Istituzione di una coltura primaria di Sarcoma dei tessuti molli paziente-derivato
11 aprile 2018
Il seguente protocollo si concentra sulla creazione di una coltura primaria di sarcoma dei tessuti molli paziente-derivato (STS). Questo modello potrebbe aiutarci a comprendere meglio le priorità bassa molecolare e il profilo farmacologico di queste malignità rare e potrebbe rappresentare un punto di partenza per ulteriori ricerche finalizzate a migliorare la gestione di STS.
L'obiettivo generale di questo modello preclinico umano derivato da tessuto tumorale resecato chirurgicamente è quello di ottenere la creazione di una coltura primaria di sarcoma dei tessuti molli derivato da paziente. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave sulla fisiopatologia del sarcoma dei tessuti molli e rappresenta un importante strumento preclinico per prevedere la risposta alla terapia. Il vantaggio principale di questa tecnica è che si tratta di un modello preclinico completamente umano.
Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia del sarcoma dei tessuti molli perché questo modello preclinico può essere testato con farmaci innovativi convenzionali per studiarne l'attività e il meccanismo d'azione. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sul sarcoma dei tessuti molli, può anche essere applicato allo studio dell'interazione tra cellule tumorali e cellule dei tessuti molli. Gli individui nuovi a questo metodo avranno difficoltà a causa dell'eterogeneità dei tessuti tumorali e nell'isolamento delle cellule tumorali.
La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché la selezione iniziale delle cellule del sarcoma dei tessuti molli e le fasi della CD richiedono una certa esperienza prima di poter raggiungere la competenza. I campioni tumorali devono essere ricevuti in un contenitore sterile per urine da 100 millilitri con 50 millilitri di terreno a basso contenuto di glucosio DMEM sigillato con un film di paraffina. I campioni possono essere conservati a quattro gradi Celsius per un massimo di tre ore dopo la resezione del tumore.
Sterilizzare la cappa di coltura tissutale con etanolo al 70% e sterilizzare le pinzette INOX in acciaio con etanolo al 70%. Rimuovere la pellicola di paraffina dal contenitore delle urine e gettarla. Pulisci l'esterno del contenitore dell'urina con etanolo al 70%.
Aprire una capsula di Petri quadrata, quindi aprire il contenitore dell'urina e utilizzare le pinzette INOX in acciaio sterilizzato per trasferire i campioni tumorali nella piastra. Aggiungere PBS e lavare due volte il campione tumorale. Dopo il lavaggio, sminuzzare finemente il campione tumorale in pezzi di uno o due millimetri di dimensione.
Trasferire un quarto del campione totale in una provetta da due millilitri. Quindi aggiungere un millilitro di reagente TRIzol alla provetta e congelare immediatamente a meno 80 gradi Celsius. Raccogli il resto del materiale tumorale finemente triturato in una provetta da 15 millilitri e aggiungi quattro millilitri di soluzione di collagenasi di tipo uno.
Quindi diluire la soluzione di collagenasi di tipo uno con quattro millilitri di terreno di coltura, chiudere la provetta e sigillare con pellicola di paraffina. Incubare a 37 gradi Celsius su uno shaker per 15 minuti per attivare la digestione. Dopo 15 minuti, posizionare il tubo con lo shaker a temperatura ambiente e lasciarlo riposare per una notte.
Il giorno seguente, filtrare delicatamente la sospensione cellulare attraverso un filtro sterile da 100 micron in una provetta da 50 millilitri. Quindi lavare il filtro con terreno di coltura e centrifugare il filtrato a 225 volte g per cinque minuti a temperatura ambiente. Scartare il surnatante capovolgendo la provetta e risospendere le cellule con uno o due millilitri di terreno di coltura.
Dopo aver eseguito un conteggio delle cellule e calcolato il numero di cellule, piastrate le cellule in una coltura monostrato standard a una densità di 80.000 cellule per centimetro quadrato. Per preparare un campione citologico, iniziare raccogliendo 100.000 cellule in 200 microlitri di terreno di coltura. Pipettare la soluzione in un imbuto monouso dotato di filtro e montato con un vetrino.
Aprire la citocentrifuga e inserire i campioni. Dopo la citocentrifugazione, gettare l'imbuto dotato di filtro. Quindi fissare il vetrino in acetone per 10 minuti, seguito da cloroformio per cinque minuti.
Passaggio delle cellule STS quando la confluenza è intorno al 90%Dopo aver lavato il foglio cellulare con PBS, aggiungere due o tre millilitri di tripsina 1X in PBS e incubare per tre-cinque minuti a 37 gradi Celsius. Dopo l'incubazione, utilizzare una pipetta da 200 a 1.000 microlitri per raccogliere le cellule staccate e trasferirle in una provetta da 15 millilitri. Aggiungere quattro millilitri di terreno per fermare la reazione enzimatica.
Quindi centrifugare a 225 volte g per cinque minuti a temperatura ambiente. Dopo aver scartato il surnatante, risospendere il pellet cellulare aggiungendo un millilitro di terreno e seminare le cellule in una nuova piastra di coltura o in un pallone. Le cellule tumorali sono state isolate da un liposarcoma rimosso chirurgicamente da un paziente di 54 anni.
L'ibridazione fluorescente in situ è stata eseguita per rilevare l'amplificazione di MDM2 nel campione di tessuto del paziente. L'analisi citologica dell'amplificazione di MDM2 in cellule tumorali isolate conferma la creazione di una coltura primaria derivata dal paziente. I cambiamenti morfologici rispetto alla base sono stati indotti quando le colture sono state trattate con Ifosfamide, Epirubicina, Ifosfamide ed Epirubicina, Trabectedina ed Eribulina.
Sono state eseguite tre repliche indipendenti per ogni esperimento di vitalità. I risultati hanno confermato la sensibilità delle colture alla chemioterapia. Il trattamento più attivo è stato la combinazione di ifosfamide ed epirubicina, una terapia di prima linea utilizzata nell'ALT-DDLPS avanzata o metastatica.
Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in 15-16 ore se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordarsi di sminuzzare finemente il campione tumorale. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire una serie di analisi a valle, tra cui la profilazione dell'espressione genica, l'analisi immunoistochimica o il saggio di citotossicità, al fine di rispondere a ulteriori domande sulla biologia del sarcoma dei tessuti molli.
Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo del sarcoma dei tessuti molli per studiare la storia naturale di queste neoplasie poco esplorate. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come stabilire una coltura primaria del sarcoma dei tessuti molli derivato dal paziente. Non dimenticare che lavorare con campioni biologici e farmaci può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni come indossare guanti e lavorare con una cappa aspirante.
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Panoramica
Questo protocollo descrive l'allestimento di una coltura primaria di sarcoma dei tessuti molli (STS) derivato da pazienti. Questo modello preclinico umano ha lo scopo di migliorare la comprensione della fisiopatologia del STS e delle risposte terapeutiche.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Oncoologia
- Biologia cellulare
- Ricerca preclinica
Sfondo
- I sarcomi dei tessuti molli sono malignità rare.
- Comprendere la loro base molecolare è fondamentale per una gestione efficace.
- I modelli attuali potrebbero non replicare completamente il comportamento del tumore umano.
- Questo metodo utilizza tessuto tumorale umano per ottenere informazioni più pertinenti.
Scopo dello studio
- Stabilire una coltura primaria da STS derivato da paziente.
- Indagare la patofisiologia del STS.
- Valutare le risposte terapeutiche utilizzando questo modello.
Metodi Utilizzati
- Isolamento di cellule tumorali da tessuto resecato chirurgicamente.
- Stabilimento di una coltura primaria per uso sperimentale.
- Test di farmaci convenzionali e innovativi.
- Analisi dell'attività farmacologica e del meccanismo d'azione.
Risultati principali
- Il modello fornisce informazioni sulla biologia del STS.
- Permette il test di agenti terapeutici.
- Dimostra l'eterogeneità dei tessuti tumorali.
- Facilita la comprensione delle interazioni tra cellule tumorali.
Conclusioni
- Questo modello è uno strumento prezioso per la ricerca preclinica.
- Migliora la comprensione delle risposte al trattamento del STS.
- Studi futuri potranno basarsi su questo lavoro fondamentale.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale Direttiva
La creazione di colture primarie derivate dal paziente di sarcomi dei tessuti molli soddisfa l'esigenza fondamentale di modelli preclinici biologicamente pertinenti nella scoperta di farmaci oncologici. Questo sistema di origine umana consente una riduzione del rischio meccanicistica dei candidati terapeutici preservando l'eterogeneità tumorale e la biologia specifica del paziente, sostenendo una maggiore affidabilità predittiva nella validazione degli obiettivi e nell'identificazione dei composti promettenti. Il modello favorisce una continuità traslazionale dalla fase di scoperta fino alla valutazione preclinica, riducendo il rischio biologico in fase avanzata nei percorsi mirati alla sarcoma.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo di Biopharma
Scoperta Precoce e Convalida del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche in un sistema rilevante per l'uomo che mantiene la citomorfologia nativa del tumore e i marcatori molecolari.
- Valore operativo: Supporta la validazione funzionale dei bersagli mediante profilo di sensibilità ai farmaci utilizzando agenti chemioterapici standard.
- Valore strategico: Migliora l'affidabilità predittiva modellando direttamente dai campioni del paziente i meccanismi fisiopatologici.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera colture standardizzate in monocstrato adatte a saggi quantitativi di vitalità e citotossicità.
- Valore operativo: Fornisce ingressi cellulari riproducibili per analisi successive, inclusi profili di espressione genica e immunotissutali.
- Valore strategico: Permette la valutazione scalabile di composti mediante densità di semina definite e protocolli di passaggio.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Mantiene la biologia rilevante per la malattia preservando le caratteristiche del tumore derivato dal paziente, inclusivo dello stato di amplificazione di MDM2 quando applicabile.
- Valore operativo: Consente la continuità dal primo isolamento alla coltura a lungo termine, per cicli ripetuti di test farmacologici.
- Valore strategico: Guida le decisioni di avanzamento con rischio calibrato dimostrando risposte dipendenti dalla dose a regimi clinicamente rilevanti.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nel processo di scoperta fornendo un modello cellulare umano per la verifica di ipotesi nella fase iniziale della scoperta, sistemi pronti per saggi per lo screening e output fenotipici misurabili per la validazione preclinica.
- Biologia della scoperta: Supporta l'indagine patofisiologica e la riduzione del rischio meccanicistico attraverso l'osservazione diretta dei cambiamenti morfologici indotti dai farmaci.
- Screening: Fornisce colture standardizzate e aderenti a densità definite per uno screening costante di composti e la determinazione dell'IC50.
- Analisi: Permette misurazioni quantitative di variabili dipendenti mediante saggi di vitalità, imaging a fluorescenza e analisi molecolare di colture trattate con farmaci.
- Ricerca traslazionale: Collega i risultati della scoperta alla continuità preclinica attraverso passaggi seriali e cicli ripetuti di trattamento.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma preclinica rinnovabile applicabile a diverse classi di farmaci e terapie combinate.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Riduce l'ambiguità meccanicistica collegando l'esposizione al farmaco a modifiche citologiche e molecolari osservabili nelle cellule tumorali umane.
- Valore operativo: Garantisce la riproducibilità attraverso protocolli standardizzati di digestione, filtrazione e semina con densità cellulari definite.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione dello sviluppo fornendo segnali precoci di efficacia da modelli derivati da tessuti umani prima degli studi in vivo.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione dei farmaci antitumorali per i sarcomi basata sulla sensibilità dimostrata in colture abbinabili ai pazienti, adeguata al rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella manipolazione di tessuti primari, digestione enzimatica e tecniche di coltura cellulare sterili.
- Dipende dall'accesso a campioni chirurgici freschi e a infrastrutture per la dissociazione basate su collagenasi.
- Necessita di metodi standardizzati di quantificazione (ad esempio, emocitometro o contatore automatico) per un'agevolazione costante.
- Comporta considerazioni di adattamento per sottotipi di sarcoma diversi e per la fragilità del tessuto durante la lavorazione meccanica.
- È limitato dalla vita utile finita delle colture primarie e dalla variabilità tra donatori nella cinetica di crescita.
