Preparazione ottimale di formalina riparata campioni per Peptide basati su matrice assistita spettrometria totale di desorbimento/ionizzazione Laser i flussi di lavoro di Imaging

L'obiettivo generale di questa procedura è preparare in modo riproducibile un campione di tessuto per l'imaging con spettrometria di massa peptidica. Questo metodo consente agli utenti inesperti di spettrometria di massa di sviluppare i propri flussi di lavoro di spettrometria di massa per immagini senza passare attraverso lunghe determinazioni empiriche. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è altamente riproducibile, semplice da implementare e utilizza metodologie convenienti.

Per preparare i vetrini rivestiti di nitrocellulosa, pipettare 40 microlitri di nitrocellulosa liquida su un bordo del vetrino da microscopio conduttivo in ossido di indio e stagno. Utilizzando un normale vetrino da microscopio in vetro, trascinare la nitrocellulosa sotto tensione superficiale sul vetrino per creare un rivestimento uniforme a film sottile. Lasciare asciugare la nitrocellulosa a temperatura ambiente per 20 secondi, quindi conservarla fino al momento dell'utilizzo a temperatura ambiente.

Quindi, crea camere di vapore personalizzate tagliando un pezzo di carta assorbente spessa abbastanza grande da adattarsi alla metà inferiore di una capsula di Petri in plastica standard. Taglia la carta per lasciare al centro una striscia rettangolare delle stesse dimensioni di un vetrino da microscopio. Lasciare abbastanza eccesso in modo che la carta mantenga la sua posizione nella capsula di Petri.

Per il tessuto FFPE, montare le sezioni sui vetrini ITO pre-rivestiti in nitrocellulosa come descritto nel protocollo di testo. Immergere i vetrini in xilene fresco per rimuovere i residui di paraffina per due minuti. Lavare i campioni deparaffizzati immergendo i vetrini in una serie di solventi graduati costituiti da una soluzione acquosa di etanolo al 70% in volume per volume, seguita da etanolo al 100%, per 30 secondi.

Quindi, immergere i vetrini nel fluido di Carnoy per due minuti. Infine, immergere i vetrini in una serie di etanolo al 100%, acqua ultrapura e di nuovo etanolo al 100%, per 30 secondi. Caricare i vetrini del campione in una scatola di plastica riempita fino in cima con tris HCO da 20 millimolari.

Sigillare la scatola e metterla a bagnomaria contenente 500 millilitri di acqua, lasciando che la scatola tocchi il fondo della vasca. Quindi riscaldare la scatola per 15 minuti a 120 gradi Celsius in una pentola a pressione, che può raggiungere una pressione di esercizio di 70 kilopascal. Togliete i vetrini, lasciateli raffreddare e lasciateli asciugare a temperatura ambiente per 15 minuti.

Una volta idrolizzati, rivestire i campioni con 10 microlitri di soluzione di tripsina in acqua ultrapura pipettando prima 10 microlitri di soluzione sul bordo della sezione di tessuto. Quindi, utilizzando la stessa punta della pipetta, trascinare la gocciolina su tutta la superficie del tessuto sotto tensione superficiale. Dopo aver lasciato asciugare i campioni a temperatura ambiente, montarli all'interno della parte superiore della camera di vapore precedentemente costruita con nastro per autoclave su entrambi i bordi del vetrino.

Pipettare con cautela 600 microlitri di una soluzione contenente una miscela da volume a uno di acetonitrile al 100% e bicarbonato di ammonio 50 millimolare sul dito di carta assorbente nella parte inferiore della capsula di Petri, fino a quando il dito non appare uniformemente bagnato. Il pipettaggio è di fondamentale importanza perché un pipettaggio errato comporterà la delocalizzazione della matrice e degli analoidi di superficie, che distruggerà le informazioni spaziali contenute nel campione. Posizionare la metà superiore della camera di vapore sulla metà inferiore, assicurandosi che il dito di carta e il vetrino del campione siano perfettamente allineati, e sigillare la camera attorno al suo equatore con un film di paraffina.

Lasciare il campione per una notte in un'incubatrice a 37 gradi Celsius per consentire la completa digestione. Una volta digerito, lasciare il vetrino su una bilancia microanalitica a cinque cifre. Montare il vetrino sul dito di raffreddamento dell'apparecchio di sublimazione e fissarlo con nastro di rame nello stesso modo descritto per la camera di vapore.

Mettere 300 milligrammi di matrice CHCA in una capsula di Petri di vetro sul fondo della camera e distribuirla uniformemente per creare un sottile strato di cristalli di matrice. Assemblare il sublimatore. E fissare le due metà con il morsetto a ferro di cavallo.

Sospendi l'unità assemblata da 15 a 20 centimetri sopra un bagno di sabbia, preriscaldato a 220 gradi Celsius, posizionandolo in un anello metallico collegato a un supporto per storte. Collegare la camera alla fonte del vuoto, attivare il vuoto e lasciarlo stabilizzare fino a circa 25 millitorr per cinque minuti. Riempire il dito di raffreddamento con ghiaccio e aggiungere 50 millilitri di acqua.

Lasciare riposare l'apparecchio per altri cinque minuti prima di procedere. Abbassare la camera sulla superficie del supporto, assicurandosi che la sabbia entri completamente in contatto con il fondo della camera. Lasciare agire per 45 minuti per creare un rivestimento ideale di 0,22 milligrammi per centimetro quadrato.

Dopo 45 minuti, rimuovere la camera dal bagno di sabbia sollevando l'anello metallico e sfiatare la camera. Una volta sublimato, montare il vetrino del campione all'interno della parte superiore della camera di vapore precedentemente costruita, come in precedenza. Pipettare con cura 600 microlitri di una soluzione contenente una miscela di acquosa di acetonitrile e acido trifluoroacetico in acqua per volume di uno a uno sulla carta assorbente nella parte inferiore della capsula di Petri per garantire un rivestimento uniforme.

Quindi, assemblare la camera, assicurandosi che la linguetta di carta e il vetrino del microscopio siano perfettamente allineati. Lasciare la camera in un'incubatrice a 37 gradi Celsius per un'ora. Scansiona il vetrino in uno scanner piano per creare un'immagine digitale.

Caricare il campione nello spettrometro di massa, quindi analizzarlo utilizzando la piattaforma software appropriata. Infine, analizzare i campioni come descritto nel protocollo di testo. Qui è mostrato un campione di tessuto correttamente elaborato che è stato ripreso a 50 micron e mostra una buona macrostruttura e una chiara differenza tra materia bianca e materia grigia.

I campioni confrontati con successo mostreranno una chiara differenziazione in diverse posizioni tissutali. Qui, c'è una chiara regione di sovraregolazione del peptide rappresentata da un rapporto massa-carica di 1,085 nella regione della sostanza bianca, rappresentata dalle regioni bianche. Al contrario, questo campione preparato in modo errato mostra un livello di delocalizzazione su larga scala.

I modelli delle molecole presenti nei tre pannelli dimostrano chiaramente che non esiste una definizione chiara tra le regioni biologiche o le differenze nell'abbondanza delle molecole visualizzate. Dopo aver visto questo video, dovresti avere un'idea davvero buona di come preparare i tuoi campioni per l'analisi dell'imaging dei peptidi. Con una procedura adeguata, questo metodo può essere eseguito entro otto ore in due giorni, consentendo una fase di digestione notturna.

Durante la preparazione di questa metodologia, è importante prestare attenzione durante ogni fase. Qualsiasi danno fisico che si verifica al tessuto distruggerà le informazioni spaziali contenute nel campione. Abbiamo avuto l'idea di questa metodologia quando abbiamo iniziato le nostre indagini spaziali IMS e ci siamo resi conto che non c'erano altre metodologie definitive pubblicate.

Con piccole modifiche, la nostra metodologia può essere applicata all'analisi di proteine, peptidi, lipidi e altre piccole molecole. Dopo questa procedura, è possibile applicare al campione altre tecniche istologiche, come l'immunofluorescenza e la colorazione con ematossilina ed eosina, al fine di ottenere un punto di riferimento per i dati della spettrometria di massa per immagini. Quando si lavora con sostanze chimiche potenzialmente esplosive, come la nitrocellulosa liquida, è importante mantenere le corrette procedure di sicurezza.

Ridurre al minimo i volumi di lavoro e smaltire immediatamente i rifiuti è di fondamentale importanza.