L'istituzione di un'analisi di colonizzazione del polmone per la visualizzazione di cellule del tumore nei tessuti polmonari di circolazione

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle metastasi tumorali sul ruolo della colonizzazione polmonare nel raggiungimento delle metastasi tumorali. Il vantaggio principale di questa tecnica è che le cellule tumorali stravasate precocemente possono essere visualizzate nei polmoni durante le metastasi del cancro. A dimostrare la procedura sarà Cheng-Han Yang, uno studente di dottorato del mio laboratorio.

Quando la coltura di cellule tumorali ha raggiunto la confluenza del 70-80%, lavare la coltura due volte in due millilitri di PBS sterile per lavaggio e aggiungere un millilitro di tripsina-EDTA allo 0,5% al piatto di coltura. Rimuovere immediatamente 800 microlitri di surnatante e posizionare la piastra di coltura a 37 gradi Celsius per 30-60 secondi fino a quando la maggior parte delle cellule non si è staccata dalla piastra. Aggiungere un millilitro di terreno fresco, integrato con il 10% di FBS per fermare la reazione e utilizzare una pipetta da 1000 microlitri per miscelare energicamente la soluzione cellulare.

Trasferire la sospensione a singola cellula risultante in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri e raccogliere le cellule mediante centrifugazione. Quindi risospendere il pellet di cellule tumorali in 1,5 millilitri di terreno integrato con il 20% di FBS e ruotare le cellule per due ore, a 37 gradi Celsius. Al termine dell'incubazione, contare le cellule vitali mediante esclusione del blu di tripano e raccoglierle mediante centrifugazione.

Risospendere il pellet in un millilitro di PBS sterile per una seconda centrifugazione e risospendere il pellet in 500 microlitri di PBS integrati con il 10% di FBS e 20 microlitri di CFSE. Dopo dieci minuti a 37 gradi Celsius al buio, centrifugare le celle e risospendere il pellet in quattro millilitri di terreno integrato con l'uno per cento di FBS per un'altra centrifugazione. Dopo l'ultimo lavaggio, risospendere le cellule a cinque volte dieci al sesto tumore per millilitro di terreno fresco senza concentrazione di FBS e posizionare le cellule sul ghiaccio.

Successivamente, riscaldare la coda di un topo maschio C570 Black Six di quattro o sei settimane per cinque-dieci minuti per dilatare le vene della coda e utilizzare una siringa da un millilitro dotata di un ago calibro 26 e mezzo per mescolare accuratamente le cellule fino a ottenere una sospensione di una singola cellula. Caricare con cautela la siringa con 200 microlitri di cellule e posizionare il topo in un sistema di contenzione. Quindi iniettare l'intero volume di cellule nel lume di una vena caudale dilatata.

Al momento appropriato dopo l'iniezione, praticare un'incisione longitudinale della pelle e del tessuto sottocutaneo dall'addome al torace e aprire la cavità pleurica per esporre il cuore e i polmoni. Utilizzando suture chirurgiche sterili, legare la vena cava superiore e inferiore per prevenire il riflusso della soluzione di profusione e utilizzare le forbici per creare una fessura da due a quattro millimetri nel ventricolo sinistro per facilitare il drenaggio del perfusato dai polmoni. Quindi utilizzare una siringa da tre millilitri per iniettare PBS nel ventricolo destro e utilizzare l'aspirazione continua per rimuovere la soluzione drenata fino a quando i polmoni cambiano da un colore rossastro a completamente pallido.

Fare attenzione a fissare correttamente la vena cava superiore e inferiore per una perfusione polmonare di successo. Dopo aver prelevato i polmoni, posizionare i lobi in un supporto per polmoni su misura in un piatto di sei centimetri e fissare i polmoni sulla trama reticolata del supporto. Coprire e inumidire i lobi con PBS e posizionare il piatto di coltura sul tavolino di imaging di un microscopio confocale.

Seleziona l'obiettivo 5x e ruota la ruota dei filtri su NIBA. Utilizzando un laser a 488 nanometri, eccita il CFSE per consentire una chiara visualizzazione delle cellule tumorali fluorescenti marcate in blu all'interno dei lobi polmonari. Ruotare la ruota portafiltri su R690 per eseguire la scansione con una velocità di scansione di due microsecondi per pixel e ottimizzare il guadagno di alta tensione e i livelli di offset.

Quindi acquisisci cinque immagini fluorescenti da 12 x cinque da 12 pixel utilizzando una velocità di scansione di 10 microsecondi per pixel. Utilizzando il metodo di colorazione, come appena dimostrato, le cellule tumorali vengono efficacemente marcate con CFSE in modo dose-dipendente. Con l'intensità della fluorescenza della marcatura, quasi raggiungendo un plateau in sei volte 10 al quinto di cellule di carcinoma polmonare di Lewis per millilitro alla concentrazione di 20 micromolari.

La perfusione polmonare prima del prelievo, come appena dimostrato, libera la vascolarizzazione polmonare dalle cellule tumorali circolanti non specificamente tagliate prima dell'analisi di imaging. La microscopia confocale a fluorescenza rivela la presenza di cellule tumorali marcate con CFSE colonizzanti all'interno dei lobi polmonari prelevati e perfusi. L'utilizzo di un software di analisi delle immagini appropriato per convertire le immagini fluorescenti in bianco e nero, facilita la quantificazione della colonizzazione polmonare.

La somministrazione endovenosa di cellule di carcinoma polmonare di Lewis che esprimono fibronectina o che esprimono fibronectina strapazzate dimostra un numero significativamente inferiore di cellule che esprimono fibronectina nel tessuto polmonare raccolto 38 e 45 ore dopo l'iniezione, sottolineando il ruolo della fibronectina nella colonizzazione del lobo polmonare e nello sviluppo del tumore. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di perfondere attentamente i polmoni in modo che le cellule non attaccate possano essere lavate via. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo delle metastasi tumorali per esplorare la colonizzazione polmonare mediante la circolazione di cellule tumorali in un modello murino a zero grammi.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come etichettare in modo fluorescente le sospensioni di cellule tumorali, inoculare per via endovenosa le cellule tumorali perfuse nei polmoni di topo e utilizzare la microscopia confocale a fiorescenza per visualizzare le cellule tumorali metastatizzate.