Un'analisi semplice e a basso costo per la misurazione della deambulazione in modelli murini di distrofia muscolare
29 dicembre 2017
Questo protocollo descrive un sistema flessibile, a basso costo per la misurazione della deambulazione del mouse in un'analisi di attività di campo aperto. Vi mostriamo un saggio di deambulazione di 6 minuti basato su questo sistema rileva una diminuzione nel movimento volontario nei topi mdx che distingue accuratamente miglioramento in un salvataggio di muscolo-specific di questi animali.
L'obiettivo generale di questo test è misurare la deambulazione volontaria in modelli murini di distrofia muscolare. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della distrofia muscolare sulla progressione della debolezza muscolare nei modelli murini di distrofia muscolare e sull'efficacia di potenziali terapie. Il vantaggio principale di questa tecnica è che fornisce una misurazione non invasiva e riproducibile dell'attività animale che può essere facilmente adattata a molti contesti di ricerca diversi.
In una stanza silenziosa a temperatura controllata a un'ora del giorno costante, posizionare una telecamera su una rete metallica sopra la camera di attività per consentire la registrazione in tutta l'arena e pulire la camera con disinfettante. Immediatamente prima della registrazione dell'attività, consentire al mouse di afferrare la barra polare di un dinamometro digitale e tirare delicatamente indietro fino a quando la barra polare non viene rilasciata. Registra la tensione di picco in Newton per ogni prova.
Con un minuto di riposo tra le prove. Immediatamente dopo il test della forza di presa, posizionare il mouse nella camera e avviare la registrazione video, consentendo al mouse di esplorare liberamente. Dopo sei minuti interrompere la registrazione e riportare il mouse nella sua gabbia di casa.
Per l'analisi del tracciamento dei dati video, aprire prima la registrazione nel software di editing video appropriato e impostare la velocità su due volte. Esporta il video decimato in formato file mp4 per l'analisi del tracciamento e apri il video nel programma di analisi video appropriato. Per impostare la calibrazione per la registrazione video, utilizzare lo strumento linea per tracciare una linea lungo un lato della camera.
Fare clic con il pulsante destro del mouse sulla linea, selezionare calibra misura e inserire le dimensioni effettive del lato della camera in centimetri. Per iniziare il tracciamento semiautomatico della posizione del mouse, fare clic sul cursore di spostamento. Partendo dal fotogramma iniziale del video, fare clic con il pulsante destro del mouse sul punto da tracciare.
Il punto di tracciamento sarà contrassegnato da un cerchio blu. Utilizzare la freccia destra sulla tastiera per far avanzare il fotogramma. Il punto di inseguimento dovrebbe spostarsi automaticamente in base alla posizione della base di coda.
Se la posizione di tracciamento non è allineata con il punto di interesse in un determinato fotogramma, allineate manualmente il cerchio blu alla posizione di avvicinamento. Quando l'intero video è stato tracciato, salva il video e la sovrapposizione di tracciamento e seleziona Esporta in foglio di calcolo per esportare i dati posizionali del tracciamento. Coerentemente con i risultati riportati da test simili, i topi mdx privi di distrofina sottoposti a un protocollo di esercizio immediatamente prima del test, dimostrano un movimento volontario significativamente inferiore in un test di sei minuti in campo aperto, rispetto agli animali di tipo selvatico.
Infatti, dopo il lieve sforzo di una sfida di forza di presa, i topi mdx in genere rimanevano fermi per i primi minuti del protocollo di deambulazione, con un modesto aumento del movimento di quattro o cinque minuti. Tuttavia, quando si confrontano animali selvatici e mdx senza una sfida di esercizio, non vengono rilevate differenze nella distanza percorsa. I topi Mdx transgenici per l'espressione dell'utrofina sono indistinguibili dagli animali di tipo selvatico senza differenze significative nella distanza totale percorsa o in uno qualsiasi dei punti temporali computativi osservati.
Per determinare l'effetto della diminuzione della frequenza di campionamento, è stata misurata la distanza totale percorsa da un minuto di video a piena velocità in fotogrammi e confrontata con le misurazioni della distanza derivate dalle versioni sottocampionate del set di dati. Riducendo della metà la frequenza dei fotogrammi, la distanza misurata è diminuita del 5% rispetto alla distanza calcolata originariamente. L'accuratezza della distanza misurata diminuisce bruscamente dopo questo punto, anche se anche i set di dati altamente decimati si avvicinano ancora molto al percorso dell'animale, evidenziando l'importanza di considerare la frequenza dei fotogrammi e l'elaborazione del segnale nella valutazione dell'attività animale e dimostrando che un'elevata risoluzione spaziale può essere mantenuta nei dati video sottocampionati.
Dopo aver visto questo video dovresti avere una buona comprensione di come registrare e analizzare la deambulazione del mouse in un ambiente di campo aperto. Una volta padroneggiata, questa analisi può essere completata in 15-30 minuti se eseguita correttamente. Questo test a basso costo e non invasivo consente ai ricercatori di esaminare l'attività motoria in modelli murini di distrofia muscolare e può servire come primo passo informativo per ulteriori misurazioni funzionali.
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Panoramica
Questo protocollo descrive un sistema flessibile e a basso costo per misurare l'ambulazione del topo in un saggio di attività in campo aperto. Il metodo fornisce una misurazione non invasiva e riproducibile dell'attività animale, che può essere adattata a vari contesti di ricerca.
Componenti chiave dello studio
Area della scienza
- Neuroscienze
- Ricerca sulla distrofia muscolare
- Analisi comportamentale
Contesto
- Il saggio misura l'ambulazione volontaria nei modelli di topo di distrofia muscolare.
- Affronta questioni chiave sulla progressione della debolezza muscolare.
- La tecnica è progettata per valutare l'efficacia di potenziali terapie.
- La registrazione viene eseguita in un ambiente controllato per garantire coerenza.
Obiettivo dello studio
- Misurare il movimento volontario nei topi mdx.
- Valutare l'impatto di interventi specifici per i muscoli.
- Fornire informazioni sulla progressione della distrofia muscolare.
Metodi utilizzati
- Utilizzo di una telecamera posizionata sopra la camera di attività per la registrazione.
- Pulizia della camera con disinfettante prima dei test.
- Permette al topo di afferrare una barra verticale per misurare la tensione di picco.
- Registrazione dell'attività durante un saggio di ambulation di 6 minuti.
Principali risultati
- Il sistema rileva diminuzioni del movimento volontario nei topi mdx.
- Distingue accuratamente i miglioramenti dovuti al recupero specifico per i muscoli.
- I risultati sono riproducibili in diversi test.
- Il metodo è adattabile a vari contesti di ricerca.
Conclusioni
- Questo saggio è efficace per studiare la distrofia muscolare nei topi.
- Fornisce dati preziosi sull'efficacia di potenziali trattamenti.
- L'approccio è flessibile e può essere utilizzato in diversi ambienti di ricerca.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Measuring voluntary ambulation in mouse models provides a translational readout for motor function in muscular dystrophy, directly analogous to clinical endpoints like the 6-minute walk test. This low-cost, video-based assay enables reproducible, non-invasive assessment of disease progression and therapeutic response in preclinical studies. By detecting activity deficits in dystrophin-null mdx mice and rescue via utrophin expression, the method supports target validation and mechanistic de-risking in neuromuscular drug discovery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by quantifying voluntary ambulation as a functional readout of muscle strength in dystrophic models.
- Operational Value: Enables biological de-risking through reproducible, genotype-phenotype correlation in mdx mice versus wild-type and rescued cohorts.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by distinguishing effective interventions (e.g., utrophin transgene) that normalize activity levels to wild-type.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream compound screening using standardized open-field ambulation metrics.
- Reproducibility: Delivers quantitative distance and time-based outputs amenable to assay standardization across laboratories.
- Scalability: Leverages free, open-source software and accessible hardware to enable platform reuse in diverse research settings without specialized equipment.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models patient-relevant ambulation deficits, providing translational continuity from discovery through preclinical validation.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether observed effects stem from muscle-specific rescue versus nonspecific activity changes.
- Risk-Adjusted Decisions: Informs go/no-go criteria by correlating ambulation recovery with target engagement and pathway modulation.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the discovery continuum from target validation to lead identification, offering a functional bridge between molecular mechanisms and phenotypic outcomes in muscular dystrophy models.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by linking genetic or pharmacological interventions to measurable changes in voluntary movement.
- Screening: Enables assay readiness through reproducible, video-based tracking that generates quantifiable ambulation endpoints for compound evaluation.
- Analytics: Generates positional and temporal data streams that allow teams to compare locomotor activity across genotypes, treatments, and time points.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by mirroring clinical ambulation assessments, facilitating biomarker alignment and predictive modeling.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, low-cost capability for ambulation testing that reduces dependency on specialized core facilities.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in motor function assays.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility through open-source tracking and controlled environmental conditions.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by eliminating need for expensive motion-tracking systems while maintaining data quality.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement decisions based on functional rescue of ambulation phenotypes in preclinical models.
Implementation Considerations
- Requires basic expertise in video recording and open-source tracking software (e.g., manual frame-by-frame alignment).
- Depends on standard imaging equipment and consistent environmental controls (lighting, temperature, time of day).
- Necessitates cross-team protocol adherence to ensure reproducibility across sites and operators.
- Involves adaptation considerations for different chamber sizes, mouse strains, and activity levels.
- Involves trade-offs between frame rate and measurement accuracy, as downsampling reduces precision in distance calculation.
