Il Hindbrain Mouse come modello di studio della neurogenesi embrionale

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di consentire l'analisi dell'intero organo e istologica del romboencefalo embrionale di topo durante lo sviluppo. Questo metodo consente lo studio degli sviluppi della neurogenesi nel rombencefalo di un organismo modello di mammifero. Il rombencefalo di topo in via di sviluppo è un modello eccellente per studiare l'attività della progenesi neurale grazie alla sua architettura piatta che facilita l'osservazione dei modelli di neurogenesi in tutto l'organo.

Inizia questa procedura con l'eutanasia di una topolina incinta a tempo utilizzando una procedura eticamente approvata nella fase gestazionale richiesta. Usando forbici affilate, tagliare la cavità peritoneale e asportare con cura l'utero. Metti l'utero asportato contenente gli embrioni in una capsula di plastica da 60 millimetri contenente 20 millilitri di PBS ghiacciato.

Eseguire tutte le ulteriori dissezioni utilizzando un microscopio da dissezione. Usando la pinza Watchmaker numero cinque, strappa la parete muscolare uterina per esporre gli embrioni. Rilascia ogni embrione recidendo il cordone ombelicale e rimuovi il sacco vitellino.

Dopo aver trasferito ogni embrione in un piatto di plastica pulito con PBS ghiacciato, usa la pinza Watchmaker numero 55 per recidere la testa. Facoltativamente, conservare un piccolo pezzo di tessuto per l'isolamento del DNA genomico e la successiva genotipizzazione. Utilizzando la pinza da orologiaio numero 55, asportare il tessuto contenente il rombencefalo parallelamente e immediatamente sotto l'epitelio del neuroencefalo per separarlo dal tessuto facciale e dal proencefalo.

Posizionare il rombencefalo e il tessuto caudale della testa, con il lato dorsale rivolto verso l'alto e identificare il quarto ventricolo che è coperto da un sottile strato di tessuto noto come piastra del tetto. Forare con cautela la piastra del tetto utilizzando la pinza da orologiaio numero 55 e rimuovere il tessuto in eccesso con una pinza, muovendosi rostralmente lungo la linea mediana sopra il mesencefalo e poi caudalmente sopra il rombencefalo posteriore e il midollo spinale. Il cervello posteriore dovrebbe ora essere esposto in una preparazione a libro aperto.

Per preparare il rombencefalo per l'immunomarcatura a montaggio intero, utilizzare la pinza Watchmaker numero 55 per estrarre con cura la testa rimanente del mesenchima e le meningi attaccate al lato della buccia del rombencefalo. Rimuovere il mesencefalo e il tessuto del midollo spinale per lasciare solo il tessuto del rombencefalo. Per preparare il rombencefalo per il vibratomo e la criosezione, utilizzare la pinza Watchmaker numero 55 per rimuovere il mesencefalo e il tessuto del midollo spinale.

Trasferisci i rombencefali dal piatto di plastica in tubi da due millilitri a fondo tondo usando una pipetta Pasteur. Dopo aver aspirato tutto il PBS, fissare il rombencefalo per due ore a quattro gradi Celsius con una leggera agitazione nella formaldeide appena scongelata al 4% in peso per volume disciolta in PBS. Infine, sciacquare il rombencefalo tre volte con PBS.

Se necessario, reidratare i rombencefali in delirio decrescente di metanolo in PBS a temperatura ambiente per cinque minuti ad ogni concentrazione. Quindi, trasferisci ai rombencefali alla PBS. Permeabilizzare il romboencefalo per 30 minuti a quattro gradi Celsius in PBS contenente PBT con leggera agitazione.

Quindi incubare il rombencefalo per un'ora a quattro gradi Celsius in PBT contenente il 10% di siero di capra inattivato dal calore. Successivamente, incubare il rombencefalo durante la notte come prima in PBT contenente l'1% di siero inattivato a caldo e anticorpi primari. Il giorno successivo, lavare i rombencefali a quattro gradi Celsius con PBT per un'ora ciascuno.

Dopo il lavaggio, incubare il romboencefalo per una notte a quattro gradi Celsius in PBT contenente gli appropriati anticorpi secondari coniugati con fluorofori mirati contro gli anticorpi primari utilizzati. Da questo momento in poi, tenete i rombencefali al buio per proteggere i fluorofori dal fotosbiancamento. Dopo il lavaggio come prima con PBT, post-fissare i rombencefali in 4% di formaldeide in PBS per 15 minuti a temperatura ambiente per preservare a lungo termine il legame anticorpale.

Nel frattempo, copri un vetrino da microscopio con due strati di nastro isolante nero e asporta un piccolo quadrato dal nastro stratificato per creare una tasca abbastanza grande da contenere il rombencefalo. Dopo aver sciacquato brevemente il rombencefalo due volte in PBS, trasferirlo nella tasca con una pipetta Pasteur. Rimuovere il liquido in eccesso e aggiungere un reagente anti-sbiadimento appropriato alla tasca.

Quindi coprire lentamente il rombencefalo con un vetrino coprioggetti di vetro per evitare di intrappolare bolle d'aria sotto il vetrino. Sigillare il vetrino coprioggetti e fissarlo al vetrino con un sottile strato di smalto. Conservare la diapositiva a quattro gradi Celsius al buio fino all'acquisizione dell'immagine.

Incorporare i cervelli posteriori in agarosio fuso al 3% in peso per volume preparato in acqua distillata. Il taglio trasferisce le sezioni del rombencefalo a uno spessore di 70 micron utilizzando un vibratomo. Trasferisci ogni sezione appena tagliata con un pennello in un pozzetto di una piastra a 24 pozzetti contenente PBS ghiacciato.

Dopo aver etichettato le sezioni fluttuanti come descritto nel protocollo di testo, lavatele brevemente in PBS. Trasferire con cautela le sezioni galleggianti su un vetrino da microscopio utilizzando un pennello. Asciugare il PBS in eccesso intorno alla sezione utilizzando carta assorbente o fazzoletto.

Non le sezioni che utilizzano l'80% di glicerolo nella PBS. E coprili lentamente con un vetrino coprioggetti per evitare di intrappolare bolle d'aria. Conservare la diapositiva a quattro gradi Celsius al buio fino all'acquisizione dell'immagine.

Incubare i rombivori nel saccarosio al 30% in peso per volume in PBS a quattro gradi Celsius per crioproteggere i rombencefali prima del congelamento. Immergere i rombencefali in un composto per la temperatura di taglio ottico o OCT. Quindi, congelateli rapidamente trasferendo gli stampi contenenti le piogge posteriori in isopentano raffreddato tra i 40 e i 50 gradi Celsius su ghiaccio secco.

Quindi, tagliare le sezioni del rombencefalo di trasferimento a uno spessore di 10 micron utilizzando un criostato. Trasferire le sezioni del rombencefalo su vetrini da microscopio adesivi elettrostaticamente. Incubare i vetrini a temperatura ambiente per 15 minuti per asciugare le sezioni ai vetrini.

Quindi lavare le sezioni criogeniche con PBS per sciogliere l'OCT. Segna una barriera idrofobica attorno alle sezioni criogeniche usando una penna PAP. Imaging dei campioni utilizzando un microscopio a scansione laser epifluorescente o confocale dotato di lenti adatte per vetrini montati su terreni acquosi e filtri ottici adatti ai fluorofori utilizzati per la marcatura immunologica.

Per visualizzare l'intero rombencefalo o una sezione del rombencefalo, utilizzare una lente per un ingrandimento 10x. Per visualizzare le aree del rombencefalo per la quantificazione, utilizzare un ingrandimento di 40 volte. E per visualizzare le singole cellule, usa una lente con un ingrandimento di 63 volte.

Qui sono mostrati i risultati rappresentativi dei rombencefali marcati con immuno wholemount per osservare la divisione delle cellule progenitrici neurali nella zona ventricolare. Queste immagini sono state ottenute utilizzando il marcatore mitotico fosfo-istone H3 in fasi consecutive di sviluppo. Le sezioni trasversali del vibratomo sono state marcate dopo un impulso di un'ora di EdU per evidenziare le cellule progenitrici neurali del rombencefalo in fase di migrazione nucleare intercinetica e le cellule mitotiche fosfo-istoniche H3 positive sulla superficie ventricolare.

La proporzione complessiva di cellule progenitrici neurali auto-rinnovanti può essere determinata calcolando la percentuale di cellule doppie positive di BrdU Ki67 in giallo tra tutte le cellule positive di BrdU in rosso e in giallo nelle sezioni criogeniche trasversali del romboencefalo da embrioni un giorno dopo la somministrazione di BrdU. Le sezioni del vibratomo del rombencefalo possono anche essere immunomarcate con un anticorpo per la proteina del filamento intermedio Nestin, nota anche come RC-2, per visualizzare le cellule progenitrici neurali e le sporgenze. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come analizzare una preparazione a montaggio piatto o sezioni trasversali di tessuto del rombencefalo.

Una volta padroneggiati, fino a 10 rombencefali possono essere sezionati in meno di un'ora. Durante il tentativo di questa procedura, è importante utilizzare la PBS ghiacciata se si familiarizza con la microdissezione del rombencefalo per la prima volta, in quanto ciò facilita la separazione dalle meningi, oltre a garantire la conservazione dei tessuti. Dopo questa procedura, altri metodi come la citometria a flusso possono essere eseguiti su sospensioni di singole cellule del rombencefalo per separare i progenitori neurali da altri tipi di cellule.

L'istituzione di questa tecnica ha spianato la strada ai ricercatori nel campo della neurobiologia dello sviluppo per esplorare i meccanismi della neurogenesi dei mammiferi utilizzando il rombencefalo come alternativa ai modelli convenzionalmente utilizzati per il midollo spinale e il proencefalo. Questo metodo può fornire informazioni sulla neurogenesi del rombencefalo dei mammiferi, ma può anche essere applicato ad altri vertebrati in via di sviluppo, dato il grado di somiglianza strutturale e molecolare tra le specie. Questa tecnica può aiutare la scoperta di nuovi meccanismi che controllano la neurogenesi e aiutare a determinare se quelli identificati altrove nell'asse sono ricapitolati in questa parte del cervello dei vertebrati.