Name: Virus di Zika specifico diagnostico dellepitopo Discovery (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 37 s
Description: Impara a identificare peptidi specifici del virus Zika per diagnosi sierologica utilizzando microarray di alta densità. Questo metodo rileva anticorpi IgM e IgG nel siero, fornendo una cronologia dell'infezione utile per le donne in gravidanza.

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Il supporto corrente è fornito da una sovvenzione di supplemento amministrativo SBIR (Small Business Innovation Research) da NIDCRR44 DE024456. Concessione di NIDCR HIV che l'evoluzione di NIDCR concedere U01 DE017855 per lo sviluppo di una conferma diagnostica point-of-care per l'HIV. Noi riconosciamo con gratitudine Silke Weisenburger(PEPperPRINT Heidelberg, Germany) per la sua assistenza tecnica e supporto. Ringraziamo anche NYU Langone Medical Center per la LI-COR Odyssey Imaging System.

Questi dati sono una parte di uno studio di ricerca condotto presso la New York University College of Dentistry e sono stati approvati dal comitato di revisione istituzionale della New York University School of Medicine, IRB # H10-01894. Campioni clinici utilizzati in questo studio sono stati de-identificati campioni precedentemente utilizzati per la diagnosi e con permesso da Wadsworth Center di New York State Department di salute, Albany, NY.
1. installazione di ZIKV ad alta densità Peptide Microarray fare scorrere in un determinato cassetto incubazione
<ol><li>Gestire il vetrino per i bordi con guanti senza polvere. Le dimensioni di diapositiva di vetro sono 75,4 mm 25,0 mm e 1 mm di spessore. Porre il vetrino nel cassetto incubazione con la superficie di microarray rivolto verso l'alto.</li>
	<li>Posizionare il lato lucido del sigillo rivolta verso il basso sulla superficie stampata microarray. Per garantire una buona posizione, si sovrappongono i fori delle viti del sigillo e la piastra di base.</li>
	<li>Posizionare la parte superiore del vassoio sul sigillo per creare una camera di microarray.</li>
	<li>Serrando la diapositiva nel vassoio ugualmente le viti ad alette uno dopo l'altro a mano in uno schema alternato a partire dall'alto a sinistra seguito da in basso a destra. Posizionare il coperchio del cassetto incubazione.</li>
</ol>2. sfondo Interaction Detection: Macchiando il Microarray con anticorpi secondari
Nota: Utilizzare una pipetta per depositare le soluzioni (standard e blocco buffer, anticorpi secondari diluiti) nell'angolo della camera di microarray.
<ol><li>Incubare il microarray con un tampone standard (1 x tamponato fosfato salino (PBS), 0,05% di Tween 20, pH 7.4, filtrato con un filtro da 0,45 µm) (volume totale di 2.000 µ l/microarray) per 15 min a temperatura ambiente (TA) su agitatore orbitale a 140 giri/min.</li>
	<li>Rimuovere il tampone standard aspirando con una pipetta dall'angolo della camera del microarray. Riempire portavetrini vuoto con diapositive vuote per evitare la rottura della diapositiva microarray.</li>
	<li>Bloccare il microarray con il tampone bloccante (volume totale di 2.000 µ l/microarray) per 60 min a temperatura ambiente su agitatore orbitale a 140 giri/min.</li>
	<li>Rimuovere il tampone bloccante aspirando con una pipetta dall'angolo della camera del microarray.</li>
	<li>Incubare il microarray con anticorpo secondario, fluorocromo di IgM anti-umano coniugato, diluito 1: 5.000 (volume totale di 2.000 µ l/microarray) nella macchiatura buffer (10% blocco buffer nel buffer standard) per 30 min a temperatura ambiente al buio in un agitatore orbitale a 140 giri/min.</li>
	<li>Rimuovere l'anticorpo secondario aspirando con una pipetta dall'angolo della camera del microarray.</li>
	<li>Lavare il microarray 3 x, 1 min per lavaggio con tampone standard (volume totale di 2.000 µ l/microarray a temperatura ambiente su agitatore orbitale a 140 giri/min. Dopo ogni lavaggio, è necessario rimuovere il tampone standard aspirando con una pipetta dall'angolo della camera del microarray.</li>
	<li>Immergere la diapositiva 2 x in un buffer tuffantesi preparato al momento (1 mM Tris, pH 7.4), (volume totale di 200 mL).</li>
	<li>Asciugare accuratamente, il microarray per circa 1 min, aspirando il liquido in eccesso con molta attenzione dalla parte superiore alla parte inferiore della diapositiva senza toccare la superficie di scorrimento. Analizzare il vetrino in un lettore di scanner di microarray.</li>
</ol>3. esposizione del Microarray per ospitare siero
Attenzione: Eseguire questo passaggio in condizioni di sicurezza del laboratorio, livello 2 di biosicurezza (BSL-2) a causa della potenziale natura infettiva degli esemplari del siero. Lavorare all'interno di una classe II biologica sicurezza gabinetto (BSC).
<ol><li>Inattivare il campione di siero a 56 ° C per 30 min e centrifugare a 16.000 rcf per 5 min a 4 ° C13. Nota: Utilizzare una pipetta per depositare le soluzioni (colorazione, tampone standard e siero diluito) nell'angolo della camera di microarray.</li>
	<li>Diluire il campione di siero nel buffer colorazione a partire con una diluizione di 1:1,000 (volume totale di 2.000 μL/microarray). Conservare a 4 ° C fino all'utilizzo.</li>
	<li>Incubare il microarray con il buffer di colorazione (volume totale di 2.000 μL/microarray) per 15 min a temperatura ambiente su agitatore orbitale a 140 giri/min.</li>
	<li>Rimuovere il buffer di macchiatura aspirando con una pipetta dall'angolo della camera del microarray.</li>
	<li>Incubare il microarray con il campione di siero diluito durante la notte a 4 ° C su agitatore orbitale a 140 giri/min.</li>
	<li>Rimuovere il campione di siero diluito aspirando con una pipetta dall'angolo della camera del microarray.</li>
	<li>Lavare il microarray 3 x, 1 min per lavaggio con tampone standard (volume totale di 2.000 μL/microarray a temperatura ambiente su agitatore orbitale a 140 giri/min. Dopo ogni lavaggio, è necessario rimuovere il tampone standard aspirando con una pipetta dall'angolo della camera del microarray.</li>
</ol>4. colorazione con gli anticorpi secondari e contrassegnata come controllo
Nota: Utilizzare una pipetta per depositare le soluzioni (buffer standard, secondario diluito e gli anticorpi etichetta) nell'angolo della camera di microarray.
<ol><li>Diluire l'anticorpo secondario nel buffer di colorazione. Nota: Uso anti-umano IgM fluorocromo coniugate dell'anticorpo o anticorpo coniugato con fluorocromo di IgG anti-umano ad una diluizione di 1:5,000 (volume totale di 2.000 µ l/microarray) nel buffer di colorazione.</li>
	<li>Anticorpo di etichetta controllo Mix (monoclonale anti-HA fluorocromo coniugato) ad una diluizione di 1:1,000 (volume totale di 2 000 µ l/microarray) in tampone di macchiatura con anticorpo secondario precedentemente diluito in tampone di colorazione.</li>
	<li>Incubare con il microarray per 30 min a temperatura ambiente al buio in un agitatore orbitale a 140 giri/min.</li>
	<li>Rimuovere il mix di secondario diluito e gli anticorpi etichetta aspirando con una pipetta dall'angolo della camera del microarray.</li>
	<li>Lavare 3 volte con tampone standard (volume totale di 2.000 µ l/microarray). Ogni lavaggio è per 1 min su agitatore orbitale a 140 giri/min. Dopo ogni lavaggio, è necessario rimuovere il tampone standard aspirando con una pipetta dall'angolo della camera del microarray.</li>
</ol>5. scansione di Microarray
<ol><li>Immergere la diapositiva 2 x nel buffer tuffantesi preparata al momento (1 mM Tris, pH 7.4) (volume totale di 200 mL).</li>
	<li>Asciugare accuratamente, il microarray circa 1 min, aspirando con molta attenzione dalla parte superiore alla parte inferiore della diapositiva senza toccare la superficie di scorrimento.</li>
	<li>Scansione del microarray seguendo le istruzioni dello scanner. Porre il vetrino sul vetro dello scanner con la superficie stampata rivolta verso l'alto.</li>
	<li>Creare un nuovo progetto e selezionare l'area di scansione. Impostare i parametri dello scanner come: risoluzione: 21 µm, intensità per canali nm sia 700 e 800: 7.0, qualità di scansione: medium e Offset: 0,8.</li>
	<li>Acquisire e salvare l'immagine raw di scansione come un formato di file TIFF 16 bit in scala di grigi.</li>
</ol>6. Microarray Analysis utilizzando un Software specifico
<ol><li>Aprire l'immagine raw (immagine TIFF). Aprire il file di griglia di matrice.</li>
	<li>Allineare la griglia di matrice per l'immagine di scansione con i tasti freccia del mouse o la tastiera del computer.</li>
	<li>Selezionare "Selezione quantificare" nel software specifico, che crea un file di lettura che contiene l'intensità del segnale per ogni spot, il valore di sfondo e la corrispondente sequenza del peptide. Nota: Il file di output possa anche essere importato in un foglio di calcolo per ulteriore analisi e grafici.</li>
</ol>7. Microarray deposito
<ol><li>Memorizzare il microarray sigillato al buio a 4 ° C sotto ossigeno libero e gas azoto o argon.</li>
</ol>

<ol><li>Kelser, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meet+dengue%27s+cousin%5BTitle%5D)+AND+%22Zika.+Microbes+Infect%22%5BJournal%5D)">Meet dengue's cousin.</a> Zika. Microbes Infect. 18 (3), 163-166 (2016).</li>
<li>Musso, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+Zika+virus+in+saliva%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Virol%22%5BJournal%5D)">Detection of Zika virus in saliva.</a> J Clin Virol. 68, 53-55 (2015).</li>
<li>Siqueira, W. L., et al. <a target="_blank" href="https://www.oralhealthgroup.com/features/oral-clinical-manifestations-patients-infected-zika-virus/">Oral Clinical Manifestations of Patients Infected with Zika Virus.</a> Oral Health. , (2016).</li>
<li>Duarte, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+of+Zika+Virus+Infection+in+Pregnant+Women%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Bras+Ginecol+Obstet%22%5BJournal%5D)">Challenges of Zika Virus Infection in Pregnant Women.</a> Rev Bras Ginecol Obstet. 38 (6), 263-265 (2016).</li>
<li>Buus, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+mapping+of+linear+antibody+epitopes+using+ultrahigh-density+peptide+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">High-resolution mapping of linear antibody epitopes using ultrahigh-density peptide microarrays.</a> Mol Cell Proteomics. 11 (12), 1790-1800 (2012).</li>
<li>Kouzmitcheva, G. A., Petrenko, V. A., Smith, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+diagnostic+peptides+for+lyme+disease+through+epitope+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Diagn+Lab+Immunol%22%5BJournal%5D)">Identifying diagnostic peptides for lyme disease through epitope discovery.</a> Clin Diagn Lab Immunol. 8 (1), 150-160 (2001).</li>
<li>Hamby, C. V., Llibre, M., Utpat, S., Wormser, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Peptide+library+screening+to+detect+a+previously+unknown+linear+diagnostic+epitope%3A+proof+of+principle+by+use+of+lyme+disease+sera%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Diagn+Lab+Immunol%22%5BJournal%5D)">Use of Peptide library screening to detect a previously unknown linear diagnostic epitope: proof of principle by use of lyme disease sera.</a> Clin Diagn Lab Immunol. 12 (7), 801-807 (2005).</li>
<li>t Hoen, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phage+display+screening+without+repetitious+selection+rounds%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Phage display screening without repetitious selection rounds.</a> Anal Biochem. 421 (2), 622-631 (2012).</li>
<li>Townend, J. E., Tavassoli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traceless+Production+of+Cyclic+Peptide+Libraries+in+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Traceless Production of Cyclic Peptide Libraries in E. coli.</a> ACS Chem Biol. 11 (6), 1624-1630 (2016).</li>
<li>Turchetto, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+expression+of+animal+venom+toxins+in+Escherichia+coli+to+generate+a+large+library+of+oxidized+disulphide-reticulated+peptides+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Cell+Factories%22%5BJournal%5D)">High-throughput expression of animal venom toxins in Escherichia coli to generate a large library of oxidized disulphide-reticulated peptides for drug discovery.</a> Microbial Cell Factories. 16 (1), 6(2017).</li>
<li>Carmona, S. J., Sartor, P. A., Leguizamon, M. S., Campetella, O. E., Aguero, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+Peptide+Discovery%3A+Prioritization+of+Pathogen+Diagnostic+Markers+Using+Multiple+Features%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Diagnostic Peptide Discovery: Prioritization of Pathogen Diagnostic Markers Using Multiple Features.</a> Plos One. 7 (12), e50748(2012).</li>
<li>Lagatie, O., Van Dorst, B., Stuyver, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+three+immunodominant+motifs+with+atypical+isotype+profile+scattered+over+the+Onchocerca+volvulus+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Negl+Trop+Dis%22%5BJournal%5D)">Identification of three immunodominant motifs with atypical isotype profile scattered over the Onchocerca volvulus proteome.</a> PLoS Negl Trop Dis. 11 (1), e0005330(2017).</li>
<li>Basile, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+validation+of+an+ELISA+kit+%28YF+MAC-HD%29+to+detect+IgM+to+yellow+fever+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">Development and validation of an ELISA kit (YF MAC-HD) to detect IgM to yellow fever virus.</a> J Virol Methods. 225, 41-48 (2015).</li>
<li>Madden, T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK153387/">The BLAST Sequence Analysis Tool.</a> The NCBI Handbook. , 2nd ed, (2013).</li>
<li>Services, U. S. D. oH. aH. <a target="_blank" href="https://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/">Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL)</a>. , 5th ed, Vol. HHS Publication No. (CDC) 21-1112 (2009).</li>
<li>Pellois, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Individually+addressable+parallel+peptide+synthesis+on+microchips%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotech%22%5BJournal%5D)">Individually addressable parallel peptide synthesis on microchips.</a> Nat Biotech. 20 (9), 922-926 (2002).</li>
<li>Stafford, P., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22261726">Physical Characterization of the "Immunosignaturing Effect".</a> Mol Cell Proteomics. 11 (4), (2012).</li>
<li>Gardner, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+screening+for+anti-CMV+biologics+identifies+a+broadly+neutralizing+epitope+of+an+essential+envelope+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Functional screening for anti-CMV biologics identifies a broadly neutralizing epitope of an essential envelope protein.</a> Nat Commun. 7, (2016).</li>
<li>Nixon, C. E., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28468980">Identification of protective B-cell epitopes within the novel malaria vaccine candidate P. falciparum Schizont Egress Antigen-1.</a> Clin Vaccine Immunol. , (2017).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Abbiamo progettato un protocollo che utilizza un microarray ad alta densità del peptide contenente l'intera sequenza di proteina di Zika virus (ceppo polinesiano francese). Il microarray è stato fabbricato da peptidi lineari sovrapposti differenti 3.423 stampa. Ogni peptide era 15 aminoacidi e varia da un solo residuo dal suo vicino più prossimo nella sequenza (cioè, sovrapposizione di 14 residui). Anche se più breve sovrapposizioni possono essere stampati, mapping di epitopo è più preciso con più sovrapposizion...

Zika diagnosi del virus (ZIKV) basata sui sintomi clinici è impegnativo, perché condivide con Dengue e Chikungunya virus infezione1vettori, distribuzione geografica e sintomi. Dato il rischio di esiti avversi della gravidanza in donne infettate con ZIKV durante la gravidanza, è importante distinguere tra i 3 virus. Anche se l'attuale test diagnostici molecolari sono specifici, sono solo utili nel sangue o saliva durante il periodo relativamente breve di infezione acuta2,3. I test sierologici sono essenziali per la diagnosi fuori di questo periodo iniziale di infezione4.
Lo sviluppo di un'analisi sierologica specifica ZIKV è difficile per due motivi: in primo luogo, gli antigeni di Zika che il sistema immunitario umano risponde a non sono attualmente noti; e flavivirus conservato, secondo sequenze aminoacidiche inducono cross-reattività dell'anticorpo. Il nostro obiettivo era di scoprire unici peptidi specifici ZIKV per essere utilizzato nella diagnostica. Diversi approcci sono stati sviluppati per librerie peptidiche schermo che copre intere proteine compreso Fago, batterica, e superficie di lievito visualizzare5,6,7,8,9, 10. La nostra strategia era di usare un microarray di peptide ad alta densità che consente il rapido e poco costoso high throughput screening sierologici11,12 e successivamente i peptidi identificati possono essere utilizzati per migliorare la corrente sierologici analisi per la rilevazione dell'infezione ZIKV.
Questo protocollo consente l'individuazione di Zika il peptidi diagnostico specifici di virus ha usando un microarray ad alta densità del peptide (Figura 1). Il microarray ad alta densità del peptide è stato prodotto utilizzando la tecnologia di stampa laser del peptide. L'intera sequenza di proteine ZIKV che consiste di 3.423 residui dell'amminoacido basato sul ceppo polinesiano francese (GenBank: KJ776791.2), è stato stampato su un vetrino standard in blocchi di 15 residui lineare con una sovrapposizione di 14 residui dell'amminoacido in duplicato per un totale di 6.846 macchie di peptide. Oltre i peptidi di sequenza di proteine Zika intero, il microarray utilizza emoagglutinina influenzale peptidi (HA) per i controlli interni.
Un Zika convalidato positivo campione di siero ottenuto da Wadsworth Center (Albany, NY), è stato utilizzato per identificare specifici dell'immunoglobulina M (IgM) e peptidi reattive dell'immunoglobulina G (IgG). Dopo incubazione con il campione durante la notte, il microarray è stato macchiato con un anticorpo coniugato secondario fluorocromo (IgM anti-umano o anti-IgG umane) e analizzato su uno scanner di microarray. Quantificazione di intensità di spot e annotazione del peptide è stata effettuata con un software specifico fornito dalla stessa società che ha prodotto il microarray.

<table><tbody><tr><td>PEPperCHIP Custom Peptide Microarray</td><td>PEPperPRINT</td><td>PPC.001.001</td><td>Custom peptide micarray: il nostro microarray contiene l'intera sequenza proteica del virus Zika</td></tr><tr><td>PEPperCHIP vassoio di incubazione 3/1</td><td>PEPperPRINT</td><td>PPC.004.001</td><td></td></tr><tr><td>PEPperCHIP Staining Kit (680 nm) (anti-HA, marcatura DyLight)</td><td>PEPperPRINT</td><td>PPC.037.002</td><td></td></tr><tr><td>PepSLide Analyzer</td><td>PEPperPRINT</td><td>PSA.004.001</td><td>14 giorni di licenza gratuita per Windows</td></tr><tr><td>Rockland Blocking buffer</td><td>Rockland</td><td>MB-070</td><td></td></tr><tr><td>anti-umano IgM (mu chain) DyLight 800</td><td>Rockland</td><td>609-145-007</td><td></td></tr><tr><td>anti-umano IgG Fc DyLight 680</td><td>Thermo Scientific</td><td>SA5-10138</td><td></td></tr><tr><td>LI-COR Odyssey Imaging System</td><td>LI-COR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dispositivo agitatore orbitale</td><td>IKA</td><td>MTS 2/4 agitatore digitale per microtitolazione</td><td></td></tr><tr><td>Adobe Illustrator</td><td>Adobe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Deltagraph</td><td>Redrocks</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

virus di zika specifico diagnostico dell'epitopo discovery

Zika Virus Specific Diagnostic Epitope Discovery

Microarrays ad alta densità del peptide consentire lo screening dei peptidi più di seimila in una diapositiva di microscopia singola standard. Questo metodo può essere applicato per la scoperta di farmaci, identificazione del target terapeutico e lo sviluppo della diagnostica. Qui, presentiamo un protocollo per scoprire peptidi diagnostici specifici di virus (ZIKV) Zika usando un microarray ad alta densità del peptide. Un campione di siero umano convalidato per infezione ZIKV è stato incubato con un microarray ad alta densità del peptide contenente l'intera proteina ZIKV tradotta in 3.423 unico 15 lineare dell'aminoacido (aa) residui con una sovrapposizione di 14-aa residuo stampato in duplice copia. Colorazione con anticorpi secondari diversi all'interno della matrice stessa, abbiamo rilevato peptidi che legano alla immunoglobulina M (IgM) e gli anticorpi dell'immunoglobulina G (IgG) sono presenti nel siero. Questi peptidi sono stati selezionati per ulteriori esperimenti di convalida. In questo protocollo, descriviamo la strategia seguita per progettare, elaborare e analizzare un microarray ad alta densità del peptide.

I risultati ottenuti mediante il protocollo descritto sono mostrati nella Figura 2 e nella figura 3. Nessuna interazione di sfondo sono stata notata quando pre-macchiando il microarray con secondario anti-human IgM (dati non mostrati). Colorazione con un'anti-IgM umane coniugato ha provocato parecchie zone sopra intensità di fluorescenza verde di sfondo, che indica l'associazione di questi peptidi con IgM nel ca...

In questo protocollo, descriviamo una tecnica per scoprire Zika il peptidi diagnostico specifici di virus ha usando un microarray ad alta densità del peptide. Questo protocollo può essere idoneamente adattato per altre malattie infettive emergenti.

Virus di Zika specifico diagnostico dell'epitopo Discovery

High-density peptide microarrays allow screening of more than six thousand peptides on a single standard microscopy slide. This method can be applied for ...

L'obiettivo generale di questo esperimento è identificare peptidi specifici per il virus Zika da utilizzare in un test diagnostico per rilevare gli anticorpi del virus Zika. Questo è fondamentale, poiché il virus scompare dal sangue in circa 10 giorni, mentre gli anticorpi persistono per anni. Questo metodo ci consente di identificare antigeni ed epitopi utilizzando un microarray dell'intero proteoma Zika per identificare i peptidi che catturano gli anticorpi IgM o IgG in un campione di siero di un individuo infetto.Il vantaggio principale nel rilevare sia gli anticorpi precoci, IgM, che gli anticorpi successivi, IgG, è quello di fornire al medico una cronologia dell'infezione. E questo è particolarmente importante nelle donne in gravidanza. Sebbene questo protocollo fornisca informazioni sulla causa dell'infezione da virus Zika, può essere applicato ad altri agenti patogeni, utilizzando un microarray specifico per quel patogeno se la sua sequenza proteica è nota.Maneggiare il vetrino per i bordi utilizzando guanti senza polvere. Le dimensioni del vetrino sono 75,4 millimetri per 25,0 millimetri e 1 millimetro di spessore. Posizionare il vetrino nel vassoio di incubazione con la superficie del microarray rivolta verso l'alto.Riempire i supporti per diapositive vuoti con vetrini vuoti per evitare che il vetrino del microarray si rompa. Posizionare il lato lucido del sigillo rivolto verso il basso sulla superficie stampata con microarray. Per garantire una buona posizione, sovrapporre i fori delle viti della guarnizione e della piastra di base.Posizionare la parte superiore del vassoio sulla guarnizione per creare una camera di microarray. Fissare il vetrino nel vassoio serrando equamente le viti a testa zigrinata una dopo l'altra a mano in uno schema alternato. Inizia dall'alto a sinistra e procedi in basso a destra.Posizionare il coperchio sul vassoio di incubazione. Un'attenta manipolazione del microarray è essenziale per evitare di graffiare la superficie del microarray. Le soluzioni vengono aggiunte e quindi rimosse dall'angolo della camera del microarray.Anche l'asciugatura del microarray è importante per fornire una buona immagine di scansione. Incubare il microarray con 2.000 microlitri di tampone standard per microarray per 15 minuti a temperatura ambiente su un agitatore orbitale a 140 giri/min. Rimuovere il tampone standard aspirandolo con una pipetta dall'angolo della camera del microarray, quindi bloccare il microarray con un tampone di blocco per 60 minuti a temperatura ambiente su un agitatore orbitale a 140 giri/min.Rimuovere il tampone di blocco aspirandolo dall'angolo della camera del microarray con una pipetta. Aggiungere al microarray un anticorpo secondario coniugato con fluorocromo IgM umano diluito 1:5.000 nel tampone di colorazione. Quindi incubare il microarray per 30 minuti a temperatura ambiente al buio su un agitatore orbitale a 140 giri/min.Utilizzare una pipetta per rimuovere l'anticorpo secondario aspirando dall'angolo della camera del microarray. Lavare il microarray per un minuto con 2000 microlitri con tampone standard per microarray a temperatura ambiente su un agitatore orbitale a 140 giri/min. Rimuovere il tampone standard utilizzando la tecnica dimostrata e ripetere il lavaggio due volte.Quindi, immergere due volte il vetrino in 200 millilitri di un tampone di immersione appena preparato. Asciugare accuratamente il microarray per circa un minuto aspirando con molta attenzione il liquido in eccesso dall'alto verso il basso del vetrino senza toccare la superficie del vetrino. Analizza il vetrino in un lettore di scanner di microarray, come illustrato più avanti in questo video.Inattivare il campione di siero a 56 gradi Celsius per 30 minuti. Quindi centrifugare il campione a 16.000 RCF per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Conservare il campione a quattro gradi Celsius fino al momento dell'uso.Quindi incubare il microarray con il tampone di colorazione per 15 minuti a temperatura ambiente su un agitatore orbitale a 140 giri/min. Rimuovere il tampone di colorazione aspirandolo dall'angolo della camera del microarray con una pipetta. Diluire il campione di siero e il tampone di colorazione iniziando con una diluizione 1:1.000.Incubare il campione diluito con il microarray per una notte a quattro gradi Celsius su un agitatore orbitale a 140 giri/min. Rimuovere il campione di siero diluito utilizzando la tecnica dimostrata. Quindi lavare il microarray tre volte come prima.Diluire l'anticorpo secondario nel tampone di colorazione. Utilizzare anticorpi coniugati con fluorocromo IgM umano o anticorpi coniugati con fluorocromo IgG umano con una diluizione di 1:5.000 in tampone di colorazione. Quindi miscelare l'anticorpo marcato con il controllo a una diluizione di 1:1000 nel tampone di colorazione con l'anticorpo secondario diluito.Incubare con il microarray per 30 minuti a temperatura ambiente al buio e su un agitatore orbitale a 140 giri/min. Rimuovere la miscela di anticorpi secondari diluiti e marcati aspirando dall'angolo della camera del microarray con una pipetta. Quindi lavare il microarray tre volte con un tampone standard.Ogni lavaggio è della durata di un minuto su agitatore orbitale a 140 giri/min. Infine, rimuovere il tampone di lavaggio dalla camera del microarray come prima. Per eseguire la scansione con microarray, immergere due volte il vetrino in 200 millilitri di tampone di immersione appena preparato.Asciugare il microarray per circa un minuto aspirando con molta attenzione dall'alto verso il basso del vetrino senza toccare la superficie del vetrino. Scansiona il microarray seguendo le istruzioni dello scanner. Posizionare il vetrino sullo scanner con la superficie stampata rivolta verso l'alto.Crea un nuovo progetto e seleziona l'area di scansione. Imposta i parametri dello scanner con una risoluzione di 21 micron, un'intensità di 7,0 per entrambi i canali da 700 e 800 nanometri, una qualità di scansione del mezzo e un offset di 0,8. Acquisire e salvare l'immagine del disegno di scansione in formato file TIF in scala di grigi a 16 bit.Per analizzare i dati, aprire l'immagine non elaborata. Quindi apri il file della griglia della matrice. Allineare la griglia della matrice all'immagine di scansione con i tasti freccia del mouse o della tastiera del computer.Seleziona la selezione di quantificazione nel software specifico, che crea un file di lettura che contiene l'intensità del segnale per ogni punto, il valore di fondo e la sequenza peptidica corrispondente. Infine, conservare il microarray sigillato al buio a quattro gradi Celsius sotto azoto privo di ossigeno o gas argon. Qui è mostrata l'immagine grezza a fluorescenza della colorazione del microarray con IgG anti-umane dopo l'incubazione con un campione di siero specifico per il virus Zika diluito 1:250.I peptidi di controllo HA incorniciano il microarray. I peptidi che reagiscono fortemente alle IgG sono mostrati nel pannello dello zoom. Allo stesso modo, qui è mostrata un'immagine a fluorescenza grezza della colorazione del microarray con IgM anti-umane dopo l'incubazione con un campione di siero specifico per il virus Zika diluito 1:250.Ancora una volta, i peptidi di controllo HA inquadrano il microarray. I peptidi che reagiscono fortemente alle IgM sono mostrati nel pannello dello zoom. Qui è mostrata una sequenza consenso dell'epitopo del virus Zika rappresentativa che reagisce con le IgM nei peptidi del campione di siero ospite.I peptidi della sequenza consenso dell'epitopo sono evidenziati in rosso e il peptide con la più alta intensità di fluorescenza è contrassegnato in grassetto. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come elaborare un microarray di peptidi ad alta densità. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in 24 ore se eseguita correttamente.Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordarsi di maneggiare con cura il microarray per evitare di graffiare la superficie del microarray. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come l'ELISA o un saggio di legame per risonanza plasmonica di superficie per determinare se i peptidi identificati si legano specificamente agli anticorpi del virus Zika e non ad altri anticorpi del Flavivirus. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica aprirà la strada ai ricercatori nel campo della diagnostica per la scoperta di peptidi diagnostici utilizzando campioni di siero e saliva.Non dimenticare che lavorare con agenti infettivi come il virus Zika può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura dovrebbero essere sempre prese precauzioni come l'inattivazione del campione di siero e il lavoro in strutture di livello 2 di biosicurezza.

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Immunologia e Infezioni

Il virus Zika (ZIKV), un patogeno emergente, è collegato ad anomalie dello sviluppo fetale e microcefalia. La creazione di un efficace sistema di coltura cellulare infettiva è fondamentale per gli studi sulla replicazione di ZIKV e per lo sviluppo di vaccini e farmaci. In questo studio, vengono illustrati e discussi vari saggi virologici relativi alla ZIKV.

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Virus di Zika specifico diagnostico dell'epitopo Discovery

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