Protocollo sperimentale per il rilevamento della funzione mitocondriale negli eparitociti esposti ai pesticidi organoclorina

È un pasticcio che chiama rispondere a una domanda chiave che hai anche in funzione di campo come il livello ATP e i tassi di consumo di ossigeno. La nuova o la vecchia di una pagina, questa tecnica è che è facile da eseguire ed è molto per una valutazione speciale della funzione mitocondriale cellulare. Per iniziare questo esperimento, semina 20.000 cellule HepG2 in una piastra di Petri con fondo di vetro.

Aggiungere beta-esaclorocicloesano o B-HCH in incubatrice a 37 gradi Celsius e al cinque per cento di CO2 per 24 ore. Preparare una soluzione di sonda a fluorescenza verde mitocondriale millimolare aggiungendo DMSO anidro al mezzo di coltura cellulare DMEM. Quindi aggiungere un millilitro per piatto di questa soluzione alle celle nelle piastre di Petri con fondo di vetro.

E incubare a 37 gradi Celsius per 45 minuti. Dopo l'incubazione, rimuovere la soluzione di sonda fluorescente verde mitocondriale dalle cellule. Aggiungere un millilitro per piatto di mezzo di coltura cellulare DMEM appena preparato a 37 gradi Celsius.

Per rilevare la fluorescenza verde nei mitocondri, osservare le cellule al microscopio confocale. Per valutare i livelli di ATP cellulare, seme a 20.000 cellule HepG2 in sei piastre di pozzo. Aggiungere beta-HCH e incubare a 37 gradi Celsius per 24 ore.

Aggiungere 200 microlitri di tampone di lysis alle cellule di ogni pozzo. Centrifuga a 12.000 volte G per cinque minuti a quattro gradi Celsius, e procedi con la raccolta del supernatante come descritto nel protocollo di testo. Aggiungere 100 microlitri buffer di rilevamento ATP alla piastra.

Aggiungere 100 microlitri di supernatante a celle raccolte a una piastra di pozzo 96 a temperatura ambiente e si è proceduto a rilevare l'ATP cellulare da un luminometro come descritto nel protocollo di testo. Per la valutazione del potenziale della membrana mitocondriale, far crescere le cellule HepG2 in sei piastre di pozzo con l'aggiunta di beta-HCH, come descritto in precedenza. Raccogliere le celle digerendole con 0,5 millilitri 0,25%EDTA per un minuto a 37 gradi Celsius.

Aggiungere un DMEM millilitro per interrompere la digestione e trasferire le cellule digerite in tubi da 1,5 millilitri. Centrifugare i tubi a 1000 volte G per tre minuti, quindi scartare il supernatante. Diluire il pellet cellulare con 0,5 millilitri di mezzo di coltura cellulare e 0,5 millilitri JC1 colorante potenziale della membrana mitocondriale.

E incubare per 20 minuti a 37 gradi Celsius. Quindi, centrifugare i tubi a 600 volte G per tre minuti a quattro gradi Celsius, quindi lavare il pellet di cella secondo il protocollo di testo. Dopo aver centrifugato il pellet lavato, rimuovere il supernatante.

E sospendere di nuovo il pellet in 0,5 millilitri di tampone colorante JC1. Analizza le celle macchiate JC1 tramite citometria a flusso per rilevare la fluorescenza verde e rossa. Quando viene rilevato il monomero JC1, impostare la luce di eccitazione su 490 nanometri e la luce di emissione su 530 nanometri.

Quando viene rilevato il polimero JC1, impostare la luce di eccitazione su 525 nanometri e la luce di emissione su 590 nanometri. Per analizzare il tasso di consumo di ossigeno, seminare cellule HepG2 in una piastra di coltura cellulare di 96 po 'in una densità di 4.500 cellule per 100 microlitri per pozzo. Dopo 24 ore di incubazione a 37 gradi Celsius, assicurarsi che le cellule in ogni pozzo siano coperte di mezzo.

Prima di eseguire il software OCR, caricare la micropiastra con cartuccia e la piastra di coltura cellulare in un analizzatore di flusso extracellulare come descritto nel protocollo di testo. Apri il software OCR e nel menu a discesa app scegli il kit di stress test cell mito e fai clic sul pulsante avvia app. Quindi, fai clic sul pulsante esegui stress test.

Quando viene visualizzata la schermata di prova di stress cellulare, immettere il numero di cellule che seminano per pozzo nella casella del numero di seeding delle celle e l'OCR medio nella casella OCR a cella basale. Immettere la concentrazione di lavoro finale per ogni reagente e quindi iniettare i reagenti. Clicca sul pulsante successivo.

Quando viene visualizzata la schermata delle informazioni di gruppo, assegnare un gruppo ai pozzi non assegnati scegliendo un colore e assegnando un nome. Quindi clicca sui pozzi appropriati. Fare clic sul pulsante successivo e nella schermata del layout di iniezione della prova di stress visualizzata fare clic sull'inizio per eseguire la prova di stress sull'analizzatore.

Dopo l'esecuzione completata, seguire le istruzioni del software, quindi rimuovere e scartare la cartuccia e la piastra cellulare. L'intensità media della colorazione fluorescente verde mitocondriale è diminuita nelle cellule HepG2 esposte al beta-HCH. Ciò dimostra che c'è una diminuzione del numero mitocondriale e un aumento dei mitocondri danneggiati coerente con l'aumento della concentrazione di pesticidi.

Inoltre, i livelli di ATP nelle cellule HepG2 sono diminuiti con l'aumento delle concentrazioni di esposizione al beta-HCH, mostrando la diminuzione della funzione dei mitocondri in queste cellule. Dopo la colorazione JC1 per il potenziale della membrana mitocondriale, o MMP, il citometro a flusso ha mostrato un'alta fluorescenza JC1 verde rosso nelle cellule HepG2 intatte. Ciò è dovuto alla presenza di aggregati JC1 fluorescenti rossi, che sono un segno di mmp elevato.

Nelle cellule trattate con beta-HCH, la fluorescenza JC1 verde rossa è diminuita a causa della presenza di monomeri JC1 fluorescenti verdi, segno di basso MMP. Infine, anche il tasso di consumo di ossigeno è diminuito con l'aumento delle concentrazioni di esposizione al beta-HCH, dimostrando ulteriormente che questo pesticida compromette la corretta funzione mitocondriale. Oh, beh, prova questa procedura, è importante però ricordare di vedere le cellule come appropriato per testarla.

Dopo il suo sviluppo, questo apre sicuramente la strada alle ricerche nel campo della funzione fondamentale per esplorare gli organismi rilevanti nel ruolo medico ad esso associato. Dopo aver guardato questo video, dovresti avere una buona comprensione di come rilevare una quantità o una qualità, una capacità, ora membro o potenziale sotto la funzione del foglio di beccuccio.