Name: Un nuovo sistema privo di alimentatore per la produzione di massa di cellule di assassino naturali murini In Vitro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: Scopri un metodo senza alimentatore per produrre in massa cellule NK murine ad alta purezza. Questa tecnica facilita studi di immunologia innata e terapia antitumorale personalizzata.

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Questo studio è stato sostenuto dal Research Grants Consiglio di Hong Kong (GRF 468513, CUHK3/CRF/12R) l'innovazione e fondo della tecnologia di Hong Kong (15/227/ITS, ITS InP/164/16, ITS-InP/242/16), sovvenzione diretta per ricerca-CUHK (2016.035) e studioso di Hong Kong Programma.
H.-Y.L. progettato e supervisionato tutti gli esperimenti e contribuito alla preparazione del manoscritto. P.M.-K.T. eseguirono degli esperimenti, hanno analizzato i dati e ha contribuito alla preparazione del manoscritto. P.C.-T. T., J.Y.-F.C., J.S.-C., H., d.-M.W., e G.-Y.L. raccolti campioni animali e partecipato negli esperimenti sugli animali. J.S., X.-R.H., e K.-F.T. contribuito alla preparazione del manoscritto.

Il protocollo per ottenere e differenziazione NK derivate da midollo osseo cellule (BM-NK) si basa su metodi precedentemente pubblicati20,21,22. Tutte le procedure con i topi sono state approvate da animale etica sperimentale Comitato (AEEC) presso l'Università cinese di Hong Kong.
1. preparazione del Medium condizionato OP9
<ol><li>Cultura la linea cellulare murina stroma OP9 in alfa-MEM contenente 20% FBS, 100 U/mL di penicillina G e 100 µ g/mL di streptomicina, a 37 ° C in atmosfera umidificata di aria/CO2 (95%: 5%).<ol>
<li>Contare le celle con un emocitometro, poi seme 2 x 106 delle cellule OP9 per ciascun matraccio di cultura2 75cm con 15 mL di terreno. Cultura per 48 h.</li>
		<li>Quando la cultura raggiunge 80% confluenza, lavare il matraccio con 10 mL di PBS e aggiungere 20 mL di pianura medio di alfa-MEM (senza FB e antibiotici) per fiaschetta.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Raccogliere il mezzo di condizione OP9 nel matraccio di cultura a 24 h, ripulire i detriti cellulari con 0,25 µm in polietersulfone (PES) filtro e conservare a 4 ° C (uso entro 2 settimane).</li>
</ol>2. isolamento delle cellule del midollo osseo del topo
<ol><li>Eutanasia di un mouse C57BL/6J 12-week-old con un sovradosaggio di pentobarbitone (100 mg/kg, l'iniezione intraperitoneale). Confermare la morte dalla mancanza di respirazione, quindi raccogliere le ossa di femore con un taglio di coltello chirurgico alle giunzioni tra le ossa e rimuovere i muscoli restanti con la lama graffiando delicato.</li>
	<li>Mettere le ossa in una provetta da centrifuga 50 mL contenente refrigerati sterile alfa-MEM e quindi eseguire la procedura seguente in una cappa di biosicurezza.</li>
	<li>Eliminare il terreno di alfa-MEM e sciacquare le ossa con etanolo al 70% per 30 s.</li>
	<li>Lavare le ossa con PBS sterile ghiacciata due volte per ripulire l'etanolo rimanente.</li>
	<li>Trasferire le ossa in un mortaio contenente 5 mL di PBS ghiacciata, e delicatamente frammentano le ossa con un pestello (non polverizzare li).</li>
	<li>Agitare delicatamente le ossa agitando il pestello per rilasciare cellule del midollo osseo in PBS. Raccogliere le cellule del midollo osseo contenente PBS in una nuova provetta da centrifuga 50 mL.</li>
	<li>Ripetere il passaggio 2.6 per quattro volte fino a quando diventano i frammenti di osso solido bianco a colori.</li>
	<li>Centrifugare la provetta a 465 x g per 5 min a 4 ° C, quindi eliminare il supernatante.</li>
	<li>Risospendere il pellet con 18 mL di acqua distillata sterile e lasciar riposare per 30 s per rimuovere le cellule di anima rosse.</li>
	<li>Aggiungere 2 mL di 10 ghiacciata X PBS per arrestare la reazione, quindi filtrare la miscela attraverso un colino di cella di 70 µm per rimuovere cellule rosse del sangue lisate.</li>
	<li>Centrifugare la provetta a 465 x g per 5 min a 4 ° C. Risospendere il pellet con 20 mL di PBS ghiacciata.</li>
	<li>Lavare le cellule ripetendo passo 2.11 una seconda volta.</li>
	<li>Trasferire il pellet cellulare in una piastra Petri sterile 100 mm con 10 mL di mezzo di condizionale OP9 da passo 1.2 completati con 20% FBS e una miscela di 0,5 ng/mL murino IL-7, 30 ng/mL mouse SCF e flt3L murino di 100 U/mL.</li>
	<li>Incubare il piatto a 37 ° C con 5% CO2 per 2 h. trasferimento delle cellule non collegate in un nuovo contenitore di cultura ad una densità di 5 x 105 vitali cellule/mL (numero di celle di un emocitometro con esclusione del blu di trypan) con la stessa formula media come descritto al punto 2.13 e incubare a 37 ° C con 5% CO2.</li>
	<li>Il giorno 4, cambia la condizione di cultura medio condizionale OP9 completati con 20% FBS e 2.000 U/mL del-2 murino.</li>
	<li>Aggiornare il terreno di coltura ogni 3 giorni; cellule NK mature possono essere ottenute da giorno 7 e qualificate come nella sezione 4.</li>
</ol>3. mediata da siRNA Gene Silencing differenziazione delle cellule di NK
<ol><li>Il controllo di siRNA o sciocchezze (NC) con un agente di transfezione secondo il manuale del prodotto della premiscela.</li>
	<li>Eseguire il passaggio 3.1 in qualsiasi momento dal giorno 0.</li>
	<li>Aggiungere il 50 nM di siRNA o NC miscela alle cellule da passo 2.14.</li>
	<li>Ripetere il passaggio 3.1 su ogni media rinfresco (ad es., giorno 0, 4 e 7) fino al punto finale sperimentale.</li>
</ol>4. analisi di differenziazione delle cellule NK mediante citometria a flusso
<ol><li>Ad un momento opportuno, raccogliere la sospensione di differenziazione delle cellule e lavare con PBS ghiacciata.</li>
	<li>Fissare le cellule con buffer di fissazione delle cellule secondo il manuale del prodotto.</li>
	<li>Lavare le cellule fisse con PBS ghiacciata e quindi risospendere 1 x 106 cellule in 100 µ l di Buffer di macchiatura Cytometry di flusso contenente Cy3-coniugato anti-topo NKp46 e PE-coniugati di anticorpi anti-topo CD244 in un rapporto di diluizione di 1: 100.</li>
	<li>Macchia il campione al buio a temperatura ambiente per 2 h.</li>
	<li>Risospendere i campioni macchiati con 300 µ l di PBS, poi acquisire dati di FACS e analizzare con Cytobank piattaforma20 (http://cytobank.org/).</li>
</ol>

<ol><li>Schreiber, R. D., Old, L. J., Smyth, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+immunoediting%3A+integrating+immunity%27s+roles+in+cancer+suppression+and+promotion%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cancer immunoediting: integrating immunity's roles in cancer suppression and promotion.</a> Science. 331 (6024), 1565-1570 (2011).</li>
<li>Junttila, M. R., de Sauvage, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+tumour+micro-environment+heterogeneity+on+therapeutic+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Influence of tumour micro-environment heterogeneity on therapeutic response.</a> Nature. 501 (7467), 346-354 (2013).</li>
<li>Rusakiewicz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+infiltrates+are+prognostic+factors+in+localized+gastrointestinal+stromal+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Immune infiltrates are prognostic factors in localized gastrointestinal stromal tumors.</a> Cancer Res. 73 (12), 3499-3510 (2013).</li>
<li>Mamessier, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+breast+cancer+cells+enhance+self+tolerance+by+promoting+evasion+from+NK+cell+antitumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Human breast cancer cells enhance self tolerance by promoting evasion from NK cell antitumor immunity.</a> J Clin Invest. 121 (9), 3609-3622 (2011).</li>
<li>Stern, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-emptive+immunotherapy+with+purified+natural+killer+cells+after+haploidentical+SCT%3A+a+prospective+phase+II+study+in+two+centers%5BTitle%5D)+AND+%22Bone+Marrow+Transplant%22%5BJournal%5D)">Pre-emptive immunotherapy with purified natural killer cells after haploidentical SCT: a prospective phase II study in two centers.</a> Bone Marrow Transplant. 48 (3), 433-438 (2013).</li>
<li>Miller, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+adoptive+transfer+and+in+vivo+expansion+of+human+haploidentical+NK+cells+in+patients+with+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Successful adoptive transfer and in vivo expansion of human haploidentical NK cells in patients with cancer.</a> Blood. 105 (8), 3051-3057 (2005).</li>
<li>Rubnitz, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NKAML%3A+a+pilot+study+to+determine+the+safety+and+feasibility+of+haploidentical+natural+killer+cell+transplantation+in+childhood+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">NKAML: a pilot study to determine the safety and feasibility of haploidentical natural killer cell transplantation in childhood acute myeloid leukemia.</a> J Clin Oncol. 28 (6), 955-959 (2010).</li>
<li>Curti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+transfer+of+alloreactive+haploidentical+KIR+ligand-mismatched+natural+killer+cells+after+infusion+in+elderly+high+risk+acute+myeloid+leukemia+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Successful transfer of alloreactive haploidentical KIR ligand-mismatched natural killer cells after infusion in elderly high risk acute myeloid leukemia patients.</a> Blood. 118 (12), 3273-3279 (2011).</li>
<li>Bachanova, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clearance+of+acute+myeloid+leukemia+by+haploidentical+natural+killer+cells+is+improved+using+IL-2+diphtheria+toxin+fusion+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Clearance of acute myeloid leukemia by haploidentical natural killer cells is improved using IL-2 diphtheria toxin fusion protein.</a> Blood. 123 (25), 3855-3863 (2014).</li>
<li>Stringaris, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukemia-induced+phenotypic+and+functional+defects+in+natural+killer+cells+predict+failure+to+achieve+remission+in+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Leukemia-induced phenotypic and functional defects in natural killer cells predict failure to achieve remission in acute myeloid leukemia.</a> Haematologica. 99 (5), 836-847 (2014).</li>
<li>Rouce, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+TGF-%CE%B2%2FSMAD+pathway+is+an+important+mechanism+for+NK+cell+immune+evasion+in+childhood+B-acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">The TGF-β/SMAD pathway is an important mechanism for NK cell immune evasion in childhood B-acute lymphoblastic leukemia.</a> Leukemia. 30 (4), 800-811 (2016).</li>
<li>Derynck, R., Akhurst, R. J., Balmain, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-%CE%B2+signaling+in+tumor+suppression+and+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genet%22%5BJournal%5D)">TGF-β signaling in tumor suppression and cancer progression.</a> Nature Genet. 29 (2), 117-129 (2001).</li>
<li>Massague, J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18662538">TGFbeta in cancer.</a> Cell. 134 (2), 215-230 (2008).</li>
<li>Ikushima, H., Miyazono, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGFbeta+signalling%3A+a+complex+web+in+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">TGFbeta signalling: a complex web in cancer progression.</a> Nat Rev Cancer. 10 (6), 415-424 (2010).</li>
<li>Pickup, M., Novitskiy, S., Moses, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+roles+of+TGF%CE%B2+in+the+tumour+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">The roles of TGFβ in the tumour microenvironment.</a> Nat Rev Cancer. 13 (11), 788-799 (2013).</li>
<li>Rook, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+transforming+growth+factor+beta+on+the+functions+of+natural+killer+cells%3A+depressed+cytolytic+activity+and+blunting+of+interferon+responsiveness%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Effects of transforming growth factor beta on the functions of natural killer cells: depressed cytolytic activity and blunting of interferon responsiveness.</a> J Immunol. 136 (10), 3916-3920 (1986).</li>
<li>Bellone, G., Aste-Amezaga, M., Trinchieri, G., Rodeck, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+NK+cell+functions+by+TGF-beta+1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Regulation of NK cell functions by TGF-beta 1.</a> J Immunol. 155 (3), 1066-1073 (1995).</li>
<li>Trotta, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-%CE%B2+utilizes+SMAD3+to+inhibit+CD16-mediated+IFN-%CE%B3+production+and+antibody-dependent+cellular+cytotoxicity+in+human+NK+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">TGF-β utilizes SMAD3 to inhibit CD16-mediated IFN-γ production and antibody-dependent cellular cytotoxicity in human NK cells.</a> J Immunol. 181 (6), 3784-3792 (2008).</li>
<li>Shull, M. M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1436033">Targeted disruption of the mouse transforming growth factor-β1 gene results in multifocal inflammatory disease.</a> Nature. 359 (6397), 693-699 (1992).</li>
<li>Chen, T. J., Kotecha, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytobank%3A+providing+an+analytics+platform+for+community+cytometry+data+analysis+and+collaboration%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Microbiol+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cytobank: providing an analytics platform for community cytometry data analysis and collaboration.</a> Curr Top Microbiol Immunol. 377, 127-157 (2014).</li>
<li>Williams, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+NK1.1%2B%2C+Ly49%2B+NK+cells+from+flt3%2B+multipotent+marrow+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Differentiation of NK1.1+, Ly49+ NK cells from flt3+ multipotent marrow progenitor cells.</a> J Immunol. 163 (5), 2648-2656 (1999).</li>
<li>Fathman, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+earliest+natural+killer+cell-committed+progenitor+in+murine+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Identification of the earliest natural killer cell-committed progenitor in murine bone marrow.</a> Blood. 118 (20), 5439-5447 (2011).</li>
<li>Tang, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smad3+promotes+cancer+progression+by+inhibiting+E4BP4-mediated+NK+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Smad3 promotes cancer progression by inhibiting E4BP4-mediated NK cell development.</a> Nat Commun. 6 (8), 14677(2017).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Nel presente lavoro, abbiamo descritto un metodo novello per la produzione di cellule NK murina derivanti dal midollo osseo in vitro. L'alimentatore delle cellule nel sistema originale21,22 è sostituito con successo dal medium condizionato delle cellule OP9, che in gran parte aumentata la stabilità del sistema di differenziazione. Inoltre, il sistema può produrre elevate quantità e purezza di NK maturo cellule per in vitro come pure in vivo<...

Progressione del cancro dipende in larga misura il tumore microambiente1,2, tra cui immunociti host-derivato, ad esempio, le cellule NK. Numerosi studi hanno dimostrato che le cellule NK intratumoral sono correlate negativamente con la progressione del tumore3,4. Inoltre, studi clinici hanno mostrato che la terapia adottiva delle cellule NK è una possibile strategia per cancro5,6,7,8,9. L'immunoterapia del cancro basati su cellule NK recentemente è stato suggerito come opzione terapeutica per i tumori solidi, ma sfide esistano dovuto la secrezione di citochine immunosoppressive e downregulation di attivazione ligandi nel microambiente dei tumori solidi 10,11. Trasformando il fattore di crescita-β (TGF-β) è stato suggerito per svolgere un ruolo soppressivo nella carcinogenesi, ma paradossalmente le cellule tumorali producono anche TGF-β1 per supportare il tumore sviluppo12,13,14 , 15. segnalazione di TGF-β può sopprimere l'attività citolitica delle cellule di NK via giù-regolando la velocità di risposta dell'interferone e CD16-mediata di interferone-gamma (IFN-γ) produzione in vitro16,17, 18.
Anche se la rottura di segnalazione di TGF-β nel microambiente tumorale possa essere un modo possibile per l'eliminazione dei tumori, bloccando completamente segnalazione di TGF-β causerà malattie autoimmuni grazie alla sua funzione di anti-infiammatori, come testimoniano lo sviluppo della effetti collaterali tra cui l'infiammazione sistemica, difetti cardiovascolari e autoimmunità nel topo modelle19. Così, la comprensione del meccanismo di funzionamento di TGF-β-mediata immunosoppressione porteranno all'identificazione di un accessibile obiettivo terapeutico per il trattamento del cancro.
Per delucidare gli eventi molecolari necessari per lo sviluppo delle cellule NK, Williams et al. stabilite un sistema in vitro per la differenziazione di cellule staminali emopoietiche del midollo osseo murino in NK cells20. Questo sistema facilita in gran parte lo studio meccanicistico di sviluppo delle cellule NK, compresa l'individuazione di nuovi progenitori delle cellule NK21. Tuttavia, i progenitori di midollo osseo dovrebbero essere coltivati nel sistema con il supporto di cellule stromali OP9 come un alimentatore strato20,21, e questa popolazione cellulare eterogenea limita in gran parte l'applicazione ulteriore gene di interruzione strumenti (ad es., silenziamento genico mediato da siRNA) specificamente applicata per la differenziazione delle cellule NK.
Qui, descriviamo un sistema privo di alimentatore che è stato sviluppato modificando ulteriormente il sistema in vitro di Williams et al.20. Nel nostro sistema, le cellule stromal alimentatore OP9 non sono necessari, e invece OP9 medium condizionale è usato senza influenzare la differenziazione delle cellule NK in vitroe questo recentemente ci portano a scoprire che il TGF-β è in grado di promuovere la progressione del cancro tramite sopprimere lo sviluppo delle cellule NK E4bp4-dipendente nel microambiente tumorale22. Questo nuovo sistema fornisce con successo un metodo privo di sfondo per delucidare il meccanismo molecolare di sviluppo delle cellule NK in condizioni specifiche (ad es., alta TGF-β1, silenziamento genico mediato da siRNA, ecc.) in vitro.

<table><tbody><tr><td>Linea cellulare OP9</td><td>ATCC ATCC</td><<td>sup>&reg; CRL-2749&commercio; </td><td></td></tr><tr><td>MEM &alpha;, senza nucleosidi</td><td>Gibco</td><td>22561021</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Gibco</td><td>10500064</td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH 7,4</td><td>Gibco</td><td>10010049</td><td></td></tr><tr><td>Murina ricombinante IL-7</td><td>PEPROTECH</td><td>217-17</td><td></td></tr><tr><td>Murina ricombinante SCF</td><td>PEPROTECH</td><td>250-03</td><td></td></tr><tr><td>Murina ricombinante Flt3-ligando</td><td>PEPROTECH</td><td>250-31L</td><td></td></tr><tr><td>ricombinante murino IL-2</td><td>PEPROTECH</td><td>212-12</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamin RNAiMAX reagente di trasfezione</td><td>Invitrogen</td><td>1377815</td><td></td></tr><tr><td>tampone di fissazione IC&nbsp;</td><td>eBioscience</td><td>00-8222-49</td><td></td></tr><tr><td>Tampone per colorazione per citometria a flusso&nbsp;</td><td>eBioscience</td><td>00-4222-26</td><td></td></tr><tr><td>PE-coniugato anti-topo CD244</td><td>eBioscience</td><td>12-2441-83</td><td></td></tr><tr><td>Cy3-coniugato anti-topo NKp46</td><td>Bioss</td><td>bs-2417R-cy3</td><td></td></tr><tr><td>Controllo senza senso (NC)</td><td>Ribobio</td><td>siN05815122147</td><td></td></tr><tr><td>siRNA contro topo E4BP4 mRNA</td><td>Ribobio</td><td>N/A</td><td>5&prime;-GAUGAGGGUGUA GUGGGCAAGUCUU-3& primo;</td></tr></tbody></table>

un nuovo sistema privo di alimentatore per la produzione di massa di cellule di assassino naturali murini in vitro

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Cellule natural killer (NK) appartengono al sistema immunitario innato e sono una difesa immune prima linea anti-cancro; Tuttavia, essi vengono soppressi nel microambiente tumorale e il meccanismo di fondo è ancora in gran parte sconosciuto. La mancanza di una fonte affidabile e coerenza delle cellule di NK limita i progressi della ricerca di immunità delle cellule NK. Qui, segnaliamo un sistema in vitro che in grado di fornire alta qualità e quantità derivate da midollo osseo murine delle cellule di NK in una condizione senza alimentatore. Ancora più importante, inoltre dimostriamo che con successo silenziamento genico mediato da siRNA inibisce la maturazione delle cellule NK E4bp4-dipendente utilizzando questo sistema. Così, questa romanzo in vitro cellule NK differenziazione del sistema sono una soluzione di biomateriale per ricerca di immunità.

Risultati rappresentativi sono ottenuti seguendo il protocollo descritto. Cellule in sospensione totale del midollo osseo sono state coltivate sotto il sistema di differenziazione privo di alimentatore per 11 giorni; significativo aumento nel tasso di proliferazione è stata osservata di giorno 7 rispetto al numero delle cellule totali il giorno 0 (Figura 1A). Cellule NK mature con alto rapporto nucleare citoplasmico e citoplasma ricco di gran...

Qui, presentiamo un protocollo per produrre cellule NK murine silenziamento genico utilizzando un sistema di differenziazione privo di alimentatore per studi meccanicistici in vitro e in vivo.

Un nuovo sistema privo di alimentatore per la produzione di massa di cellule di assassino naturali murini In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...

L'obiettivo generale di questo nuovo sistema senza feeder è quello di fornire un metodo per la produzione di massa di cellule natural killer ad alta purezza per saggi in vitro e in vivo. Questo metodo può aiutare a rispondere alle domande chiave dell'immunologia innata, tra cui lo sviluppo delle cellule natural killer e l'immunità al cancro. Il vantaggio principale di questa tecnica è che questo nuovo sistema senza feeder può aumentare notevolmente la purezza delle cellule natural killer prodotte.Ciò facilita notevolmente i seguenti saggi in vitro e in vivo. L'indicazione di questa tecnica si estende all'immunità natural killer perché la produzione di massa di cellule natural killer murine può essere prodotta dal midollo osseo di pazienti oncologici per l'analisi e la modifica per l'immunoterapia personale. In generale, gli individui che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché il terreno consumato dovrebbe essere raccolto dalla cella OP9 in fase di crescita del carico.La dimostrazione facciale di questo metodo è fondamentale in quanto le fasi di istruzione del midollo osseo sono difficili da imparare, perché le ossa devono essere sterili con etanolo con un tempo ottimale per preservarne la vitalità. Per iniziare questa procedura, raccogliere le cellule OP9 da un pallone di coltura. Aggiungi FBS per fermare la digestione della tripsina.Raccogli le celle OP9 e centrifuga a 465 volte la gravità per cinque minuti. Successivamente, risospendere il pellet della cella. Usando un emocitometro, conta le cellule.Quindi, seminare due volte da 10 a sei cellule in 15 millilitri di terreno alfa-mem in un pallone di coltura di 75 centimetri quadrati e incubare per 48 ore. Una volta che le cellule sono confluenti all'80%, lavarle con 10 millimetri di soluzione salina tamponata con fosfato e aggiungere alle cellule 20 millilitri di terreno alfa-mem semplice senza antibiotici e siero fetale bovino. Incubare per 24 ore.Il giorno successivo, raccogliere il terreno condizionato con OP9 rimuovendo i detriti cellulari con un filtro e conservare a quattro gradi Celsius. Iniettare un sovradosaggio di 100 milligrammi per chilogrammo di pentobarbitone intraperitoneale per sopprimere un topo di 12 settimane. Dopo aver confermato la mancanza di respirazione, asportare le ossa del femore con un bisturi chirurgico.Rimuovere i muscoli rimanenti grattando delicatamente con una lama. Trasferire le ossa in una provetta da centrifuga da 50 millilitri riempita con terreno alfa-mem sterile e raffreddato e conservarle in una camera di biosicurezza. Quindi, espellere il terreno alfa-mem e lavare le ossa con etanolo al 70% per 30 secondi.Ancora una volta, lavare le ossa con soluzione salina sterile tamponata con fosfato ghiacciato due volte per rimuovere l'etanolo residuo. Dopo il lavaggio, trasferire le ossa in un mortaio contenente cinque millilitri di soluzione salina tamponata con fosfato ghiacciato e frammentare le ossa con un pestello. Agitare delicatamente il pestello per rilasciare le cellule del midollo osseo nella soluzione salina tamponata con fosfato.Trasferire la soluzione salina tamponata con fosfato contenente cellule del midollo osseo in una nuova provetta da centrifuga da 50 millilitri. Quindi, centrifugare la provetta a 465 volte la gravità per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Dopo la centrifugazione, scartare il surnatante.Estrarre fino a quando l'osso diventa di colore bianco per ottenere la massima resa. Quindi, sospendi nuovamente il pellet con 18 millilitri di acqua distillata sterile e attendi 30 secondi per rimuovere i globuli rossi. Quindi, aggiungi due millilitri di soluzione salina tamponata con fosfato ghiacciato 10X per fermare la reazione.Utilizzare un colino cellulare da 70 micrometri per rimuovere i globuli rossi lisati. Quindi, centrifugare le provette a 465 volte la gravità per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Scartare il surnatante e risospendere il pellet in 20 millilitri di soluzione salina tamponata con fosfato ghiacciato.Centrifugare le celle ancora una volta. Successivamente, trasferire il pellet cellulare in una capsula di Petri sterile da 100 millilitri contenente 10 millilitri di terreno condizionale OP9, integrato con reagenti aggiuntivi. Trasferire la capsula di Petri in un'incubatrice a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per due ore.Rimuovere tutte le cellule non attaccate e seminare in un nuovo piatto di coltura contenente terreno condizionale OP9 e metterlo in un'incubatrice a 37 gradi Celsius per cinque minuti. Il quarto giorno, sostituire il terreno di coltura con il terreno condizionale OP9, integrato con il 20% di siero fetale bovino e 2.000 unità per millilitro di interleuchina murina 2. Continuare a cambiare il terreno di coltura ogni tre giorni fino al settimo giorno per ottenere le cellule natural killer mature.Seguire il manuale del prodotto per premiscelare il piccolo RNA interferente o il controllo senza senso con il reagente di trasfezione allo zero, quarto e settimo giorno di cambio del terreno fino al punto finale sperimentale. Aggiungere 50 nanomolari di piccolo RNA interferente, o miscela senza senso, alle cellule non attaccate durante il rinfresco medio. Raccogli le cellule differenzianti in un momento appropriato.Centrifugare le celle a 465 volte la gravità per cinque minuti. Scartare il surnatante e lavare il pellet cellulare con soluzione salina tamponata con fosfato ghiacciato. Dopo aver lavato le cellule fissate con soluzione fisiologica tamponata con fosfato ghiacciato, risospendere le cellule in 100 microlitri di tampone colorante per citometria a flusso contenente anticorpi coniugati SY3.Successivamente, risospendere i campioni in 300 microlitri di soluzione salina tamponata con fosfato per l'analisi via fax. Una curva di crescita rappresentativa che dimostra il tasso di proliferazione delle cellule del midollo osseo in fase di differenziazione in cellule natural killer in un sistema privo di alimentatore. Il grafico mostra un aumento significativo del tasso di proliferazione delle cellule entro il settimo giorno.Un'immagine rappresentativa in campo chiaro che mostra cellule natural killer differenziate in un nuovo sistema senza alimentatore. Le cellule natural killer mature hanno mostrato un elevato rapporto nucleo/citoplasmatico con una morfologia citoplasmatica granulare. Un grafico a barre rappresentativo che mostra l'effetto di piccoli RNA interferenti sulle cellule del midollo osseo in fase di differenziazione in cellule natural killer il sesto giorno.Il grafico mostra una riduzione significativa dei livelli di mRNA di E4bp4 e delle cellule natural killer trattate con piccoli RNA interferenti rispetto al gruppo di controllo. Dati citometrici a flusso rappresentativi che dimostrano l'effetto di E4bp4 silenziato sulla differenziazione di cellule natural killer derivate dal midollo osseo in modo TGF beta-1 Smad3-dipendente. I dati mostrano che il knockdown dell'mRNA di E4bp4 diminuisce notevolmente la produzione di cellule natural killer mature il sesto giorno rispetto al controllo senza senso.È stato dimostrato che la ridotta produzione di cellule natural killer mediata da piccoli RNA interferenti viene salvata sopprimendo il TGF beta-1 Smad3 con un inibitore micromolare di SIS3 Smad3 rispetto al gruppo trasfettato a RNA piccolo interferente. Una volta padroneggiato, questo studio può essere svolto in due ore se eseguito correttamente. Seguendo questa procedura, è possibile effettuare modifiche genetiche come il blocco genico e la sovraespressione, al fine di rispondere a ulteriori domande, come i meccanismi di regolazione dell'attività delle cellule natural killer e lo sviluppo.La prima volta che ho avuto l'idea di questo metodo stavo espandendo le cellule natural killer nel vecchio sistema. La presenza delle cellule fetali ha diminuito il carico e l'efficienza di siRNA per il gene di interesse. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come produrre enormi cellule natural killer di alta qualità da questo sistema locale in vitro.Non dimenticare che lavorare con i reagenti per l'estrazione dell'RNA può essere estremamente pericoloso e che è necessario prendere sempre precauzioni durante l'esecuzione di questa procedura.

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