Un'analisi semplice e a basso costo per la misurazione della deambulazione in modelli murini di distrofia muscolare
29 dicembre 2017
Questo protocollo descrive un sistema flessibile, a basso costo per la misurazione della deambulazione del mouse in un'analisi di attività di campo aperto. Vi mostriamo un saggio di deambulazione di 6 minuti basato su questo sistema rileva una diminuzione nel movimento volontario nei topi mdx che distingue accuratamente miglioramento in un salvataggio di muscolo-specific di questi animali.
L'obiettivo generale di questo test è misurare la deambulazione volontaria in modelli murini di distrofia muscolare. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della distrofia muscolare sulla progressione della debolezza muscolare nei modelli murini di distrofia muscolare e sull'efficacia di potenziali terapie. Il vantaggio principale di questa tecnica è che fornisce una misurazione non invasiva e riproducibile dell'attività animale che può essere facilmente adattata a molti contesti di ricerca diversi.
In una stanza silenziosa a temperatura controllata a un'ora del giorno costante, posizionare una telecamera su una rete metallica sopra la camera di attività per consentire la registrazione in tutta l'arena e pulire la camera con disinfettante. Immediatamente prima della registrazione dell'attività, consentire al mouse di afferrare la barra polare di un dinamometro digitale e tirare delicatamente indietro fino a quando la barra polare non viene rilasciata. Registra la tensione di picco in Newton per ogni prova.
Con un minuto di riposo tra le prove. Immediatamente dopo il test della forza di presa, posizionare il mouse nella camera e avviare la registrazione video, consentendo al mouse di esplorare liberamente. Dopo sei minuti interrompere la registrazione e riportare il mouse nella sua gabbia di casa.
Per l'analisi del tracciamento dei dati video, aprire prima la registrazione nel software di editing video appropriato e impostare la velocità su due volte. Esporta il video decimato in formato file mp4 per l'analisi del tracciamento e apri il video nel programma di analisi video appropriato. Per impostare la calibrazione per la registrazione video, utilizzare lo strumento linea per tracciare una linea lungo un lato della camera.
Fare clic con il pulsante destro del mouse sulla linea, selezionare calibra misura e inserire le dimensioni effettive del lato della camera in centimetri. Per iniziare il tracciamento semiautomatico della posizione del mouse, fare clic sul cursore di spostamento. Partendo dal fotogramma iniziale del video, fare clic con il pulsante destro del mouse sul punto da tracciare.
Il punto di tracciamento sarà contrassegnato da un cerchio blu. Utilizzare la freccia destra sulla tastiera per far avanzare il fotogramma. Il punto di inseguimento dovrebbe spostarsi automaticamente in base alla posizione della base di coda.
Se la posizione di tracciamento non è allineata con il punto di interesse in un determinato fotogramma, allineate manualmente il cerchio blu alla posizione di avvicinamento. Quando l'intero video è stato tracciato, salva il video e la sovrapposizione di tracciamento e seleziona Esporta in foglio di calcolo per esportare i dati posizionali del tracciamento. Coerentemente con i risultati riportati da test simili, i topi mdx privi di distrofina sottoposti a un protocollo di esercizio immediatamente prima del test, dimostrano un movimento volontario significativamente inferiore in un test di sei minuti in campo aperto, rispetto agli animali di tipo selvatico.
Infatti, dopo il lieve sforzo di una sfida di forza di presa, i topi mdx in genere rimanevano fermi per i primi minuti del protocollo di deambulazione, con un modesto aumento del movimento di quattro o cinque minuti. Tuttavia, quando si confrontano animali selvatici e mdx senza una sfida di esercizio, non vengono rilevate differenze nella distanza percorsa. I topi Mdx transgenici per l'espressione dell'utrofina sono indistinguibili dagli animali di tipo selvatico senza differenze significative nella distanza totale percorsa o in uno qualsiasi dei punti temporali computativi osservati.
Per determinare l'effetto della diminuzione della frequenza di campionamento, è stata misurata la distanza totale percorsa da un minuto di video a piena velocità in fotogrammi e confrontata con le misurazioni della distanza derivate dalle versioni sottocampionate del set di dati. Riducendo della metà la frequenza dei fotogrammi, la distanza misurata è diminuita del 5% rispetto alla distanza calcolata originariamente. L'accuratezza della distanza misurata diminuisce bruscamente dopo questo punto, anche se anche i set di dati altamente decimati si avvicinano ancora molto al percorso dell'animale, evidenziando l'importanza di considerare la frequenza dei fotogrammi e l'elaborazione del segnale nella valutazione dell'attività animale e dimostrando che un'elevata risoluzione spaziale può essere mantenuta nei dati video sottocampionati.
Dopo aver visto questo video dovresti avere una buona comprensione di come registrare e analizzare la deambulazione del mouse in un ambiente di campo aperto. Una volta padroneggiata, questa analisi può essere completata in 15-30 minuti se eseguita correttamente. Questo test a basso costo e non invasivo consente ai ricercatori di esaminare l'attività motoria in modelli murini di distrofia muscolare e può servire come primo passo informativo per ulteriori misurazioni funzionali.
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Panoramica
Questo protocollo descrive un sistema flessibile ed economico per misurare la deambulazione del topo in un test di attività in campo aperto. Il metodo fornisce una misurazione non invasiva e riproducibile dell'attività animale, che può essere adattata a diverse impostazioni di ricerca.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Ricerca sulla distrofia muscolare
- Analisi comportamentale
Sfondo
- Il saggio misura la deambulazione volontaria in modelli murini di distrofia muscolare.
- Affronta questioni fondamentali riguardo alla progressione della debolezza muscolare.
- La tecnica è stata progettata per valutare l'efficacia di potenziali terapie.
- La registrazione viene effettuata in un ambiente controllato per garantire coerenza.
Scopo dello studio
- Misurare il movimento volontario nei topi mdx.
- Valutare l'impatto di interventi specifici per il muscolo.
- Fornire informazioni sulla progressione della distrofia muscolare.
Metodi Utilizzati
- Utilizzo di una telecamera posizionata sopra la camera di attività per la registrazione.
- Pulizia della camera con disinfettante prima delle prove.
- Permettere al topo di afferrare una sbarra verticale per misurare la tensione massima.
- Registrazione dell'attività durante un saggio di ambulazione della durata di 6 minuti.
Risultati principali
- Il sistema rileva diminuzioni del movimento volontario nei topi mdx.
- Distingue con precisione i miglioramenti dovuti al recupero specifico del muscolo.
- I risultati sono riproducibili in diversi esperimenti.
- Il metodo è adattabile a diverse impostazioni di ricerca.
Conclusioni
- Questo saggio è efficace per lo studio della distrofia muscolare nei topi.
- Fornisce dati preziosi sull'efficacia di potenziali trattamenti.
- L'approccio è flessibile e può essere utilizzato in diversi ambienti di ricerca.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La misurazione dell'ambulazione volontaria in modelli murini fornisce un'analisi traslazionale della funzione motoria nella distrofia muscolare, direttamente analoga a endpoint clinici come il test del cammino di 6 minuti. Questo saggio basato su video, a basso costo, consente una valutazione riproducibile e non invasiva dell'evoluzione della malattia e della risposta terapeutica negli studi preclinici. Rilevando deficit di attività nei topi mdx privi di distrofina e il loro recupero mediante espressione di utrofina, il metodo supporta la validazione degli obiettivi terapeutici e la riduzione del rischio meccanicistico nella scoperta di farmaci per le malattie neuromuscolari.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Verifica ipotesi terapeutiche quantificando la deambulazione volontaria come parametro funzionale della forza muscolare in modelli distrofici.
- Valore operativo: Consente la riduzione del rischio biologico mediante una correlazione genotipo-fenotipo riproducibile nei topi mdx rispetto ai gruppi wild-type e recuperati.
- Valore predittivo: Supporta la selezione del portafoglio terapeutico distinguendo gli interventi efficaci (ad esempio, transgene dell'utrofina) che normalizzano i livelli di attività fino a quelli dei soggetti wild-type.
Sviluppo di screening e saggi
- Prontezza del saggio: Prepara sistemi biologici validati per lo screening di composti successivi utilizzando metriche standardizzate di ambulazione in campo aperto.
- Riproducibilità: Fornisce output quantitativi basati su distanza e tempo, adatti alla standardizzazione del saggio tra diversi laboratori.
- Scalabilità: Sfrutta software open source gratuito e hardware accessibile per consentire il riutilizzo della piattaforma in diversi contesti di ricerca senza l'impiego di attrezzature specializzate.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Rilevanza per la malattia: Modella deficit di deambulazione rilevanti per il paziente, fornendo una continuità traslazionale dalla scoperta alla validazione preclinica.
- Valutazione meccanicistica dei rischi: Chiarisce se gli effetti osservati derivano da un ripristino specifico del muscolo o da cambiamenti aspecifici dell'attività.
- Decisioni basate sulla valutazione del rischio: Fornisce informazioni per criteri di prosegui/non prosegui correlando il recupero della deambulazione con l'interazione con il bersaglio e la modulazione del percorso metabolico.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il saggio si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla validazione del bersaglio all'identificazione di un composto promettente, offrendo un collegamento funzionale tra meccanismi molecolari e risultati fenotipici nei modelli di distrofia muscolare.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi collegando interventi genetici o farmacologici a modifiche misurabili nel movimento volontario.
- Screening: Permette la prontezza del saggio attraverso un tracciamento riproducibile basato su video, generando parametri quantificabili dell'andatura per la valutazione dei composti.
- Analisi: Produce flussi di dati spaziali e temporali che consentono ai gruppi di lavoro di confrontare l'attività locomotoria tra diversi genotipi, trattamenti e punti temporali.
- Ricerca traslazionale: Si collega alla continuità preclinica riproducendo valutazioni cliniche dell'andatura, facilitando l'allineamento dei biomarcatori e la modellizzazione predittiva.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una capacità riutilizzabile e a basso costo per i test dell'andatura, riducendo la dipendenza da strutture centralizzate specializzate.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione degli obiettivi riducendo l'ambiguità meccanicistica nei saggi della funzione motoria.
- Valore operativo: Migliora la standardizzazione e la riproducibilità grazie al tracciamento open source e a condizioni ambientali controllate.
- Valore strategico: Migliora l'efficienza del capitale eliminando la necessità di sistemi costosi di tracciamento del movimento pur mantenendo la qualità dei dati.
- Impatto sul portafoglio: Permette decisioni di avanzamento corrette per il rischio basate sul recupero funzionale dei fenotipi della deambulazione in modelli preclinici.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze di base nella registrazione video e nell'utilizzo di software di tracciamento open source (ad esempio, allineamento manuale fotogramma per fotogramma).
- Si basa su apparecchiature di imaging standard e su controlli ambientali costanti (illuminazione, temperatura, ora del giorno).
- Necessita di un rigoroso rispetto del protocollo da parte di tutti i membri del team per garantire la riproducibilità tra diversi siti e operatori.
- Richiede considerazioni adattative per diverse dimensioni delle camere, ceppi di topi e livelli di attività.
- Comporta compromessi tra frequenza dei fotogrammi e accuratezza delle misurazioni, poiché il sottocampionamento riduce la precisione nel calcolo delle distanze.
