Un'analisi cinetica basata sulla fluorescenza Ca^{2 +} mobilizzazione per identificare il G proteina-ha accoppiato il ricevitore agonisti, antagonisti e modulatori allosterici

L'obiettivo generale di questo saggio basato su cellule è identificare e caratterizzare molecole in grado di stimolare o inibire la mobilizzazione intracellulare del calcio mediata dal recettore accoppiato alla proteina G. Questo metodo può essere un saggio prezioso per la scoperta di farmaci con recettori accoppiati a proteine G perché può essere utilizzato per lo screening di molecole che modificano i corpi di calcio intracellulari mediati dal recettore. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente di identificare molecole con proprietà agonistiche o antagoniste all'interno dello stesso saggio.

Questo test può aiutare nella scoperta di nuovi farmaci candidati che agiscono sui recettori accoppiati a proteine G, promettenti bersagli terapeutici che svolgono un ruolo in molte malattie umane. Il giorno del passaggio delle cellule, rivestire ogni pozzetto di una piastra a 96 pozzetti in polistirene nero con fondo trasparente con 100 microlitri di soluzione di gelatina allo 0,1% e incubare le piastre per due ore a temperatura ambiente. Mentre la gelatina si solidifica, utilizzare una soluzione di tripsina EDTA per sollevare le cellule di interesse dal fondo del loro pallone di coltura, risospendendo le cellule in un terreno di crescita fresco in una provetta conica da 50 millilitri una volta che si sono staccate.

Dopo il conteggio, raccogliere le cellule mediante centrifugazione e risospendere il pellet in un terreno di crescita fresco a una concentrazione di una volta 10 fino alla quinta cellula vitale per millilitro. Quando le piastre sono pronte, scartare la soluzione di gelatina in eccesso e asciugare le piastre su un fazzoletto di laboratorio. Quindi lavare i pozzetti con 200 microlitri di PBS e sostituire il lavaggio con 200 microlitri di cellule per pozzetto per un'incubazione notturna a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.

La mattina successiva, picchiettare la piastra per scartare il terreno di coltura dai pozzetti e asciugare la piastra a testa in giù su un tovagliolo di carta. Quindi etichettare le cellule in ciascun pozzetto con 100 microlitri di soluzione di colorante di caricamento per pozzetto e incubare la piastra per 45 minuti al buio a temperatura ambiente. Mentre le cellule sono in incubazione, aggiungere 75 microlitri di CXCL12 per pozzetto alla piastra per chemochine e 50 microlitri del composto di interesse a ciascun pozzetto della piastra composta.

Quindi, accendere l'unità di raffreddamento del lettore di piastre a fluorescenza, seguita dal lettore di piastre stesso. Dopo aver lasciato che il sistema si avvii per alcuni minuti, aprire il software del lettore di piastre. Per impostare il protocollo del test, nella scheda delle impostazioni selezionare la modalità di lettura e le lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione appropriate per il colorante di caricamento.

Selezionare la miscela con la linguetta del fluido di trasferimento per la miscelazione automatica dei composti nella piastra del composto. Nella linguetta del fluido di trasferimento, posizionare 20 microlitri di ciascun pozzetto dalla piastra del composto da trasferire nella piastra di misurazione e posizionare i puntali della pipetta a 20 microlitri sotto la superficie del liquido. Impostare la velocità di aspirazione a 50 microlitri al secondo e la velocità di erogazione a 25 microlitri al secondo e fare clic su Leggi con fluido di trasferimento.

Durante il primo intervallo, selezionare 60 letture con un intervallo di lettura di un secondo, con 10 letture da registrare prima che i composti vengano dispensati nella piastra di misurazione e 50 letture da completare dopo. Impostare il secondo intervallo con un intervallo di lettura di 30 secondi e 18 letture. Selezionare tre lavaggi delle punte per il protocollo, impostando ogni fase di lavaggio in modo che includa il fluido di lavaggio appropriato, un ciclo di lavaggio, una velocità della pompa elevata e cinque colpi per lavaggio.

Utilizzare la funzione di pausa del pipettatore per includere la pausa del pipettatore di 300 secondi e utilizzare l'impostazione della miscela con fluido di trasferimento per consentire la miscelazione automatica della soluzione CXCL12 all'interno della piastra delle chemochine. Nella successiva linguetta del fluido di trasferimento, posizionare 25 microlitri da ciascun pozzetto della piastra per chemochine da trasferire alla piastra di misurazione e posizionare i puntali 20 microlitri sotto la superficie del liquido. Impostare la velocità di aspirazione a 50 microlitri al secondo e la velocità di erogazione a 25 microlitri al secondo.

Utilizzare il pulsante di lettura con fluido di trasferimento per impostare il primo intervallo in modo da includere 145 letture con un intervallo di lettura di un secondo. Impostare il secondo intervallo su un intervallo di lettura di sei secondi e 20 letture. Selezionare altri tre cicli di lavaggio.

Quindi fare clic su imposta temperatura stage e impostare la temperatura del dispositivo su 37 gradi Celsius. Al termine dell'incubazione del colorante di caricamento, scartare il tampone dalla piastra di misurazione e asciugare la piastra su un fazzoletto di laboratorio. Lavare le cellule con 150 microlitri per pozzetto di tampone per saggio, sostituendo il tampone con 80 microlitri di tampone per saggi dopo due minuti.

Posizionare la piastra di misurazione nella posizione di lettura, la piastra composta nella posizione due della sorgente, la piastra delle chemochine nella posizione tre della sorgente e una scatola di punte nere nella posizione della sorgente uno. Chiudere il dispositivo e fare clic su test del segnale del protocollo per determinare le unità di luce relativa allo sfondo e la varianza della fluorescenza sulla piastra. Selezionare il segnale di test nella finestra popup.

Se si ottengono valori di sfondo compresi tra 8.000 e 10.000 unità di luce relativa, selezionare Aggiorna e fare clic su Salva per salvare il protocollo principale. Quindi premere Esegui per avviare il saggio. In questo grafico, si può osservare un aumento dose-dipendente della fluorescenza correlato all'aumento dose-dipendente del rilascio di calcio.

L'aumento dei livelli di fluorescenza indotta da CXCL12 consente la generazione di una curva dose-risposta basata sulla differenza tra la risposta minima e massima rispetto al basale tra la prima misurazione dopo l'aggiunta della chemochina e la misurazione finale nel protocollo. Nessuna risposta fluorescente correlata al calcio è stata evocata da CXCL12 anche ad alta concentrazione quando sono state utilizzate cellule prive del corrispondente recettore funzionale delle chemochine CXCR4, dimostrando la specificità recettoriale della misurazione evocata da CXCL12. Un'applicazione chiave di questo test basato su cellule è l'identificazione di piccole molecole che, dopo la pre-incubazione, inibiscono in modo dose-dipendente la mobilizzazione del calcio indotta da CXCL12 nelle cellule rispetto ai composti non attivi di controllo che non inibiscono la risposta.

Per determinare la potenza inibitoria di piccole molecole, è possibile generare una curva dose-risposta per le molecole inibitorie utilizzando la regressione non lineare. Questo test può essere utilizzato per studiare altri recettori accoppiati a proteine G con un'ulteriore ottimizzazione minima o assente, nonché in questo esperimento in cui è stato osservato un aumento dose-dipendente della fluorescenza quando un altro recettore delle chemochine, CCR5, è stato stimolato con il suo agonista chemochinico naturale CCL5. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere utilizzata per studiare molti altri recettori accoppiati a proteine G che segnalano attraverso la mobilizzazione degli ioni calcio intracellulari all'attivazione del recettore.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come questo test cellulare può essere utilizzato per identificare agonisti e antagonisti del recettore delle chemochine CXCL4.