biofilm di mutanti genetici nonché gli effetti inibitori degli agenti antimicrobici per lo sviluppo di biofilm in tempo reale.

Abbiamo effettuato l'analisi di biofilm microfluidici descritto qui utilizzando un selvaggio-tipo ceppo di albicans del c. in condizioni di due media (media RPMI-1640 e Spider), il ceppo di selvaggio-tipo in presenza del noto farmaco antifungino amfotericina B (16 µ g/mL) in RPMI, e due ceppi mutanti precedentemente segnalato di avere difetti nella formazione del biofilm (bcr1Δ/Δ ed efg1 Δ/Δ) in media di ragno.
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Questo protocollo descrive l'uso di un dispositivo microfluidico automatico personalizzabile per visualizzare la formazione di biofilm in Candida albicans in condizioni fisiologiche host.

Visualizzazione della formazione di Biofilm in Candida albicans utilizzando un dispositivo microfluidico automatizzato

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. ...

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di visualizzare la formazione del biofilm di Candida albicans in tempo reale in condizioni fisiologiche dell'ospite. Questo metodo consente di osservare la formazione di biofilm mentre si sviluppa in tempo reale e può essere utilizzato per testare l'efficacia di agenti antimicrobici o per valutare mutanti genetici. Questa tecnica può essere utilizzata per lo screening di potenziali terapie per l'attività contro i biofilm in modo ad alto rendimento e la loro efficacia può essere misurata, visualizzata e confrontata con i trattamenti attuali.Il vantaggio principale di questa tecnica è che può essere utilizzata per analizzare la formazione di biofilm in diverse condizioni che sono di interesse per i ricercatori. Sebbene questo metodo sia stato sviluppato specificamente per studiare la formazione di biofilm di Candida albicans, può essere applicato anche ad altri microrganismi che formano biofilm, comprese altre specie fungine e batteri. Per iniziare, preparare colture di singole colonie di diversi ceppi di C. albicans da cellule piastrate su estratto di lievito, peptone, destrosio o YPD medium agar seguendo pratiche microbiologiche standard.Quindi, accendi il sistema microfluidico che include il controller, le due unità di alimentazione, il microscopio, la fotocamera e il computer collegati al sistema. Una volta caricato il computer, apri il software che controlla il sistema. Individuare il numero del codice a barre della lastra in uso e inserire il numero quando richiesto dal software.Quindi, nel modulo di controllo, impostare la temperatura del sistema microfluidico a 37 gradi Celsius. Quindi, fare clic sui pozzetti di ingresso I1, I7, I13 e I19 e far fluire aria sterile attraverso i tubi della piastra di interfaccia per cinque minuti per rimuovere la condensa. Quando tutta la condensa evapora, posizionare la piastra microfluidica dyne 0-20 a 48 pozzetti sul tavolino del microscopio.Per un esperimento di formazione di biofilm di 12 ore, iniziare aggiungendo 600 microlitri di terreno preriscaldato ai pozzetti di ingresso. Abbassare lentamente la piastra di interfaccia pulita sopra la piastra microfluidica a 48 pozzetti. Quindi far scorrere leggermente la piastra di interfaccia verso sinistra fino a quando i tubi non sono posizionati sopra i pozzetti di ingresso e uscita e sono bloccati in posizione.Nella sezione di controllo del taglio del software, impostare la modalità di flusso su costante e impostare il taglio massimo su un dyne per centimetro quadrato. Quindi fare clic sui pozzetti di ingresso con il fluido per iniziare il flusso del fluido dall'ingresso ai pozzi di uscita al fine di adescare il canale. Dopo cinque minuti di flusso, fare clic sul pulsante di arresto nella sezione di controllo della piastra a pozzetti del software.Quindi rimuovere la piastra di interfaccia e osservare i pozzetti della piastra microfluidica. Solo una piccola goccia di fluido dovrebbe essere visibile nei pozzetti di uscita. Per testare i ceppi di C. albicans wild-type e mutanti, aggiungere 50 microlitri di coltura cellulare SC5314 wild-type in terreni di ragno a due pozzetti di uscita, aggiungere il mutante bcr1 in terreni di ragno a due pozzetti di uscita e aggiungere il mutante EFG1 in terreni di ragno a due pozzetti di uscita.Riposizionare la piastra di interfaccia sulla piastra microfluidica e bloccare il coperchio in posizione. Tornando alla sezione di controllo del taglio del software, impostare la modalità di flusso su costante e impostare il taglio massimo su due dyne per centimetro quadrato. Fare clic sui pozzetti di uscita con le celle per iniziare il flusso di terreno dai pozzi di uscita a quelli di ingresso per iniziare la semina di C.albicans.Dopo tre secondi, fare clic sul pulsante di arresto nella sezione di controllo della piastra del pozzetto per evitare che le celle entrino nei pozzetti di ingresso. Lasciare che le cellule rimangano ferme senza flusso per 10-20 minuti nel canale di visualizzazione per l'adesione iniziale delle cellule. Nella finestra del modulo di imaging, aprire il modulo di acquisizione multidimensionale e fare clic sulla scheda stage nel menu a sinistra.Nella sezione dello stadio, caricare l'elenco degli stadi master per la piastra microfluidica dyne 0-20 a 48 pozzetti. Quindi, aprire la regolazione della ricarica del campione e spostare il tavolino sui moduli di posizione assoluta. Nel modulo di regolazione della ricarica del campione, premere il pulsante live per visualizzare un'anteprima dell'immagine con il mirino.Utilizzando il joystick, posizionare la piastra del pozzetto in modo che la punta della freccia adiacente al canale di visualizzazione quattro sia allineata con il mirino sul software. Quindi vai al menu di spostamento della fase in posizione assoluta e premi il pulsante di impostazione dell'origine. Quindi, torna al modulo di regolazione della ricarica del campione, fai clic sulla sezione del punto di riferimento iniziale nel menu a sinistra e carica il file per la piastra microfluidica dyne 0-20 a 48 pozzetti.Nella sezione del tavolino del modulo di acquisizione multidimensionale, fare doppio clic sulla posizione del tavolino 22.2 per portare il tavolino di visualizzazione del microscopio e la messa a fuoco della telecamera in prossimità dell'indicatore della freccia tramite il canale di visualizzazione 22. Quindi utilizzare il joystick per posizionare la piastra del pozzetto in modo tale che la punta della freccia adiacente al canale di visualizzazione 22 si allinei con il mirino. Copiare la coordinata Y nel modulo di acquisizione multidimensionale nella posizione Y di.2 nella scheda Aggiorna punti di riferimento del modulo di regolazione della ricarica del campione. Infine, nella scheda di aggiornamento delle posizioni delle fasi del modulo di regolazione della ricarica dei campioni, fare clic su applica all'elenco delle fasi MDA. Nella finestra del modulo di imaging, utilizzare il modulo di ripresa multidimensionale e fare clic sulla scheda Salva nel menu a sinistra.Quindi seleziona il nome del file per l'esperimento e la cartella in cui archiviare le immagini acquisite sul computer. Quindi, fai clic sulla scheda timelapse e impostala per acquisire 145 immagini totali cinque minuti tra ogni immagine. Quindi, nella scheda Lunghezze d'onda, impostare il numero di lunghezze d'onda su uno e acquisire al 50% di campo chiaro e al 50% della fotocamera con un tempo di esposizione di 12-20 millisecondi.Imposta il guadagno su 0,6 e il digitalizzatore su 20 milliHertz. Dopo aver impostato la messa a fuoco come descritto nel protocollo di testo allegato, selezionare acquisisci per iniziare a catturare immagini pre-lavaggio delle cellule aderenti per tutti i sottostadi. Nella sezione di controllo del taglio, impostare la modalità di flusso su costante e il taglio massimo su un dyne per centimetro quadrato.Quindi fare clic sui pozzetti di ingresso per iniziare il flusso di fluidi dai pozzetti di ingresso a quelli di uscita al fine di rimuovere eventuali cellule non aderenti. Dopo cinque minuti, fare clic sul pulsante di arresto nella sezione di controllo della piastra a pozzetti. Consentire l'acquisizione di un secondo ciclo di immagini e poi, nella sezione di controllo del taglio, regolare il flusso di taglio massimo a 0,5 dyne per centimetro quadrato e confermare la modifica.Nella finestra del modulo di imaging, selezionare la scheda degli strumenti di analisi e fare clic su Rivedi dati multidimensionali dal menu a discesa. Quindi fare clic su seleziona file di base. Si aprirà la finestra delle utilità del set di dati multidimensionale.Quindi, fai clic sul pulsante Seleziona directory e scegli la cartella utilizzata per salvare l'esperimento. Nell'elenco dei set di dati, seleziona il log del file dell'esperimento. Una volta caricato il registro, fare clic sul pulsante Visualizza.Seleziona la lunghezza d'onda facendo clic sulle opzioni nel menu delle lunghezze d'onda a sinistra e scegli la posizione del palco da visualizzare da un menu a discesa. Scegli l'immagine da caricare tra i numeri nella parte superiore del modulo facendo clic con il pulsante destro del mouse sul numero dell'immagine. Quindi seleziona tutte le immagini per realizzare un video timelapse.Le immagini selezionate si apriranno come video in una nuova finestra. Fare clic sulla scheda file nella finestra del modulo di imaging e scegliere Salva con nome dal menu a discesa. Salva il video risultante come formato di file predefinito.Infine, apri e carica il file video salvato nell'immagine J.In immagine J, fai clic sulla scheda del file e quindi fai clic su Salva con nome. Scegli AVI dal menu a discesa e converti il file in un file AVI utilizzando la conversione JPEG impostata su 10 fotogrammi al secondo. In condizioni wild-type in terreni RPMI 1640, diverse celle hanno aderito fortemente al canale.Formano ife e si può osservare uno spesso biofilm con ife intercalanti e cellule di lievito. Verso la fine dell'esperimento microfluidico, il biofilm wild-type riempie completamente questo canale di visualizzazione. La presenza di amfotericina B, tuttavia, ha un effetto pronunciato sulla riduzione della formazione di biofilm.In particolare, l'aderenza delle cellule è diminuita e si possono vedere diverse cellule che fluiscono via con il flusso di taglio del mezzo. Le cellule di controllo wild-type, questa volta cresciute in terreni di ragno, hanno formato un biofilm simile a quello appena mostrato crescere in RPMI. In questo terreno sono cresciuti anche due mutanti difettosi del biofilm.Entrambi i ceppi mostrano una formazione di biofilm gravemente ridotta rispetto al controllo. In questa popolazione cellulare, le cellule aderenti non formano ife e il biofilm risultante è gravemente difettoso. Quest'altro ceppo è difettoso sia nella formazione del biofilm che nella sua capacità di aderire al canale.Una volta padroneggiato, questo esperimento può essere impostato in meno di un'ora. Utilizzando questo metodo, si può imparare molto su una serie di aspetti diversi della formazione del biofilm, tra cui l'adesione iniziale delle cellule, la maturazione del biofilm e la dispersione cellulare. Questo protocollo è altamente personalizzabile e versatile.Può essere regolato per valutare diverse specie microbiche nei vari regni. Le portate, le temperature, i tempi di incubazione e i terreni possono essere utilizzati anche per studiare i biofilm di specie miste. Consigliamo vivamente questo test del biofilm microfluidico come test in vitro da utilizzare prima dei test sugli animali in vivo.Nella nostra esperienza, i risultati di questo test si correlano molto bene con i saggi di biofilm in vivo esistenti.

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Vengono discussi i protocolli per lo studio della formazione di biofilm in un dispositivo microfluidico che imita i mezzi porosi. Il dispositivo microfluidico è costituito da una serie di micro-pilastri e viene studiata la formazione di biofilm da parte di Pseudomonas fluorescens in questo dispositivo.

Protocollo per il Biofilm Streamer formazione in un dispositivo a microfluidi con Micro-pilastri

Presentiamo una procedura sperimentale di sviluppo del biofilm di Candida albicans in un modello sottocutaneo murino. I biofilm fungini sono stati quantificati determinando il numero di unità formanti colonie e mediante un imaging a bioluminescenza non invasivo, in cui la quantità di luce prodotta corrisponde al numero di cellule vitali.

Candida albicans Biofilm sviluppo sulla medicalmente rilevanti Foreign Bodies in un mouse sottocutaneo modello seguito da Bioluminescence Imaging

L'obiettivo di questo metodo è di descrivere l'uso di un sistema microfluidico per lo sviluppo del biofilm multispecie che contengono specie tipicamente identificate nella placca dentale sopragengivale umana. Metodi per descrivere l'architettura biofilm, la vitalità biofilm, e un approccio alla raccolta biofilm per le analisi di coltura-dipendente o indipendente dalla cultura sono evidenziati.

L&#39;uso di un high-throughput<em&gt; In Vitro</em&gt; Microfluidic sistema per sviluppare orale biofilm Multi-specie

Questo protocollo descrive un nuovo metodo per crescere e qualitativamente analizzare biofilm batterici su ife fungine mediante microscopia confocale ed elettronica.

Un nuovo metodo per l&#39;analisi qualitativa multi-scala batterica biofilm su filamentose Fungal Colonies Utilizzando confocale e microscopia elettronica

Descriviamo l'assembly, operazione, e la pulizia di un apparato di flusso progettato per formazione di biofilm fungine di immagine in tempo reale mentre sotto flusso. Inoltre forniamo e discutere algoritmi quantitativi da utilizzare sulle immagini acquisite.

Imaging in tempo reale e quantificazione dello sviluppo di Biofilm fungine utilizza un sistema bifase di flusso a ricircolo

Per visualizzare e quantificare le caratteristiche interne dei biofilm Candida albicans, prepariamo campioni intatti fissi che vengono chiariti dalla corrispondenza dell'indice di rifrazione. Quindi, la microscopia ottiva di sezionamento può essere utilizzata per ottenere dati immagine tridimensionali attraverso l'intero spessore del biofilm.

Chiarire e imaging Candida albicans Biofilms

Scopri la formazione di biofilm in Candida albicans in tempo reale utilizzando un dispositivo microfluidico automatizzato. Questo metodo consente di testare l'efficacia di agenti antimicrobici e valutare mutanti genetici.

Visualizzazione della formazione di Biofilm in Candida albicans utilizzando un dispositivo microfluidico automatizzato

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