Name: In tempo reale analisi del fattore di trascrizione associazione, trascrizione, traduzione e fatturato per visualizzare eventi globali durante lattivazione cellulare (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 54 s
Description: Scopri come analizzare l'associazione dei fattori di trascrizione, la trascrizione, la traduzione e il turnover dell'RNA in tempo reale nelle cellule attivate. Questo metodo combina ChIP-seq, 4sU-seq e ribosome profiling.

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Si ringrazia Lars Dölken per consigli per stabilire 4sU etichettatura per cellule di T primarie; Elisabeth Graf e Thomas Schwarzmayr per aiuto critico nelle generazioni di biblioteca e sequenziamento; Dirk Eick e Andrew Flatley per fornire gli anticorpi delle cellule T e RNAPII; N. Henriette Uhlenhaut e Franziska Greulich per aiuto nella preparazione di libreria per ChIP-seq; Caroline C. Friedel è stata sostenuta da sovvenzioni FR2938/7-1 e CRC 1123 (Z2) dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG); Elke Glasmacher è stata sostenuta dalla concessione GL 870/1-1 dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) e il centro tedesco per ricerca di diabete (DZD), Helmholtz Zentrum München.

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Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.

Analizzando l'intero processo di regolazione genica è necessario comprendere appieno gli adattamenti cellulari in risposta a uno stimolo specifico o trattamento. Combinare totale RNA-seq, 4sU-seq, ribosoma profilatura e ChIP-seq in diversi momenti porta un'analisi completa dei principali processi di regolazione genica nel corso del tempo. Per definire la messa a punto sperimentale, nonché i punti di tempo ottimale è necessaria una profonda comprensione dei processi biologici.
Poiché i metodi per studiare la regolazione genica migliorano rapidamente, questi protocolli possono essere adattati ai rapidi cambiamenti. Tuttavia, essi forniscono i metodi più importanti per lo studio di meccanismi di regolazione genica base in qualsiasi tipo di cellula. Qui, discutiamo alcune delle insidie e fatti si deve considerare quando si utilizzano questi metodi.
Cellule: Cellule devono essere altamente valide e, se utilizza primarie cellule isolate, purezza delle popolazioni delle cellule deve essere garantita (ad es., analisi di FACS per cellule di T primarie). Anche un po ' stressate cellule possono influenzare i risultati di questi metodi di sequenziamento molto sensibile e abbassare la quantità di RNA appena trascritta o tradotta e portare a letture indesiderate della risposta dello stress nei risultati del sequenziamento. La velocità di centrifugazione citata in questo protocollo per agglomerare le cellule è ottimizzata per le cellule T primarie. Quindi, regolare la velocità in funzione del tipo di cella.
4 sU effetti sulla fisiologia cellulare: Oltre alle opzioni di cui sopra per la verifica minima perturbazione di fisiologia cellulare con l'aggiunta di 4sU, ulteriore e/o ulteriori analisi possono essere eseguita, soprattutto quando i numeri di cellulare sono limitati. Effetti sulla proliferazione delle cellule possono essere verificati controllando il tempo di raddoppiamento delle cellule semplicemente contando le cellule marcate e non marcate. Induzione di stress nucleolar poteva essere testati anche analizzando la morfologia delle cellule tramite colorazione di immunofluorescenza di nucleolina e nuclei. Per verificare ulteriormente l'impatto di 4sU, espressione genica globale alterata potrebbe essere misurata correlando leggere conteggi da RNA totale con etichetta a RNA totale senza etichetta.
Numeri di cell: Per in vitro generato le cellule di T, si consiglia di iniziare con almeno la quantità di cellule indicate nella tabella 2. Scegliere un numero adeguato con il metodo in base al tipo di cellule. Poiché le cellule di T hanno meno citoplasma e RNA rispetto ad altre celle, è possibile che gli importi più bassi più probabili di altre cellule sarà adeguati. Per ChIP-seq, numeri di cellulare dipendono altamente l'anticorpo utilizzato e il livello di espressione della proteina di interesse all'interno delle cellule. Per istone o RNAPII ChIP, ambra cellule possono essere utilizzate, mentre i numeri di cellulare devono essere aumentate quando vengono utilizzati fattori di trascrizione, soprattutto se essi sono espressi a livelli bassi.
4 sU-etichettatura e RNA biotinylation: Quando si utilizza cellule aderenti, 4sU etichettatura può essere diretto come descritto da Rädle et al. 19 dal cellule 4sU incorporano molto rapidamente, può essere aggiunto direttamente al mezzo di sospensione, aderente o celle semi-aderente.
Si raccomanda di iniziare la biotinilazione con 60-80 µ g di RNA. Tuttavia, gli importi più bassi di RNA possono essere utilizzati, anche se non abbiamo provato per meno di 30 µ g. aggiungere un coprecipitant (per esempio, GlycoBlue) quando precipitazione RNA se il pellet è difficile da vedere. Duffy et al hanno anche dimostrato che la biotina methylthiosulfonate-attivato (MTS-biotina) reagisce in modo più efficiente con 4sU-identificato RNA oltre HPDP-biotina31. Quindi, potrebbe essere utile in considerazione il passaggio a MTS-biotina, in particolare, per il recupero di piccoli RNA, che tendono ad avere meno residui di uridina (riferisca al protocollo biotinylation menzionato dalla sede di Duffy et al; purificazione di RNA 4sU-etichettati, Procedure sperimentali).
Per il recupero di RNA appena trascritto, è possibile utilizzare perline paramagnetici o RNA pulitura della vostra scelta. Sempre tener conto che questi kit possono o non possono purificare per RNA specifici. Se siete interessati a Mirna, consideri, ad esempio, utilizzando i kit specifici per l'acquisizione di miRNA e sequenziamento.
Quantificazione del RNA trascritto recentemente: Per quantificare con precisione appena trascritto RNA, misurazione deve essere eseguita da un fluorometro adatto (Vedi Tabella materiali). Entro 1 h di esposizione 4sU, recentemente trascritto RNA rappresenta circa 1-4% di RNA totale. Recentemente trascritto RNA di 1 h con l'etichetta, le cellule di T attivate è costituito di ~ 90-94% di rRNA11.
Ribosoma profilatura: Quando si stabilisce il metodo, abbiamo determinato che utilizzando 1,5 x la quantità di nucleasi rispetto a quanto suggerito nel protocollo originale garantisce una corretta digestione. Inoltre, gli effetti contrari non sono stati segnalati per importi elevati di nucleasi. Poiché è molto difficile overdigest la RPFs mentre fanno parte del RNA vincolato dalle proteine ribosomiali, è possibile aumentare ancora leggermente la quantità per titolo la digestione ottimale nucleasi.
Se meno di 500 ng di RNA RPF sono stati recuperati nel passaggio 4.4.2, ripetere lo svuotamento del rRNA e piscina depurata RPFs con RNA Clean & concentratore-5 colonne. In alternativa, è possibile caricare campioni identici due vicino a vicenda sul gel (punto 4.5.3) e fette del gel piscina durante l'eluizione di RNA dal gel (passo 4.5.6).
Si consiglia di tagliare il RPFs su un gel più strettamente possibile alle bande nt 28 e 30. Questo aiuta a eliminare frammenti indesiderati da rRNA e tRNA, che più tardi diventerà parte della tua libreria e ridurre letture di sequenziamento per il tuo RPFs.
Si consiglia inoltre di evitare luce durante la purificazione del gel UV. Questo può creare Nick in frammenti di RNA, come pure i dimeri di pirimidina, che alla fine possono compromettere seriamente la libreria preparazione e risultati di sequenziamento.
Preparazione di biblioteca e l'ordinamento dei dati: Ribosoma protocollo di profilatura consente di generare una libreria di cDNA adatta per il sequenziamento. Campioni generati da 4sU-etichettatura possono essere direttamente utilizzati per la preparazione di libreria con qualsiasi kit di sequenziamento di RNA appropriato. Dal RNA appena trascritto, soprattutto quando si usa bruscamente etichettatura volte, potrebbe non essere ancora poliadenilazione, nessuna selezione di poly-A deve essere eseguita. Invece, è consigliabile lo svuotamento di rRNA per prevenire la riduzione della profondità sequenziamento per il campione reale. Utilizzando cellule di T, abbiamo iniziato con 400 ng di RNA totale e recentemente trascritto (a seconda del kit, vedi materiali), eseguita rRNA svuotamento e ridotti cicli di amplificazione di PCR di minimizzare bias della PCR. Preparazione di libreria può essere effettuato con meno materiale di partenza. Per tenere conto di numeri di complessità di libreria di cicli PCR deve essere ottimizzato.
Per ChIP-seq ci sono anche molti kit disponibili per la preparazione di biblioteca. Nella nostra biblioteca di mani preparazione lavorato bene a partire con 2 ng di DNA ChIP (Vedi materiali per un suggerimento su quale kit da utilizzare). Assicuratevi di controllare gli indici per il bilanciamento del colore durante la sequenziazione. Si consiglia una profondità di sequenziamento di ≥ 40 x 106 letture ogni per 4sU-seq, totale RNA-seq e campioni di ChIP-seq e ≥ 80 x 106 letture per ribosoma campione di profilo. La profondità di sequenziamento dipende il campione e l'analisi bioinformatica a valle e dovrebbe essere considerata attentamente. Per analizzare introniche letture per l'impionbatura cotranscriptional, 100 sequenziamento accoppiato-fine bp deve essere scelto.
Sequencing bias: Sequenziamento è diventata il gold standard nel determinare cambiamenti globali nella trascrizione, traduzione o associazione di fattore di trascrizione. In anni recenti, i metodi esistenti sono stati spinti al limite o nuove tecniche sono state sviluppate per la sequenziazione di partenza sempre più piccole quantità di RNA. Ciò richiede amplificazione del cDNA, che introduce rumore o pregiudizi. Recentemente, identificatori univoci molecolari (UNMIS) sono stati sviluppati per sperimentalmente identificare duplicati introdotti dalla PCR. Recentemente, è stato indicato che l'UNMIS solo leggermente migliorare potenza sequenziamento e tasso di falsi scoperta per di espressione genica differenziale32. Tuttavia, considerare l'utilizzo di identificatori univoci molecolari (UNMIS) per tutte le librerie di sequenziamento al controllo per complessità di biblioteca, soprattutto quando si inizia con basse quantità di RNA e quando sono necessari molti cicli di PCR.
Buffer e soluzioni di riserva: Tutti i buffer per 4sU-seq e profilatura ribosoma devono essere preparati a condizioni rigorose di RNAsi-libera utilizzando acqua priva di nucleasi. È consigliabile acquistare pre-fatte senza nucleasi NaCl, Tris-HCl, EDTA, citrato di sodio e acqua. Per garantire condizioni di nucleasi-free, una soluzione decontaminante RNasi utilizzabile per pulire pipette o superfici. Tutti i buffer per ChIP-seq devono essere almeno dnasi-libero e può essere conservato a temperatura ambiente. Sempre aggiungere gli inibitori della proteasi e, facoltativamente, inibitori delle fosfatasi bene prima dell'uso e conservare il ghiaccio.
Bioinformatica: Analisi di tutti i dati di sequenziamento (cioè, ChIP-seq, RNA-seq e profilatura ribsosome) comporta il controllo di qualità (ad esempio, utilizzando FastQC, http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/), rimozione di adattatore (ad es., con cutadapt20) seguita da mappatura del genoma di riferimento per le cellule in fase di studio. Per dati di RNA-seq (sia totale e 4sU-seq), come pure ribosoma profiling dei dati, un impiombato mapper di RNA-seq è richiesto, come ContextMap 221. Per gli allineamenti di dati unspliced ChIP-seq, è sufficiente utilizzare BWA-MEM22 . Espressione genica può essere calcolato utilizzando il modello (letture per Kilobase dell'essone per milione frammenti mappato) RPKM1, dopo la determinazione leggere conteggi per gene usando un programma, ad esempio featureCounts23. Per la chiamata di picco da ChIP-seq dati, una serie di programmi è disponibile, ad esempio, Mac24 o GEM25. Ulteriori analisi a valle possono essere eseguite in R26, in particolare utilizzando gli strumenti forniti dal progetto Bioconductor27.
Qui, una sfida importante nell'integrazione dei livelli di RNA 4sU - e totale e attività traduzionale dal ribosoma profilatura è normalizzazione. Un classico approccio per affrontare questo problema è quello di normalizzare a livelli di geni. Per ridurre il rumore dovuto le fluttuazioni casuali per singoli geni, si raccomanda di utilizzare non solo poche geni ma livelli mediani per un insieme più ampio, ad esempio il > 3.000 geni compilati da Eisenberg e Levanon28 . Per il calcolo dei tassi di fatturato di RNA da rapporti di 4sU-al che RNA totale, normalizzazione è basata sul fatturato mediano di prezzo (ad es., supponendo un'emivita RNA 5 h)29. Tuttavia, poiché questo non si assume nessun cambiamenti complessivi per geni, si consiglia di utilizzare approcci di analisi indipendente di normalizzazione, ad esempio, di una serie temporale dei tipi di dati diversi per identificare gruppi di geni di clustering basato su correlazione con comportamento distinto nella trascrizione e nella traduzione durante l'attivazione. Per una descrizione dettagliata sull'integrazione di bioinformatical dei tipi di dati diversi, ci riferiamo al originale pubblicazione11.
Analisi di integrazione di dati e tariffe di fatturato: Un libro recentemente pubblicato33 confrontando emivite determinate da un controllo di gene multiplex (MGC) ai metodi globali potrebbe mostrare che emivite correlato meglio con quelli ottenuti mediante metodi di etichettatura metaboliche rispetto ad altri metodi (ad esempio, generale inibizione della trascrizione di farmaci). Tuttavia, va ricordato che le differenze tra calcoli di Half-Life possono sorgere e sono stati descritti 15,34. Ci conto per la maggior parte dei problemi e le differenze introdotte dalla risposta allo stress dovuto all'esposizione prolungata 4sU. Pertanto, è indispensabile escludere la risposta allo stress introdotta da 4sU-etichettatura. Per convalidare ulteriormente i tassi di fatturato, si consiglia l'uso di MGCs.
Inoltre, un set di dati come generato qui potrebbe essere utilizzato anche per un più integrante dati analisi (ad es., regolamento di RNA lunghi non codificanti)35,36.

Negli ultimi anni, la sequenza di RNA (RNA-seq) è diventato lo strumento standard per analizzare tutto espresso RNA all'interno di una cella o a un organismo1. Tuttavia, per comprendere l'intero processo di adattamento in risposta ad una stimolo/droga specifica di cellule, è necessario determinare completamente tutti i processi sottostanti, che vanno dalla trascrizione del mRNA per l'elaborazione, fatturato e traduzione. Cambiamenti a breve termine nella trascrizione del RNA difficilmente possono essere misurate con RNAseq totale, poiché le modifiche di RNA totale dipendono da fattori ad esempio RNA mezza-vita e attività trascrizionale, che sono un povero modello per riflettere l'adattamento delle cellule a effetti ambientali2,3. Infatti, una varietà di nuove tecniche di sequenziamento sono stati sviluppati che permettono un'analisi delle diverse fasi nel processo di gene regolamento4 quando combinati nel modo giusto. Questo protocollo viene descritto come combinare alcune tecniche di sequenziamento piuttosto facilmente applicabile che permettono la regolazione dei livelli essenziali del mRNA di rilevamento in modo comparativo. Per analizzare l'attività trascrizionale, sono state descritte una varietà di metodi, quali Cap-analisi di gene expression (gabbia)5, nativo di allungamento trascrizione sequenziamento (NET-seq)6e genoma nucleare eseguire-sulle (GRO-seq)7 , 8, così come bromouridine-sequenziamento (Bru-seq) e 4-thiouridine-sequenziamento (4sU-seq), che utilizzano metaboliti che sono incorporati in appena trascritto RNA9,10, solo per citarne alcuni. Mentre CAGE identifica il sito di inizio della trascrizione esatta, NET-seq e GRO-seq fornire informazioni più accurate indicazioni di lettura e 4sU-seq (che è il metodo qui descritto) rileva solo recentemente trascritto RNA. Tuttavia, 4sU-seq è altamente sensibile e può essere applicato in tempi diversi per misurare l'attività trascrizionale quantitativa in attivamente cambiando le cellule, così come cambiamenti quantitativi nella trasformazione di mRNA (che avviene all'interno di minuti)9, 11,12. È inoltre ideale per combinare con RNA-seq per calcolare i tassi di fatturato di RNA per geni94sU-seq. La trascrizione di mRNA viene effettuata dalla RNA polimerasi II (RNAPII), che a sua volta è influenzata da una moltitudine di fattori, come fattori di trascrizione, modificazioni istoniche e attivatori/repressori generale che può anche essere parte del trascrizionale complesso. Per verificare quanti gene/promoter/enhancer regioni sono vincolate da un fattore, ChIP-seq è stato sviluppato, che ora è il metodo standard per questo scopo, a causa di molti anticorpi commerciali13. Tuttavia, anche se ChIPseq fornisce informazioni chiare su dove che regolano fattori bind, non riflette se infatti porta a cambiamenti nella trascrizione14. Di conseguenza, l'esecuzione di ChIP-seq con 4sU-seq è la combinazione ideale per tali domande biologiche. Regolazione dell'espressione genica può verificarsi anche in una fase successiva, dal momento che i livelli di mRNA e proteina necessariamente non correlano15,16, che indica il regolamento potenzialmente significativo sul traslazionale o post-traduzionale livello, a seconda del contesto. Durante l'anno 2011, ribosoma profiling erano Stati Uniti in primo luogo con RNA-seq e ora è il metodo di scelta di quantificare i cambiamenti che si verificano rapidamente in proteina, dato che ci sono ancora alcuni limiti di sensibilità con spettrometria di massa17. Infatti, i tassi di conversione ottenuti da tali metodi sono stati indicati per consegnare una relativamente buona stima dei cambiamenti nei livelli della proteina (misurati almeno per cambiamenti a lungo termine) e consente una visuale ancora più dettagliata sul processo di traduzione, ad esempio il determinazione della traduzione alternativa e inizio lato cornici17. L'uso di combinatoria di tutti e quattro i metodi possono essere utilizzati in regime stazionario, tra vari tipi di cellule, o in un tempo-seriale esperimento di un rapido cambiamento di cella11. Questo uso fornisce una panoramica di tutto il genoma dei cambiamenti nell'associazione di fattore di trascrizione che influenzano la trascrizione RNA, elaborazione e traduzione.

<table><tbody><tr><td>4sU-labeling</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4-tiouridina (100 mg)</td><td>Carbosynth</td><td>13957-31-8</td><td>Preparare 50 mM di stock in H2O/PBS sterile; conservare a &ndash; 20 gradi C in aliquote da 50-500 &micro; l; Non ricongelare.</td></tr><tr><td>Provette da 1,5 ml con chiusura di sicurezza</td><td>Eppendorf</td><td>30121589</td><td>Provette opzionali</td></tr> da <tr><td>1,5 ml con tappo a vite</td><td>in polipropilene Sarstedt</td><td>72692005</td><td>Compatibile con dimetilformammide</td></tr><tr><td>Provette da 15 ml</td><td>BD Falcon</td><td>352096</td><td>Compatibile con dimetilformammide</td></tr><tr><td>Provette in polipropilene con tappo a vite da 2,0 ml</td><td>Sarstedt</td><td>72694005</td><td>Compatibile con dimetilformammide</td></tr><tr><td>50 ml tubi</td><td>BD Falcon</td><td>352070</td><td>Compatibile con Dimetilformammide</td></tr><tr><td>Agencourt RNAClean XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63987</td><td>Si consiglia di utilizzare queste perle paramagnetiche. Aliquotare e conservare a 4 gradi C</td></tr><tr><td>Cloroformio</td><td>Sigma Aldirch</td><td>372978</td><td>AVVERTENZA &ndash; PERICOLOSO PER LA SALUTE</td></tr><tr><td>Dimetilformammide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D4551</td><td></td></tr><tr><td>Ditiotreitolo (DTT)</td><td>Roth</td><td>6908.1</td><td>Preparare come 100 mM DTT in H2O privo di nucleasi; preparare sempre fresco</td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>Merck</td><td>1.00983.1000</td><td></td></tr><tr><td>EZ-Link Biotina-HPDP (50 mg)</td><td>Pierce</td><td>21341</td><td>Preparare 1 mg/ml di soluzione madre sciogliendo 50 mg di Biotina-HPDP in 50 ml di DMF. Il riscaldamento delicato migliora la solubilizzazione. Negozio a 4 gradi C in aliquote da 1 ml. Il DMF scioglie alcuni materiali plastici. Si consiglia di utilizzare pipette di vetro per trasferire il DMF dal flacone di vetro di serie alle provette Falcon da 50 ml.</td></tr><tr><td>Kit DNA ad alta sensibilità</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanolo</td><td>Merck</td><td>1.09634.1011</td><td></td></tr><tr><td>NaCl (5M)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71386</td><td>Soluzione madre</td></tr><tr><td>EDTA senza nucleasi (500 mM ), pH 8.0</td><td>Invitrogen</td><td>15575-020</td><td>Soluzione madre</td></tr><tr><td>Senza nucleasi H2O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W4502</td><td>Soluzione madre</td></tr><tr><td>Tris Cl (1M) senza nucleasi, pH 7,4</td><td>Lonza</td><td>51237</td><td>Soluzione madre</td></tr><tr><td>Gel ad aggancio di fase Provette pesanti (2,0 ml)</td><td>5Prime</td><td>2302830</td><td>Utilizzare nella fase 1.3.4.</td></tr><tr><td>Polipropilene 15&nbsp; ml provette da centrifuga</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188271</td><td>O equivalente; devono tollerare fino a 15.000 &volte; g</td></tr><tr><td>QIAzol Lysis Reagent (200 ml)</td><td>Qiagen</td><td>79306</td><td>Utilizzare questo o equivalente reagente TRI per l'isolamento dell'RNA, AVVERTENZA &ndash; CORROSIVO e PERICOLOSO PER LA SALUTE! Garantire l'accesso immediato all'antidoto fenolico (PEG-metanolo)</td></tr><tr><td>Kit di dosaggio Qubit RNA HS</td><td>Life Technologies</td><td>Q32852</td><td>Utilizzare questo kit per quantificare la quantità di RNA nella fase 1.4.11</td></tr><tr><td>Kit RNeasy MinElute</td><td>Qiagen</td><td>74204</td><td>Opzionale; include Tampone RLT</td></tr><tr><td>Citrato di sodio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C8532</td><td>Preparare una soluzione madre da 1,6 M utilizzando acqua priva di nucleasi</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>&micro; Macs Streptavidin Kit</td><td>Miltenyi</td><td>130-074-101</td><td>Negozio a 4&deg; C, include &micro; Colonne Mac utilizzate nel passaggio 1.4.6. (negozio su RT)</td></tr><tr><td>Test di vitalità cellulare e stress</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PE Annexin V Kit per il rilevamento dell'apoptosi I</td><td>BD Biosciences</td><td>559763</td><td>Opzionale</td></tr><tr><td>Thapsigargin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9033</td><td>Opzionale</td></tr><tr><td>p53</td><td>abcam ab26</td><td></td><td>Opzionale</td></tr><tr><td>p-EIF2a (Ser51)</td><td>Segnalazione cellulare</td><td>9721</td><td>Opzionale</td></tr><tr><td>BH3I-1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B 8809</td><td>Tampone di</td></tr> biotinilazione opzionale<tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4sU Conservare</td><td></td><td>a RT</td><td>100 mM Tris pH 7,4, 10 mM EDTA, 1 M NaCl, 0,1% Tween 20 in H2O privo di nucleasi</td></tr><tr><td>Tampone di biotinilazione (10x)</td><td></td><td>conservare a 4 &deg; C</td><td>100 mM Tris pH 7,4, 10 mM EDTA in acqua priva di nucleasi; fare aliquote da 1 ml; conservare a 4 gradi; </td></tr><tr><td>Riserva di tampone</td><td></td> di precipitazione dell'RNA C <td>a RT</td><td>1,2 M NaCl, 0,8 M citrato di sodio in acqua priva di nucleasi. Preparare in anticipo in condizioni prive di nucleasi. Conservare a temperatura ambiente in provette falcon da 50 ml.</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2100 Strumento bioanalizzatore</td><td>Agilent</td><td>G2939BA</td><td></td></tr><tr><td>RNA 6000 Nano Kit</td><td>Agilent</td><td>5067-1511</td><td>Utilizzare questo kit per verificare l'integrità dell'RNA nel passaggio 1.3.10</td></tr><tr><td>RNA 6000 Pico Kit</td><td>Agilent</td><td>5067-1513</td><td></td></tr><tr><td>Spettrofotometro UV/VIS</td> opzionale <td>Thermo Scientific</td><td>NanoDrop 1000</td><td>O equivalente. Utilizzare nel passaggio 1.2.2/3.1.8/3.3.3/3.4.3</td></tr><tr><td>Centrifuga ad alta velocità</td><td>Thermo Scientific</td><td>Heraeus Multifuge X3R</td><td>O apparecchiature equivalenti in grado di raggiungere 13.000&nbsp; &volte; &nbsp; g</td></tr><tr><td>Rotore ad alta velocità</td><td>Thermo Scientific</td><td>Fiberlite F15-6 x 100y</td><td></td></tr><tr><td>Adattatori per provette</td><td></td><td></td><td></td>da 15 ml</tr><tr><td>Centrifuga da tavolo refrigerata</td><td>Eppendorf</td><td>5430 R</td><td>O equivalente.</td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td>Thermomixer C</td><td>O equivalente.</td></tr><tr><td>Supporto magnetico</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-109</td><td>Un supporto contiene 8 &micro; Colonne Mac.</td></tr><tr><td>Scala ultrafine</td><td>Mettler Toledo</td><td>ML204T</td><td>o equivalente.</td></tr><tr><td>E-Gel iBase Power System</td><td>Invitrogen</td><td>G6400UK</td><td>Per gel di RNA; o equivalente.</td></tr><tr><td>E-Gel EX 1% agarosio gel prefabbricati</td><td>Invitrogen</td><td>G4020-01</td><td>Per gel di RNA; o equivalente.</td></tr><tr><td>DynaMag-2 Magnet-1 ciascuno</td><td>Life Technologies</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap</td><td>Sigma</td><td>R2020</td><td>Kit di</td></tr><tr><td>preparazione della libreria di RNA totale a filamenti TruSeq</td> opzionale <td>Illumina</td><td>RS-122-2201</td><td>O equivalente. Per le cellule T abbiamo utilizzato 400 ng di 4sU e RNA totale con 11 cicli per l'amplificazione della PCR. La deplezione dell'rRNA è inclusa in questo kit</td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>utilizza uno strumento Nanodrop o equivalente per misurare la concentrazione di RNA</td></tr><tr><td>Ribosome Profiling</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TruSeq Ribo Profile kit (mammifero o lievito)</td><td>Illumina</td><td>RPYSC12116 (lievito)</td><td></td></tr><tr><td>TruSeq Ribo Profile kit (mammifero o lievito)</td><td>Illumina</td><td>RPHMR12126 (mammifero)</td><td></td></tr><tr><td>Illustra MicroSpin S-400 HR Colonne</td><td>GE Healthcare</td><td>27-5140-01</td><td></td></tr><tr><td>RNA Clean & Kit concentratore-25</td><td>Zymo Research</td><td>R1017</td><td></td></tr><tr><td>RNA Clean & Kit concentratore-5</td> Kit di rimozione dell'rRNA <td>Ribo-Zero Gold Zymo Research</td><td>R1015</td><td></td></tr><tr><td>(umano/topo/ratto)</td><td>Illumina</td><td>MRZG126 o MRZG12324</td><td></td></tr><tr><td>(kit DNA ad alta sensibilità)</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-4626</td><td>Già necessario per 4sU-seq</td></tr><tr><td>Tutti gli altri materiali di consumo e attrezzature sono elencati nella Guida per l'utente!!</td><td></td><td></td><td>Leggere attentamente la guida per l'utente e ordinare in anticipo i materiali di consumo necessari (considerare tempi di consegna lunghi per alcuni materiali di consumo, ad esempio gel)</td></tr><tr><td>ChIP</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 mM Tris-HCl (pH 8.0)</td><td>fornitore di laboratorio</td><td></td><td></td>gererale</tr><tr><td>100 bp Plus Marker</td><td>Thermo Fisher</td><td>SM0323</td><td></td></tr><tr><td>16 % Formaldeide</td><td>Thermo Fisher</td><td>28908</td><td>Aggiungere a una concentrazione finale dell'1 %</td></tr><tr><td>70% EtOH</td> fornitore <td></td> di <td>laboratorio gererale</td><td>Preparare sempre fresco</td></tr><tr><td>Agarosio</td><td></td><td></td>fornitore di <td>laboratorio gererale</td></tr><tr><td>Agencourt RNAClean XP beads</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63987</td><td>Si consiglia di utilizzare queste perle paramagnetiche. Aliquotare e conservare a 4 gradi C</td></tr><tr><td>Kit di preparazione della libreria ChIP</td><td>KapaBiosystems</td><td>KK8504</td><td>Oppure utilizzare il kit di vostra scelta</td></tr><tr><td>Provette per microcentrifuga a basso legame per DNA</td><td>Eppendorf</td><td>Z666548-250EA</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>Dynabeads Protein G</td><td>Invitrogen</td><td>10004D</td><td>Utilizzare queste perle superparamagnetiche accoppiate alla proteina G nel passaggio 4.3.1.; Portare a RT prima dell'uso</td></tr><tr>Fornitore <td></td> di <td>laboratorio gererale</td> di<td>glicina</td><td>Preparare una soluzione madre 2M</td></tr><tr><td>Glicogeno</td><td>Roche</td><td>10-901-393-001</td><td></td></tr><tr><td>Kit di purificazione PCR MinElute</td><td>Qiagen</td><td>28004</td><td>Utilizzare questo kit (o equivalente) per purificare la cromatina nel passaggio 4.2.4.</td></tr><tr><td>Inibitore della fosfatasi (PhosStop)</td><td>Roche</td><td>4906837001</td><td>Aggiungere al tampone e tenere in ghiaccio</td></tr><tr><td>Power SYBRgreen Master mix</td><td>Thermo Fisher</td><td>4367659</td><td></td></tr><tr><td>Inibitore della proteasi (cOmplete, senza EDTA)</td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td>Aggiungere al tampone e tenere in ghiaccio</td></tr><tr><td>Proteinasi K</td><td>Invitrogen</td><td>25530049</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Kit di analisi</td><td>Invitrogen</td><td>Q32851</td><td>Utilizzare questo kit per quantificare la quantità di DNA nel passaggio 4.6.4. su un fluorimetro Qubit</td></tr><tr><td>Rnase, privo di DNasi</td><td>Roche</td><td>11-119915001</td><td></td></tr><tr><td>Spermatozoo di salmone (sonicato a circa 100 bp)</td><td>Sigma</td><td>D1626</td><td></td></tr><tr><td>TE pH 8.0</td> fornitore <td></td><td></td>di <td>laboratorio gererale</td></tr><tr><td>Anticorpi (grado ChIP se possibile)</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-RNA Pol II [8WG16]</td><td>abcam</td><td>ab817</td><td></td></tr><tr><td>anti-Histon H3K36me3</td><td>abcam</td><td>ab050</td><td></td></tr><tr><td>o anticorpo di interesse</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Buffers</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Binding/Blocking buffer</td><td></td><td>Conservare presso RT</td><td>PBS con 0,5 % BSA e 0,5 % Tween 20</td></tr><tr><td>Cell-Lysis buffer</td><td></td><td>Conservare in</td><td>tubi RT da 5 mM [pH 8,0], 85 mM KCl e tampone</td></tr><tr><td></td><td>IP ChIP</td> NP40 allo 0,5 % <td>Conservare a RT</td><td>0,01 % SDS; 1. 1% Triton X-100; 1.2&nbsp; mM EDTA; 16,7&nbsp; mM Tris-HCl, pH 8,1; 16,7&nbsp; mM NaCl</td></tr><tr>Tampone <td></td><td>per eluizione</td><td>Conservare a RT fino a 6 mesi</td><td>10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 5 mM EDTA (pH 8,0), 300 mM NaCl e 0,5 % SDS</td></tr><tr><td>Nuclei-Lysis Buffer</td><td></td><td>Conservare a RT</td><td>50 mM Tris [pH 8,0], 10 mM EDTA e 1 % SDS</td></tr><tr><td>Wash Buffer I</td><td></td><td>Conservare a RT</td><td>0,1 % SDS; 1 % Triton X-100; 2 mM EDTA; 20 mM Tris-HCL pH 8,1; 150 mM NaCl</td></tr><tr><td>Wash Buffer II</td><td></td><td>Conservare a RT</td><td>0,1 % SDS; 1 % Triton X-100; 2&nbsp; mM EDTA; 20&nbsp; mM Tris-HCL pH 8,1; 500&nbsp; mM NaCl</td></tr><tr><td>Wash buffer III</td><td></td><td>Conservare a RT</td><td>0,25&nbsp; M LiCl; 1% NP-40; 1&nbsp; mM EDTA; 10&nbsp; mM Tris-HCl, pH 8,1</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2100 Strumento bioanalizzatore</td><td>Agilent</td> G2939BA <td>utilizzare questo strumento per l'analisi elettroforetica</td><td></td></tr><tr><td>Microprovette Nanodrop</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bioruptor TBX 1,5 ml</td><td>Diagenode</td><td>C30010010</td><td></td></tr><tr><td>o provette speciali per il vostro dispositivo di sonicazione</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dispositivo di sonicazione Bioruptor o dispositivo di sonicazione a scelta</td><td></td><td></td><td>Sonicazione di cellule T con Bioruptor: 20 - 25 cicli (30 s acceso, 30 s spento in alto in due microprovette bioruptor da 1,5 ml con 500 &micro; l ogni tubo)</td></tr><tr><td>Supporto magnetico per provette</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Elettroforesi su gel di agarosio</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qubit Fluorimetro</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Utilizza questo fluorimetro per quantificare basse quantità di RNA/DNA</td></tr></tbody></table>

in tempo reale analisi del fattore di trascrizione associazione, trascrizione, traduzione e fatturato per visualizzare eventi globali durante l'attivazione cellulare

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

Al momento dell'attivazione, le cellule rapidamente cambiano loro programmi funzionali e, quindi, loro profilo di espressione genica. Enormi cambiamenti nell'espressione genica si verificano, ad esempio, durante la differenziazione cellulare, la morfogenesi e stimolazione funzionale (quali l'attivazione di cellule immunitarie), o dopo l'esposizione a farmaci e altri fattori dell'ambiente locale. A seconda del tipo di stimolo e cellula, questi cambiamenti si verificano rapidamente e a qualsiasi livello possibile di regolazione genica. Visualizzazione di tutti i processi molecolari di una cella risponda ad un certo tipo di stimolo/droga è uno dei compiti più difficili nella biologia molecolare. Qui, descriviamo un protocollo che consente l'analisi simultanea di più livelli di regolazione genica. Mettiamo a confronto, in particolare, obbligatoria (cromatina-immunoprecipitazione-sequenziamento (ChIP-seq)) di fattore di trascrizione, trascrizione de novo (4-thiouridine-sequenziamento (4sU-seq)), elaborazione di mRNA e fatturato, nonché traduzione (ribosoma profilatura). Combinando questi metodi, è possibile visualizzare un dettagliata e genoma corso d'azione.
Sequenziamento di RNA recentemente trascritto è particolarmente indicato quando si analizza rapidamente adattare o cambiando sistemi, poiché questo rappresenta l'attività trascrizionale di geni tutti durante il tempo di esposizione 4sU (indipendentemente dal fatto che siano - up o downregulated). L'uso di combinatoria di totale RNA-seq e profilatura ribosoma permette inoltre il calcolo dei tassi di turnover e la traduzione di RNA. Analisi bioinformatica di risultati di sequenziamento ad alte prestazioni permette molti mezzi per l'analisi e interpretazione dei dati. I dati generati consentono inoltre il monitoraggio co-transcriptional e alternative splicing, solo per citare alcuni possibili esiti.
L'approccio combinato qui descritto può essere applicato per organismi di modello diverso o di tipi di cellule, compreso le cellule primarie. Inoltre, forniamo protocolli dettagliati per ogni metodo utilizzato, inclusi i controlli di qualità e discutere i potenziali problemi e insidie.

4 sU etichettatura: verificare ottimale 4 condizioni di etichettatura sU (apoptosi, nucleare stress, lo stress citoplasmatico), tempo e concentrazione: Alti livelli di 4sU possono inibire la produzione e lavorazione di rRNA e indurre stress citoplasmico, nonché nucleare30. Pertanto, le cellule di interesse devono essere testate per lo stress indotto da 4sU così come apoptosi. L'analisi Western blot è consigliato per la visualizzazione di accumulazione di p53, che indica lo sforzo nucleare, aumentando i livelli di phospho-EIF2a che visualizzano stress citoplasmici e fluorescenza-attivato delle cellule ordinamento analisi (FACS) per apoptosi. Alti livelli e l'esposizione prolungata a 4sU o droghe come thapsigargin o arsenito può essere utilizzati per indurre lo stress cellulare. Per indurre apoptosi o delle cellule morte, le cellule sono state trattate con BH3I-1 (500 ng / µ l) o incubate per 5 min a 95 ° C (shock termico). Annessina V/7-AAD macchiatura è stato utilizzato per determinare apoptotica (Annessina V) e cellule morte (7-AAD). Etichettatura di in vitro generato cellule Th1 primarie per 0,5 h con 500 µM 4sU (concentrazione finale) o 1 h con 200 µM 4sU induce né segni di stress cellulare né apoptosi (Figura 1) ma portano a sufficiente 4sU incorporazione.
RNA etichettatura tempo può anche essere ridotto (≤ 5 min) che conduce ad un aumento di breve durata intronic sequenze d'etichettatura rispetto al più volte. Per visualizzare co-transcriptional tariffe d'impionbatura, etichettatura 4sU volte non devono superare 30 min. Per maggiori dettagli riguardo 4sUlabeling, fare riferimento a Rädle et al. 19
Controllo di qualità: Integrità di RNA è di grande importanza durante l'elaborazione del RNA. È più conveniente controllare la qualità di RNA di RNA con etichetta 4sU dopo biotinylation dall'analisi elettroforetici (Vedi Tabella materiali). Considera verifica RNA isolato dal punto 2.2.2, soprattutto quando lo si utilizza per la sequenza di RNA totale. Numero di RNA integrità (RIN) deve essere ≥ 8 per garantire l'integrità di RNA per un'ulteriore elaborazione (Figura 3).
Analisi elettroforetici possono anche essere utilizzato per verificare appena trascritti di RNA. Essere consapevoli del fatto che recentemente trascritto RNA contiene i rRNAs significativamente meno maturi rispetto a RNA totale con le tipiche bande di rRNA essendo molto meno prominente.
Ribosoma profilatura: amplificazione di PCR di cDNA library: amplificazione del cDNA (passo 4.9.1) è un passo fondamentale per garantire risultati di sequenziamento buona. Analizzare le librerie amplificate dall'analisi elettroforetici. Un buon campione di librerie amplificate Mostra un picco intorno a 140-160 bp (Figura 4A). Una quantità eccessiva di adattatore dimeri dovrebbero essere evitato (Figura 4B) e quei campioni dovrebbero essere ulteriormente purificati utilizzando la procedura di purificazione pagina secondo il protocollo del produttore (purificazione pagina dei prodotti di PCR). Troppo modello o troppi cicli di PCR possono causare eccessiva amplificazione caratterizzata dalla comparsa di bande di peso molecolare più elevato del previsto, i prodotti di PCR spalmati e adattatore dimero prodotti (Figura 4). Per la maggior parte dei campioni 1-5 µ l di cDNA circolare e 9 cicli PCR per l'amplificazione in genere produrrà una quantità sufficiente di prodotto della PCR corretta.
ChIP: cromatina tosatura: Condizioni ottimali di taglio devono essere regolato per ogni tipo di cellula. Determinare in anticipo le condizioni di taglio (ad es., numero di cicli, alta o bassa potenza). Utilizzare lo stesso numero di cellule e lo stesso volume per scopi di test, dal momento che una minore densità di cella aumenta l'efficienza di taglio. Cercate di evitare di sopra - o sotto-tosatura della cromatina. Frammenti di cromatina grande drammaticamente possono influire sui risultati di ChIP di intasamento, e sovra-tosatura può distruggere gli epitopi sulla proteina di interesse, che conduce ad una minore efficienza di associazione dall'anticorpo. In questo esperimento, i migliori risultati sono stati raggiunti quando la frazione principale della cromatina tosata era circa 1.000 bp o leggermente inferiore (Figura 5A).
Verifica ChIP di qPCR: Prima di iniziare il ChIP, si consiglia di verificare se l'anticorpo utilizzato è adatto per ChIP (se possibile, utilizzare gli anticorpi di grado di ChIP) di ChIP-qPCR. Verificare il ChIP per il sequenziamento di qPCR prima di iniziare la preparazione di biblioteca (vedi passo 5.6.5). Disegnare primers che si legano a un sito di destinazione noto della proteina di interesse. Se il luogo di destinazione esatta all'interno di un gene è sconosciuto, diverse coppie di primer consente di eseguire la scansione del gene e associati elementi regolatori. Per RNAPII ChIP di Th1 cellule Ifng, che è transcriptionally upregulated stimolazione e actina primer può essere utilizzato come controllo positivo. SOX9 e insulina servono come controllo negativo, dato che questi geni non sono espressi in cellule Th1 (figura 5B). Ricordate di non usare iniettori essone-spanning, che sono normalmente utilizzati per qPCR di mRNA. Un controllo di IgG è utilizzabile anche per dimostrare la specificità dell'anticorpo utilizzato. DNA immunoprecipitato può essere misurata con un fluorometro adatto (Vedi Tabella materiali). Quantità di DNA non specifico associato dal controllo IgG dovrebbe essere significativamente più basso rispetto alla quantità di DNA associato dall'anticorpo di interesse.
Replica: prova del significato biologico: Si consiglia vivamente di eseguire l'esperimento di cinetica per tutti i metodi a partire dallo stesso pool di cellule affinché le cellule hanno la stessa identità per tutti i campioni non trattati e trattati (Figura 2). Tuttavia, si consiglia di prendere piccole aliquote di intervalli di tempo principale per ogni metodo confrontare i campioni da un replicare biologico (ad es., di qPCR, analisi al FACS). Questo permette una stima approssimativa se il trattamento per entrambi repliche era riproducibile e si potrebbe procedere con sequenziamento. Convalida dei replicati deve essere eseguita mediante analisi bioinformatical. Riproducibilità dei risultati possono essere valutati in termini di correlazione tra valori FPKM tra repliche e visualizzati utilizzando grafici a dispersione (Figura 6).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56752/56752fig1.jpg"> Figura 1: Verifica delle condizioni ottimali d'etichettatura 4sU senza perturbare la fisiologia cellulare (figura da Dini et al. 11) (A) rilevazione di apoptosi mediante analisi Citofluorimetrica: In vitro generato Th0 cellule sono state trattate con diverse concentrazioni di 4sU (indicati tra parentesi) per 0,5 h, h 1 e h 2, rispettivamente. Trattamento BH3I-1 è stato usato per indurre apoptosi determinata da Annexin V, mentre shock termico (5 min a 95 ° C) è stata usata per indurre la morte cellulare determinata dal 7-AAD. (B) analisi di Western blot per p53 di 4sU trattati e cellule T attivate: i campioni sono stati etichettati con 200 µM 4sU per il tempo indicato di attivazione, ad eccezione del punto di tempo di 0,5 h che è stato etichettato con 500 µM 4sU. (C) l'analisi Western blot di fosfo-EIF2a ed EIF2a totale nelle cellule Th1 attivate con le stesse condizioni di etichettatura come in (B). Thapsigargin è stato utilizzato come controllo positivo. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56752/56752fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56752/56752fig2.jpg"> Figura 2: Panoramica schematica di un'installazione cinetica per tenere traccia delle modifiche del genoma Questo schema illustra il programma di installazione di combinando 4sU-seq, totale RNA-seq, ribosoma Profiling e ChIP-seq per studiare i cambiamenti di genoma sopra il trattamento delle cellule. Pool di cellule e mettere da parte il numero di cellule per controllo non trattato. Curare le cellule rimanenti e dividere per ciascun punto di metodo e di tempo. Marcare le cellule non trattate/trattati per 4sU-seq con 4sU come descritto. Punti temporali e campioni per ogni metodo dipendono la questione biologica specifica all'esame. Prelevare campioni per ogni punto nel tempo e metodo e seguire la parte dedicata del protocollo. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56752/56752fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56752/56752fig3.jpg"> Figura 3: controllo di qualità di RNA 4sU-etichetta RNA totale e biotinilati RNA ottenuto dalle cellule Th1 attivate sono stati analizzati su un Bioanalyzer. RRNA 18S e 28S rRNA sono mostrati e RNA integrità numero (RIN) è dato dallo strumento per determinare l'integrità del RNA. RIN dovrebbe essere ≥ 8 per garantire l'integrità del RNA. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56752/56752fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56752/56752fig4.jpg"> Figura 4: Bioanalyzer profili del ribosoma profilatura librerie (A), A buona biblioteca: l'esempio mostra un picco nell'intervallo di dimensioni previste (140-160 bp) e nessun ulteriore purificazione è necessaria. (B), in questo esempio viene illustrato eccessivo adattatore dimero prodotto amplificato (120 bp) rispetto il prodotto desiderato (140-160 bp). Questa libreria richiede ulteriore purificazione. (C), un campione di over-amplificato: picchi di peso molecolare più elevato del previsto e spalmato ampliconi PCR sono visibili (indicati dalle frecce). <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56752/56752fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56752/56752fig5.jpg"> Figura 5: Dimensioni di cromatina ottimale dopo la verifica del ChIP di qPCR e tosatura (A) dell'agarosi gel foto mostra la dimensione del frammento ottimale della cromatina tranciata da tre campioni che erano tranciati per 25 cicli su un sonicatore e purificata come descritto prima nel protocollo. (B) risultati di Q-PCR di un ChIP RNAPII totale (anti-RNA Pol II, 8WG16, ab817) è rappresentato come una percentuale di input. Primer IFNg e actina sono stati utilizzati come un positivo mentre Sox9 e l'insulina sono controlli negativi (entrambi i geni non sono espressi in cellule Th1 attivate). <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56752/56752fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56752/56752fig6.jpg"> Figura 6: Confronto del biologico replica (figura da Dini et al. 11) Rappresentante a dispersione confrontando i valori dell'espressione (FPKM) tra replica di appena trascritto (4sU) RNA 4 h dopo la stimolazione delle cellule Th1 attivate. La linea verde indica valori uguali FPKM e correlazione rigogliosa è indicato in ogni trama.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Durata di etichettatura (min)</td>
			<td>Concentrazione consigliata 4sU (µM)</td>
		</tr>
<tr>
<td>120</td>
			<td>100 - 200</td>
		</tr>
<tr>
<td>60</td>
			<td>200 - 500</td>
		</tr>
<tr>
<td>15 - 30</td>
			<td>500 - 1000</td>
		</tr>
<tr>
<td>&lt; 10</td>
			<td>500 - 2000</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1: Consigliato 4sU concentrazioni (da Rädle, et al. 19) L'intervallo di concentrazioni consigliate 4sU è indicato per diverse volte di etichettatura.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Metodo.</td>
			<td>Numero di cellulare</td>
			<td>Quantità di RNA</td>
		</tr>
<tr>
<td>4sU-etichettatura</td>
			<td>≥ 2 x 107
</td>
			<td>≥60µg</td>
		</tr>
<tr>
<td>Profilatura del ribosoma</td>
			<td>≥ 2 x107
</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>ChIP-seq</td>
			<td>≥ 2 x 107 - 3 x 107
</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 2: Quantità richiesta primarie delle cellule di T Quantità minima di cellule T primarie richieste per ciascun metodo. Gli importi possono essere meno quando si utilizzano altri tipi di cella.

Questo protocollo descrive l'uso combinatoria di ChIP-seq, 4sU-seq, totale RNA-seq e profilatura per linee cellulari e cellule primarie del ribosoma. Esso consente di tenere traccia delle modifiche in fattore di trascrizione binding, trascrizione de novo , elaborazione di RNA, fatturato e traduzione nel corso del tempo e la visualizzazione il corso generale degli eventi in cellule attivate e/o cambiare rapidamente.

In tempo reale analisi del fattore di trascrizione associazione, trascrizione, traduzione e fatturato per visualizzare eventi globali durante l'attivazione cellulare

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

L'obiettivo generale di questa configurazione sperimentale è quello di delineare i principali strati di regolazione dell'RNA e del DNA per scoprire i principali meccanismi molecolari che si verificano in risposta a uno stimolo o a un trattamento. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave in molti campi biologici diversi, come le risposte immunitarie in generale, ma anche le risposte molecolari al trattamento farmacologico. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente di visualizzare contemporaneamente più livelli di regolazione genica nel tempo.Pertanto, è importante utilizzare lo stesso pool di celle per ogni metodo. In generale, questi tre protocolli comportano prima la manipolazione di cellule di interesse in diversi punti temporali. Dopo ogni manipolazione, le cellule vengono raggruppate e divise in tre gruppi, uno per ogni saggio.Questa sezione del video descrive l'etichettatura e la purificazione delle trascrizioni prodotte più di recente utilizzando l'etichettatura 4sU. Ogni protocollo produce infine campioni pronti per il sequenziamento. Innanzitutto, cerca la concentrazione di 4sU richiesta e il tempo di incubazione necessari per la linea cellulare di interesse.Ad esempio, 200 micromolari 4sU vengono utilizzati sulle cellule T per un'ora. Separare il pool di cellule dopo il trattamento in un piatto separato per ogni metodo e punto temporale. Quindi, scongelare completamente il numero richiesto di aliquote di 4sU, aggiungere il 4sU direttamente al terreno cellulare e incubare le colture come indicato.Successivamente, raccogliere le cellule marcate con 4sU in provette di polipropilene. Quindi, centrifugare le cellule. Risospendere il pellet in TRIzol a circa tre milioni di cellule per millilitro e incubare le cellule in TRIzol a temperatura ambiente per cinque minuti.Ora prepara da 30 a 80 microgrammi di RNA, o più, usando il metodo di Radle e compagnia. Quindi, mescolare la reazione di biotinilazione specifica del tiolo in questo ordine. Inizia con acqua priva di nucleasi, poi tampone 10 volte, quindi RNA e infine biotina-HPDP.Quindi, mescolare con il pipettaggio e incubare. Procedere con la fase di pulizia per produrre campioni di RNA biotinilato appena trascritto mescolato con RNA preesistente non marcato. Quindi, riscaldare i campioni a 65 gradi Celsius per 10 minuti.Quindi, mettili immediatamente sul ghiaccio. Una volta che ogni campione si è raffreddato, aggiungere 100 microlitri di perle di streptavidina e incubarle a temperatura ambiente con rotazione per 15 minuti. Ora, isolare le perle decorate con RNA appena trascritto utilizzando una colonna magnetica, quindi eluire l'RNA in 11 microlitri di acqua priva di nucleasi per la sequenzialità.Questa sezione descrive come isolare gli RNA che vengono tradotti attivamente. La sequenza di queste trascrizioni esamina il traslatosoma dinamico. Abbinato ai dati di sequenziamento dell'RNA, questo test consente di calcolare il turnover dell'RNA e i tassi di traduzione.Inizia con l'aggiunta di cicloesimide alla sospensione e mescolandola usando le inversioni. Dopo un minuto a temperatura ambiente, centrifugare le cellule, rimuovere il terreno e lavare le cellule con almeno 10 millilitri di PBS integrato con cicloesimide. Quindi, aspirare il terreno e sostituirlo con 100 microlitri di tampone di lisi cellulare di mammifero per 10 milioni di cellule.Triturare la miscela per lisare le cellule utilizzando un ago da 20 a 25 gauge. Quindi, trasferire il lisato cellulare in una provetta pre-raffreddata da 1,50 millilitri e incubare il lisato su ghiaccio per 10 minuti con inversioni periodiche. Dopo 10 minuti, centrifugare il lisato e trasferire il surnatante in una provetta fredda da 1,5 millilitri.Successivamente, preparare una diluizione da uno a 10 del lisato in acqua priva di nucleasi e misurare l'assorbanza a 260 nanometri. Quindi, creare aliquote da 200 microlitri di lisato non diluito e trattare ciascuna con 7,5 unità di nucleasi per ogni unità di assorbanza. Lasciare che la nucleasi reagisca per 45 minuti, quindi terminare la reazione utilizzando 15 microlitri di inibitore della RNasi o conservare a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius.Quindi, purificare l'RNA dell'RPF utilizzando un kit commerciale e proseguire con una deplezione dell'rRNA, anch'essa utilizzando un kit. Successivamente, eseguire una purificazione PAGE su 500 nanogrammi di RNA RPF isolato. Dopo aver preparato i campioni da caricare nel gel, denaturarli, quest'ultimo e controllare, con un'incubazione di cinque minuti a 95 gradi Celsius.Quindi, eseguire i campioni a 180 volt per circa 75 minuti e valutare i risultati. Per la raccolta delle fette di gel, praticare dei fori sul fondo di un tubo da 0,5 millilitri utilizzando un ago sterile calibro 20. Successivamente, asportare le fette di gel corrispondenti alla regione dei nucleotidi di base da 28 a 30 e trasferirle nelle provette da 0,5 millilitri preparate.Includere un campione del controllo dell'RNA e un campione del controllo negativo per verificare la presenza di contaminazione. Quindi, caricare le piccole provette del campione tappate in provette per microcentrifuga più grandi. Quindi, centrifugare i gruppi per sminuzzare il gel e trasferire il campione nella provetta da 1,5 millilitri.Quindi, aggiungere acqua, acetato di ammonio e SDS alle provette del campione per eluire l'RNA in una reazione notturna a quattro gradi Celsius. Quindi, utilizzare un kit commerciale per creare una libreria di cDNA dal piccolo RNA e procedere con il sequenziamento della libreria di cDNA. ChIP-seq viene utilizzato per mappare il legame di un fattore di trascrizione di interesse in tutto un genoma.In combinazione con i dati della profilazione dei ribosomi e l'indagine di tutti i nuovi trascritti, ChIP-seq rivela l'impatto effettivo del legame del fattore di trascrizione. Per iniziare, reticolare i campioni cellulari utilizzando la formaldeide a una concentrazione finale dell'1%Dopo 10 minuti a temperatura ambiente con un leggero oscillamento, arrestare la reazione aumentando la concentrazione di glicina a 0,125 molare. Quindi, raccogli le cellule e lavale tre volte con PBS ghiacciato e congela il pellet di celle a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius.Successivamente, risospendere il pellet cellulare in un millilitro di tampone di lisi cellulare ghiacciato con inibitori della proteasi appena aggiunti e incubare le cellule su ghiaccio per 10 minuti. Dopo 10 minuti, centrifugare le cellule, aspirare il surnatante e ripetere l'aggiunta e l'incubazione del tampone di lisi. Successivamente, utilizzare la sonicazione per generare cromatina tranciata tra 200 e 1.000 coppie di basi.Quindi, accoppiare la cromatina a sfere magnetiche rivestite di anticorpo ed eluire i complessi proteina-DNA in 50 microlitri di tampone di eluizione. Quindi, aggiungere i cinque microlitri di RNasi al 40% e il tampone di eluizione e incubare il campione per 30 minuti. Quindi, aggiungere un'unità di proteinasi K e 20 microgrammi di glicogeno al campione e incubarlo per due ore.Quindi, spostare il campione a 65 gradi Celsius durante la notte per invertirlo in modo incrociato. Il giorno successivo, posizionare il campione contro il magnete per almeno 30 secondi, quindi raccogliere il surnatante, che contiene il DNA di interesse. Quindi, purificare il DNA, utilizzare la PCR quantitativa per la verifica e sequenziare il DNA.La marcatura con 4sU può stressare le cellule e portare all'apoptosi. La colorazione con annessina V e 7-AAD è stata utilizzata per identificare le cellule apoptotiche e morte. Dopo aver marcato le cellule Th1 con 4sU utilizzando trattamenti di 30 o 60 minuti, le cellule non sono morte né hanno subito apoptosi.L'integrità dell'RNA è sempre stata verificata prima del sequenziamento utilizzando un test standard, poiché ciò è di grande importanza durante l'elaborazione dell'RNA. Le librerie amplificate avevano una buona gamma di nucleotidi. L'eccesso di dimeri dell'adattatore necessitava di un'ulteriore purificazione da parte di PAGE.Troppo modello o troppi cicli si traducono in nucleotidi pesanti, prodotti spalmati e prodotti dimeri adattatori Il taglio della cromatina è risultato funzionare meglio quando la frazione principale della cromatina tranciata era di circa 1.000 paia di basi o poco meno. La PCR quantitativa è stata utilizzata per testare l'applicabilità dell'anticorpo al sequenziamento dell'immunoprecipitazione della cromatina. I primer di controllo negativo sono per geni non espressi nelle cellule di interesse.Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di fare un piano dettagliato della configurazione sperimentale, incluso un programma temporale per quando aggiungere 4sU e quando raccogliere le cellule per ciascun metodo. Verificare sempre le condizioni ottimali di marcatura del 4sU testando in anticipo l'impatto del 4sU sulla vitalità cellulare e sulla risposta allo stress. In sintesi, questo approccio ci permette di visualizzare tutti gli eventi di regolazione genica che potrebbero verificarsi durante un processo di attivazione cellulare.Questo metodo potrebbe essere utilizzato anche per le cellule immunitarie primarie e la loro risposta a uno stimolo o a un farmaco.

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