In tempo reale analisi del fattore di trascrizione associazione, trascrizione, traduzione e fatturato per visualizzare eventi globali durante l'attivazione cellulare

L'obiettivo generale di questa configurazione sperimentale è quello di delineare i principali strati di regolazione dell'RNA e del DNA per scoprire i principali meccanismi molecolari che si verificano in risposta a uno stimolo o a un trattamento. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave in molti campi biologici diversi, come le risposte immunitarie in generale, ma anche le risposte molecolari al trattamento farmacologico. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente di visualizzare contemporaneamente più livelli di regolazione genica nel tempo.

Pertanto, è importante utilizzare lo stesso pool di celle per ogni metodo. In generale, questi tre protocolli comportano prima la manipolazione di cellule di interesse in diversi punti temporali. Dopo ogni manipolazione, le cellule vengono raggruppate e divise in tre gruppi, uno per ogni saggio.

Questa sezione del video descrive l'etichettatura e la purificazione delle trascrizioni prodotte più di recente utilizzando l'etichettatura 4sU. Ogni protocollo produce infine campioni pronti per il sequenziamento. Innanzitutto, cerca la concentrazione di 4sU richiesta e il tempo di incubazione necessari per la linea cellulare di interesse.

Ad esempio, 200 micromolari 4sU vengono utilizzati sulle cellule T per un'ora. Separare il pool di cellule dopo il trattamento in un piatto separato per ogni metodo e punto temporale. Quindi, scongelare completamente il numero richiesto di aliquote di 4sU, aggiungere il 4sU direttamente al terreno cellulare e incubare le colture come indicato.

Successivamente, raccogliere le cellule marcate con 4sU in provette di polipropilene. Quindi, centrifugare le cellule. Risospendere il pellet in TRIzol a circa tre milioni di cellule per millilitro e incubare le cellule in TRIzol a temperatura ambiente per cinque minuti.

Ora prepara da 30 a 80 microgrammi di RNA, o più, usando il metodo di Radle e compagnia. Quindi, mescolare la reazione di biotinilazione specifica del tiolo in questo ordine. Inizia con acqua priva di nucleasi, poi tampone 10 volte, quindi RNA e infine biotina-HPDP.

Quindi, mescolare con il pipettaggio e incubare. Procedere con la fase di pulizia per produrre campioni di RNA biotinilato appena trascritto mescolato con RNA preesistente non marcato. Quindi, riscaldare i campioni a 65 gradi Celsius per 10 minuti.

Quindi, mettili immediatamente sul ghiaccio. Una volta che ogni campione si è raffreddato, aggiungere 100 microlitri di perle di streptavidina e incubarle a temperatura ambiente con rotazione per 15 minuti. Ora, isolare le perle decorate con RNA appena trascritto utilizzando una colonna magnetica, quindi eluire l'RNA in 11 microlitri di acqua priva di nucleasi per la sequenzialità.

Questa sezione descrive come isolare gli RNA che vengono tradotti attivamente. La sequenza di queste trascrizioni esamina il traslatosoma dinamico. Abbinato ai dati di sequenziamento dell'RNA, questo test consente di calcolare il turnover dell'RNA e i tassi di traduzione.

Inizia con l'aggiunta di cicloesimide alla sospensione e mescolandola usando le inversioni. Dopo un minuto a temperatura ambiente, centrifugare le cellule, rimuovere il terreno e lavare le cellule con almeno 10 millilitri di PBS integrato con cicloesimide. Quindi, aspirare il terreno e sostituirlo con 100 microlitri di tampone di lisi cellulare di mammifero per 10 milioni di cellule.

Triturare la miscela per lisare le cellule utilizzando un ago da 20 a 25 gauge. Quindi, trasferire il lisato cellulare in una provetta pre-raffreddata da 1,50 millilitri e incubare il lisato su ghiaccio per 10 minuti con inversioni periodiche. Dopo 10 minuti, centrifugare il lisato e trasferire il surnatante in una provetta fredda da 1,5 millilitri.

Successivamente, preparare una diluizione da uno a 10 del lisato in acqua priva di nucleasi e misurare l'assorbanza a 260 nanometri. Quindi, creare aliquote da 200 microlitri di lisato non diluito e trattare ciascuna con 7,5 unità di nucleasi per ogni unità di assorbanza. Lasciare che la nucleasi reagisca per 45 minuti, quindi terminare la reazione utilizzando 15 microlitri di inibitore della RNasi o conservare a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius.

Quindi, purificare l'RNA dell'RPF utilizzando un kit commerciale e proseguire con una deplezione dell'rRNA, anch'essa utilizzando un kit. Successivamente, eseguire una purificazione PAGE su 500 nanogrammi di RNA RPF isolato. Dopo aver preparato i campioni da caricare nel gel, denaturarli, quest'ultimo e controllare, con un'incubazione di cinque minuti a 95 gradi Celsius.

Quindi, eseguire i campioni a 180 volt per circa 75 minuti e valutare i risultati. Per la raccolta delle fette di gel, praticare dei fori sul fondo di un tubo da 0,5 millilitri utilizzando un ago sterile calibro 20. Successivamente, asportare le fette di gel corrispondenti alla regione dei nucleotidi di base da 28 a 30 e trasferirle nelle provette da 0,5 millilitri preparate.

Includere un campione del controllo dell'RNA e un campione del controllo negativo per verificare la presenza di contaminazione. Quindi, caricare le piccole provette del campione tappate in provette per microcentrifuga più grandi. Quindi, centrifugare i gruppi per sminuzzare il gel e trasferire il campione nella provetta da 1,5 millilitri.

Quindi, aggiungere acqua, acetato di ammonio e SDS alle provette del campione per eluire l'RNA in una reazione notturna a quattro gradi Celsius. Quindi, utilizzare un kit commerciale per creare una libreria di cDNA dal piccolo RNA e procedere con il sequenziamento della libreria di cDNA. ChIP-seq viene utilizzato per mappare il legame di un fattore di trascrizione di interesse in tutto un genoma.

In combinazione con i dati della profilazione dei ribosomi e l'indagine di tutti i nuovi trascritti, ChIP-seq rivela l'impatto effettivo del legame del fattore di trascrizione. Per iniziare, reticolare i campioni cellulari utilizzando la formaldeide a una concentrazione finale dell'1%Dopo 10 minuti a temperatura ambiente con un leggero oscillamento, arrestare la reazione aumentando la concentrazione di glicina a 0,125 molare. Quindi, raccogli le cellule e lavale tre volte con PBS ghiacciato e congela il pellet di celle a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius.

Successivamente, risospendere il pellet cellulare in un millilitro di tampone di lisi cellulare ghiacciato con inibitori della proteasi appena aggiunti e incubare le cellule su ghiaccio per 10 minuti. Dopo 10 minuti, centrifugare le cellule, aspirare il surnatante e ripetere l'aggiunta e l'incubazione del tampone di lisi. Successivamente, utilizzare la sonicazione per generare cromatina tranciata tra 200 e 1.000 coppie di basi.

Quindi, accoppiare la cromatina a sfere magnetiche rivestite di anticorpo ed eluire i complessi proteina-DNA in 50 microlitri di tampone di eluizione. Quindi, aggiungere i cinque microlitri di RNasi al 40% e il tampone di eluizione e incubare il campione per 30 minuti. Quindi, aggiungere un'unità di proteinasi K e 20 microgrammi di glicogeno al campione e incubarlo per due ore.

Quindi, spostare il campione a 65 gradi Celsius durante la notte per invertirlo in modo incrociato. Il giorno successivo, posizionare il campione contro il magnete per almeno 30 secondi, quindi raccogliere il surnatante, che contiene il DNA di interesse. Quindi, purificare il DNA, utilizzare la PCR quantitativa per la verifica e sequenziare il DNA.

La marcatura con 4sU può stressare le cellule e portare all'apoptosi. La colorazione con annessina V e 7-AAD è stata utilizzata per identificare le cellule apoptotiche e morte. Dopo aver marcato le cellule Th1 con 4sU utilizzando trattamenti di 30 o 60 minuti, le cellule non sono morte né hanno subito apoptosi.

L'integrità dell'RNA è sempre stata verificata prima del sequenziamento utilizzando un test standard, poiché ciò è di grande importanza durante l'elaborazione dell'RNA. Le librerie amplificate avevano una buona gamma di nucleotidi. L'eccesso di dimeri dell'adattatore necessitava di un'ulteriore purificazione da parte di PAGE.

Troppo modello o troppi cicli si traducono in nucleotidi pesanti, prodotti spalmati e prodotti dimeri adattatori Il taglio della cromatina è risultato funzionare meglio quando la frazione principale della cromatina tranciata era di circa 1.000 paia di basi o poco meno. La PCR quantitativa è stata utilizzata per testare l'applicabilità dell'anticorpo al sequenziamento dell'immunoprecipitazione della cromatina. I primer di controllo negativo sono per geni non espressi nelle cellule di interesse.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di fare un piano dettagliato della configurazione sperimentale, incluso un programma temporale per quando aggiungere 4sU e quando raccogliere le cellule per ciascun metodo. Verificare sempre le condizioni ottimali di marcatura del 4sU testando in anticipo l'impatto del 4sU sulla vitalità cellulare e sulla risposta allo stress. In sintesi, questo approccio ci permette di visualizzare tutti gli eventi di regolazione genica che potrebbero verificarsi durante un processo di attivazione cellulare.

Questo metodo potrebbe essere utilizzato anche per le cellule immunitarie primarie e la loro risposta a uno stimolo o a un farmaco.