Virus di Zika specifico diagnostico dell'epitopo Discovery

L'obiettivo generale di questo esperimento è identificare peptidi specifici per il virus Zika da utilizzare in un test diagnostico per rilevare gli anticorpi del virus Zika. Questo è fondamentale, poiché il virus scompare dal sangue in circa 10 giorni, mentre gli anticorpi persistono per anni. Questo metodo ci consente di identificare antigeni ed epitopi utilizzando un microarray dell'intero proteoma Zika per identificare i peptidi che catturano gli anticorpi IgM o IgG in un campione di siero di un individuo infetto.

Il vantaggio principale nel rilevare sia gli anticorpi precoci, IgM, che gli anticorpi successivi, IgG, è quello di fornire al medico una cronologia dell'infezione. E questo è particolarmente importante nelle donne in gravidanza. Sebbene questo protocollo fornisca informazioni sulla causa dell'infezione da virus Zika, può essere applicato ad altri agenti patogeni, utilizzando un microarray specifico per quel patogeno se la sua sequenza proteica è nota.

Maneggiare il vetrino per i bordi utilizzando guanti senza polvere. Le dimensioni del vetrino sono 75,4 millimetri per 25,0 millimetri e 1 millimetro di spessore. Posizionare il vetrino nel vassoio di incubazione con la superficie del microarray rivolta verso l'alto.

Riempire i supporti per diapositive vuoti con vetrini vuoti per evitare che il vetrino del microarray si rompa. Posizionare il lato lucido del sigillo rivolto verso il basso sulla superficie stampata con microarray. Per garantire una buona posizione, sovrapporre i fori delle viti della guarnizione e della piastra di base.

Posizionare la parte superiore del vassoio sulla guarnizione per creare una camera di microarray. Fissare il vetrino nel vassoio serrando equamente le viti a testa zigrinata una dopo l'altra a mano in uno schema alternato. Inizia dall'alto a sinistra e procedi in basso a destra.

Posizionare il coperchio sul vassoio di incubazione. Un'attenta manipolazione del microarray è essenziale per evitare di graffiare la superficie del microarray. Le soluzioni vengono aggiunte e quindi rimosse dall'angolo della camera del microarray.

Anche l'asciugatura del microarray è importante per fornire una buona immagine di scansione. Incubare il microarray con 2.000 microlitri di tampone standard per microarray per 15 minuti a temperatura ambiente su un agitatore orbitale a 140 giri/min. Rimuovere il tampone standard aspirandolo con una pipetta dall'angolo della camera del microarray, quindi bloccare il microarray con un tampone di blocco per 60 minuti a temperatura ambiente su un agitatore orbitale a 140 giri/min.

Rimuovere il tampone di blocco aspirandolo dall'angolo della camera del microarray con una pipetta. Aggiungere al microarray un anticorpo secondario coniugato con fluorocromo IgM umano diluito 1:5.000 nel tampone di colorazione. Quindi incubare il microarray per 30 minuti a temperatura ambiente al buio su un agitatore orbitale a 140 giri/min.

Utilizzare una pipetta per rimuovere l'anticorpo secondario aspirando dall'angolo della camera del microarray. Lavare il microarray per un minuto con 2000 microlitri con tampone standard per microarray a temperatura ambiente su un agitatore orbitale a 140 giri/min. Rimuovere il tampone standard utilizzando la tecnica dimostrata e ripetere il lavaggio due volte.

Quindi, immergere due volte il vetrino in 200 millilitri di un tampone di immersione appena preparato. Asciugare accuratamente il microarray per circa un minuto aspirando con molta attenzione il liquido in eccesso dall'alto verso il basso del vetrino senza toccare la superficie del vetrino. Analizza il vetrino in un lettore di scanner di microarray, come illustrato più avanti in questo video.

Inattivare il campione di siero a 56 gradi Celsius per 30 minuti. Quindi centrifugare il campione a 16.000 RCF per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Conservare il campione a quattro gradi Celsius fino al momento dell'uso.

Quindi incubare il microarray con il tampone di colorazione per 15 minuti a temperatura ambiente su un agitatore orbitale a 140 giri/min. Rimuovere il tampone di colorazione aspirandolo dall'angolo della camera del microarray con una pipetta. Diluire il campione di siero e il tampone di colorazione iniziando con una diluizione 1:1.000.

Incubare il campione diluito con il microarray per una notte a quattro gradi Celsius su un agitatore orbitale a 140 giri/min. Rimuovere il campione di siero diluito utilizzando la tecnica dimostrata. Quindi lavare il microarray tre volte come prima.

Diluire l'anticorpo secondario nel tampone di colorazione. Utilizzare anticorpi coniugati con fluorocromo IgM umano o anticorpi coniugati con fluorocromo IgG umano con una diluizione di 1:5.000 in tampone di colorazione. Quindi miscelare l'anticorpo marcato con il controllo a una diluizione di 1:1000 nel tampone di colorazione con l'anticorpo secondario diluito.

Incubare con il microarray per 30 minuti a temperatura ambiente al buio e su un agitatore orbitale a 140 giri/min. Rimuovere la miscela di anticorpi secondari diluiti e marcati aspirando dall'angolo della camera del microarray con una pipetta. Quindi lavare il microarray tre volte con un tampone standard.

Ogni lavaggio è della durata di un minuto su agitatore orbitale a 140 giri/min. Infine, rimuovere il tampone di lavaggio dalla camera del microarray come prima. Per eseguire la scansione con microarray, immergere due volte il vetrino in 200 millilitri di tampone di immersione appena preparato.

Asciugare il microarray per circa un minuto aspirando con molta attenzione dall'alto verso il basso del vetrino senza toccare la superficie del vetrino. Scansiona il microarray seguendo le istruzioni dello scanner. Posizionare il vetrino sullo scanner con la superficie stampata rivolta verso l'alto.

Crea un nuovo progetto e seleziona l'area di scansione. Imposta i parametri dello scanner con una risoluzione di 21 micron, un'intensità di 7,0 per entrambi i canali da 700 e 800 nanometri, una qualità di scansione del mezzo e un offset di 0,8. Acquisire e salvare l'immagine del disegno di scansione in formato file TIF in scala di grigi a 16 bit.

Per analizzare i dati, aprire l'immagine non elaborata. Quindi apri il file della griglia della matrice. Allineare la griglia della matrice all'immagine di scansione con i tasti freccia del mouse o della tastiera del computer.

Seleziona la selezione di quantificazione nel software specifico, che crea un file di lettura che contiene l'intensità del segnale per ogni punto, il valore di fondo e la sequenza peptidica corrispondente. Infine, conservare il microarray sigillato al buio a quattro gradi Celsius sotto azoto privo di ossigeno o gas argon. Qui è mostrata l'immagine grezza a fluorescenza della colorazione del microarray con IgG anti-umane dopo l'incubazione con un campione di siero specifico per il virus Zika diluito 1:250.

I peptidi di controllo HA incorniciano il microarray. I peptidi che reagiscono fortemente alle IgG sono mostrati nel pannello dello zoom. Allo stesso modo, qui è mostrata un'immagine a fluorescenza grezza della colorazione del microarray con IgM anti-umane dopo l'incubazione con un campione di siero specifico per il virus Zika diluito 1:250.

Ancora una volta, i peptidi di controllo HA inquadrano il microarray. I peptidi che reagiscono fortemente alle IgM sono mostrati nel pannello dello zoom. Qui è mostrata una sequenza consenso dell'epitopo del virus Zika rappresentativa che reagisce con le IgM nei peptidi del campione di siero ospite.

I peptidi della sequenza consenso dell'epitopo sono evidenziati in rosso e il peptide con la più alta intensità di fluorescenza è contrassegnato in grassetto. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come elaborare un microarray di peptidi ad alta densità. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in 24 ore se eseguita correttamente.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordarsi di maneggiare con cura il microarray per evitare di graffiare la superficie del microarray. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come l'ELISA o un saggio di legame per risonanza plasmonica di superficie per determinare se i peptidi identificati si legano specificamente agli anticorpi del virus Zika e non ad altri anticorpi del Flavivirus. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica aprirà la strada ai ricercatori nel campo della diagnostica per la scoperta di peptidi diagnostici utilizzando campioni di siero e saliva.

Non dimenticare che lavorare con agenti infettivi come il virus Zika può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura dovrebbero essere sempre prese precauzioni come l'inattivazione del campione di siero e il lavoro in strutture di livello 2 di biosicurezza.