Name: Protocollo sperimentale per il rilevamento della funzione mitocondriale negli eparitociti esposti ai pesticidi organoclorina (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Scopri come valutare la funzione mitocondriale in epatociti HepG2 esposti a pesticidi organoclorina. Questo metodo permette di misurare livelli di ATP e consumo di ossigeno per studiare i disordini metabolici.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (Grant Nos. 81573174, 81570574); l'Eccezionale Fondo Giovanile della Provincia di Jiangsu (SBK2014010296); il Progetto di Ricerca del Ministero dell'Istruzione cinese (213015A); il programma accademico prioritario sviluppo degli istituti di istruzione superiore Jiangsu (PAPD), il flagship major development degli istituti di istruzione superiore Jiangsu; e il Programma Open Project del Laboratorio Chiave di Stato di Chimica Ambientale ed Ecotossicologia (KF2015-01).

Tutti gli esperimenti e i protocolli dell'esperimento sono stati eseguiti in conformità con le linee guida e i regolamenti pertinenti e approvati dal Comitato Etico locale dell'Università di Medicina di Nanjing.
1. Ultrastruttura mitocondriale di TEM
<ol><li>Raccolta di celle HepG2<ol>
<li>Seme Cellule HepG2 in piatti da 100 mm. Conservare a 37 gradi centigradi e 5% CO2.</li>
		<li>Digerire le cellule con 0,25% EDTA in tubo 1,5 mLEP.</li>
		<li>Centrifuga a 1000 x g per 3 min a temperatura ambiente (RT). Scarta il supernatant.</li>
		<li>Raccogli 4-6 x 105 cellule HepG2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aggiungere 1 mL di glutaraldeide del 5% (Solvente: acqua doppia distillata) con pipette e incubare a 4oC per 2 h.</li>
	<li>Aggiungere e lavare in 4 cambi di 1 mL di tampone fosfato (contenente Na2HPO4, KH2PO4, NaCl e KCl, pH 7.4), 15 min ciascuno. Succhiare tampone di fosfato con pipette.</li>
	<li>Aggiungere 200 m di osmio dell'1% (Solvente: acqua doppia distillata) e incubare a 4 s per 2 h al campione nero. Attenzione: L'osmio è una sostanza altamente tossica e volatile. Dovrebbe essere operato con attenzione nell'armadietto della droga.</li>
	<li>Aggiungere e lavare in 2 cambi di 1 mL di tampone di fosfato, 5 min ciascuno. Succhiare tampone di fosfato.</li>
	<li>Macchia nella soluzione di acetato di uranil al 2% (Solvente: acqua doppia distillata e acido acetico) in tubo EP da 1,5 mL per 2 h.</li>
	<li>Disidratare e immergere attraverso il 50% di acetone, 70% acetone, 90% di acetone (Solvente: doppia acqua distillata), 2 cambi di acetone assoluto, 15 min ciascuno.</li>
	<li>Penetrare in 2 gocce di acetone (100%)/agente di incorporamento (1:1) per 1,5 h a RT. Epon812 agente di incorporamento, la ricetta è la seguente: A: Epon812, 62 mL e DDSA, 100 mL; B: Epon812, 100 mL e MNA 89 mL. A:B-2:8 (v:v, in inverno), A:B'1:9 (v:v, in estate). Incorporamento in stampi di incorporamento (piastra di plastica morbida con griglia a scacchi).</li>
	<li>Incubare in sequenza a 37 gradi centigradi per 12 h, 45 gradi centigradi per 12 h, e poi 60 gradi per 48 h.</li>
	<li>Preparare e osservare le sezioni ultrasossine (l'area più grande non può superare 0,5 mm e 0,3 mm) con la macchina delle sezioni ultrasossive e TEM (2 m e 500 nm).</li>
</ol>2. Rilevamento dell'intensità della fluorescenza mitocondriale
<ol><li>Seme 2x 104 Cellule HepG2 in piastre a 6 well. Aggiungere β-HCH per 24 h.</li>
	<li>Aggiungere un DMSO anidrosio per formulare una concentrazione finale di sonda fluorescente verde mitocondriale da 1 mM.</li>
	<li>Aggiungere la soluzione di sonda fluorescente verde mitocondriale 1 mL (concentrazione finale: 200 nM) ad ogni pozzo di piastre da 6 pozzetti, incubare a 37 gradi centigradi per 45 min.</li>
	<li>Rimuovere la soluzione della sonda fluorescente verde mitocondriale e aggiungere il mezzo di coltura cellulare (DMEM) appena preparato a 37 gradi centigradi prima dell'imaging.</li>
	<li>Osservare la fluorescenza verde mitocondriale con un microscopio a fluorescenza (10x). La lunghezza d'onda massima di eccitazione al rilevamento è di 490 nm e la lunghezza d'onda massima di emissione è di 516 nm.</li>
</ol>3. Analisi dei livelli ATP cellulari
<ol><li>Seme Cellule HepG2 in piastre 6-pozzo. Aggiungere β-HCH per 24 h.</li>
	<li>Aggiungere 200 tamponi di lysis dal kit di analisi ATP lucifera-luciferin ad ogni pozzo di piastre a 6 gradi. Centrifuga a 12.000 x g per 5 min a 4 gradi centigradi, raccogliere il supernante con le pipette in nuovi tubi.</li>
	<li>Diluire il reagente di rilevamento ATP con la diluizione ATP con un rapporto di 1: 5, come buffer di rilevamento ATP.</li>
	<li>Preparare la determinazione della curva standard: diluire 0,5 mM della soluzione standard ATP a 10, 5, 1, 0,5, 0,1, 0,05, 0,01 M dai buffer di lysi ATP.</li>
	<li>Aggiungere 100 L di buffer di rilevamento ATP in una piastra da 96 pozzetti per 5 min a RT, e aggiungere 100 L di supernatant della cellula, rilevate da un luminometro (rilevatore di chemiluminescenza). Calcolare la concentrazione ATP (nmol/L) attraverso la curva standard.</li>
	<li>Rileva la concentrazione proteica da un kit di analisi delle proteine BCA con lettore multimodo.<ol>
<li>Preparazione della determinazione della curva standard: diluire il 5 mg/mL della soluzione standard proteica a 0, 0,025, 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4 e 0,5 mg/mL con acqua doppia distillata.</li>
		<li>Aggiungere 1 L di supernatant di cellule in una piastra da 96 po 'e aggiungere 19 L di acqua doppia distillata.</li>
		<li>Aggiungere 200 soluzioni di rilevamento BCA per ogni pozzo. Incubate a 37 gradi centigradi per 30 min. Rilevare il valore OD (densità ottica) da un lettore multimodo con 562 nm. Calcolare la concentrazione di proteine (mg/mL) attraverso la curva standard.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Correggere il contenuto ATP per concentrazione di proteina mg (unità: concentrazione ATP/concentrazione proteica, nmol/mg).</li>
</ol>4. Valutazione del potenziale della membrana mitocondriale (MMP) da parte di JC-1
<ol><li>Raccogliere le cellule HepG2 semitesse in piastre di 6 pozzo. Digerire le cellule con 0,25% EDTA nel tubo EP da 1,5 mL, centrifugare a 1000 x g per 3 min, scartare il supernante e raccogliere le cellule.</li>
	<li>Aggiungere 50 L di JC-1 (200X) a 8 mL di acqua distillata al vortice e mescolare. Aggiungere 2 mL di buffer di colorazione delle macchie JC-1 (5X) come soluzione di rilevamento JC-1.</li>
	<li>Incubare le cellule con una miscela di 0,5 mL di coltura cellulare media e 0,5 mL di soluzione di rilevamento JC-1 per 20 min a 37 gradi centigradi.</li>
	<li>Centrifuga a 600 x g per 3 min a 4 gradi centigradi. Scarta il supernatant.</li>
	<li>Risciacquare in 2 cambi di 1 mL di tampone di tintura JC-1 (1X), centrifuga a 600 x g per 3 min a 4 gradi centigradi. E scartare il supernante.</li>
	<li>Sospendere le cellule in 0,5 mL di buffer di tintura JC-1 (1X), analizzare tramite citometria di flusso per rilevare la fluorescenza verde e rossa. Quando viene rilevato il polimero JC-1, impostare la luce di eccitazione su 490 nm e la luce di emissione su 530 nm. Quando viene rilevato il polimero JC-1, impostare la luce di eccitazione su 525 nm e la luce di emissione su 590 nm.</li>
</ol>5. Misure dei tassi di consumo di ossigeno (OCR)
<ol><li>Seme cellule HepG2 in microplacchi di coltura cellulare di 96-pozzo ad una densità di 4500 cellule / 100 L per pozzo. Assicurarsi che le cellule siano coperte con ogni pozzo dopo 24 h.</li>
	<li>Aggiungere il volume appropriato dei reagenti preparati nella porta di iniezione appropriata, secondo la precedente letteratura13. Porta A: 25 L 1 M di oligomicina (ATP Coupler); Porta B: 25 L 0,75 M di FCCP (Controllo elettronico della limitazione, etc acceleratore); Porta C: 25 L 0,5 di antimicina A/rotenone (inibitore mitocondriale A e inibitore mitocondriale B).</li>
	<li>Conservare la cartuccia in un'incubatrice a 37 gradi centigradi senza CO2 fino a quando non è pronta per l'uso.</li>
	<li>Apportare una modifica media della piastra cellulare rimuovendo il supporto di corsa da ogni pozzo e aggiungendo al nuovo DMEM. Il volume finale per ogni pozzo è di 180 L.</li>
	<li>Conservare la piastra cellulare in un'incubatrice di 37 gradi centigradi senza CO2 per 1 h prima del saggio.</li>
	<li>Registrare automaticamente l'OCR tramite software.<ol>
<li>Aprire il software OCR.</li>
		<li>Scegliere Cell Mito Stress Test Kit nel menu a discesa App.</li>
		<li>Fare clic sul pulsante Avvia app.</li>
		<li>Fare clic sul pulsante Esegui test di stress. Viene visualizzata la schermata Impostazione test stress cella.</li>
		<li>Effettuare le seguenti operazioni:<ol>
<li>Immettere il numero di celle di cui viene il seeding per pozzo nella casella Semina cella.</li>
			<li>Immettere l'OCR medio nella casella OCR basale medio.</li>
			<li>Immettere la concentrazione di lavoro finale per ogni reagente e iniettare i reagenti. NOTA: il valore OCR basale medio per la cella avrebbe dovuto essere rilevato prima di eseguire il test di ottimizzazione durante l'ottimizzazione per la concentrazione di seeding delle celle.</li>
			<li>Fare clic sul pulsante Avanti. Viene visualizzata la schermata delle informazioni di gruppo.</li>
			<li>Assegnare un gruppo ai pozzetti non assegnati scegliendo un colore e assegnando un nome, quindi facendo clic sui pozzetti appropriati. NOTA: I diversi gruppi sono definiti come diversi trattamenti prima dell'esecuzione del Test di Stress Mito Cellulare. Tutti i pozzi di microplaline ottengono le stesse iniezioni di reagente quando viene eseguito il test di stress.</li>
			<li>Fare clic sul pulsante Avanti. Viene visualizzata la schermata Layout iniezione test di stress.</li>
			<li>Fare clic su Start. Il test di stress viene ora eseguito sull'analizzatore. Quando la corsa è finita, seguire il punto s nel software, rimuovere e scartare la cartuccia e la piastra cellulare.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Rantakokko, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistent+organic+pollutants+and+non-alcoholic+fatty+liver+disease+in+morbidly+obese+patients%3A+a+cohort+study%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Health%22%5BJournal%5D)">Persistent organic pollutants and non-alcoholic fatty liver disease in morbidly obese patients: a cohort study.</a> Environ Health. 14, 79(2015).</li>
<li>Mrema, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistent+organochlorinated+pesticides+and+mechanisms+of+their+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology%22%5BJournal%5D)">Persistent organochlorinated pesticides and mechanisms of their toxicity.</a> Toxicology. 307, 74-88 (2013).</li>
<li>Dirinck, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obesity+and+persistent+organic+pollutants%3A+possible+obesogenic+effect+of+organochlorine+pesticides+and+polychlorinated+biphenyls%5BTitle%5D)+AND+%22Obesity+%28Silver+Spring%29%22%5BJournal%5D)">Obesity and persistent organic pollutants: possible obesogenic effect of organochlorine pesticides and polychlorinated biphenyls.</a> Obesity (Silver Spring). 19 (4), 709-714 (2011).</li>
<li>Genini, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+induced+by+a+SH2+domain-targeting+STAT3+inhibitor+leads+to+metabolic+synthetic+lethality+in+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction induced by a SH2 domain-targeting STAT3 inhibitor leads to metabolic synthetic lethality in cancer cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. , (2017).</li>
<li>Korovljev, D., Trivic, T., Drid, P., Ostojic, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+hydrogen+affects+body+composition%2C+metabolic+profiles%2C+and+mitochondrial+function+in+middle-aged+overweight+women%5BTitle%5D)+AND+%22Ir+J+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">Molecular hydrogen affects body composition, metabolic profiles, and mitochondrial function in middle-aged overweight women.</a> Ir J Med Sci. , (2017).</li>
<li>Gonzalez-Franquesa, A., Patti, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+Resistance+and+Mitochondrial+Dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Insulin Resistance and Mitochondrial Dysfunction.</a> Adv Exp Med Biol. 982, 465-520 (2017).</li>
<li>Cheng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+Proton+Leak+Plays+a+Critical+Role+in+Pathogenesis+of+Cardiovascular+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial Proton Leak Plays a Critical Role in Pathogenesis of Cardiovascular Diseases.</a> Adv Exp Med Biol. 982, 359-370 (2017).</li>
<li>Cheville, N. F., Stasko, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Techniques+in+electron+microscopy+of+animal+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Pathol%22%5BJournal%5D)">Techniques in electron microscopy of animal tissue.</a> Vet Pathol. 51 (1), 28-41 (2014).</li>
<li>Nazmara, Z., Salehnia, M., HosseinKhani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+Distribution+and+ATP+Content+of+Vitrified%2C+In+vitro+Matured+Mouse+Oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Avicenna+J+Med+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial Distribution and ATP Content of Vitrified, In vitro Matured Mouse Oocytes.</a> Avicenna J Med Biotechnol. 6 (4), 210-217 (2014).</li>
<li>Clapier, C. R., Iwasa, J., Cairns, B. R., Peterson, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+action+and+regulation+of+ATP-dependent+chromatin-remodelling+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of action and regulation of ATP-dependent chromatin-remodelling complexes.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. , (2017).</li>
<li>Reitman, Z. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer-associated+isocitrate+dehydrogenase+1+%28IDH1%29+R132H+mutation+and+d-2-hydroxyglutarate+stimulate+glutamine+metabolism+under+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Cancer-associated isocitrate dehydrogenase 1 (IDH1) R132H mutation and d-2-hydroxyglutarate stimulate glutamine metabolism under hypoxia.</a> J Biol Chem. 289 (34), 23318-23328 (2014).</li>
<li>Nelson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+consumption+rate+v.+rate+of+energy+utilization+of+fishes%3A+a+comparison+and+brief+history+of+the+two+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22J+Fish+Biol%22%5BJournal%5D)">Oxygen consumption rate v. rate of energy utilization of fishes: a comparison and brief history of the two measurements.</a> J Fish Biol. 88 (1), 10-25 (2016).</li>
<li>Liu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organochloride+pesticides+impaired+mitochondrial+function+in+hepatocytes+and+aggravated+disorders+of+fatty+acid+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Organochloride pesticides impaired mitochondrial function in hepatocytes and aggravated disorders of fatty acid metabolism.</a> Sci Rep. 7, 46339(2017).</li>
<li>Tien, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+Glucose+Induces+Mitochondrial+Dysfunction+in+Retinal+Muller+Cells%3A+Implications+for+Diabetic+Retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">High Glucose Induces Mitochondrial Dysfunction in Retinal Muller Cells: Implications for Diabetic Retinopathy.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 58 (7), 2915-2921 (2017).</li>
<li>Dussmann, H., Perez-Alvarez, S., Anilkumar, U., Papkovsky, D. B., Prehn, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+time-lapse+imaging+of+intracellular+O2+in+response+to+metabolic+inhibition+and+mitochondrial+cytochrome-c+release%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">Single-cell time-lapse imaging of intracellular O2 in response to metabolic inhibition and mitochondrial cytochrome-c release.</a> Cell Death Dis. 8 (6), 2853(2017).</li>
<li>Jaiswal, M. K. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5216043/">Riluzole But Not Melatonin Ameliorates Acute Motor Neuron Degeneration and Moderately Inhibits SOD1-Mediated Excitotoxicity Induced Disrupted Mitochondrial Ca2+ Signaling in Amyotrophic Lateral Sclerosis.</a> Front Cell Neurosci. 10, 295(2016).</li>
<li>Song, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lenti-siRNA+Hsp60+promote+bax+in+mitochondria+and+induces+apoptosis+during+heat+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Lenti-siRNA Hsp60 promote bax in mitochondria and induces apoptosis during heat stress.</a> Biochem Biophys Res Commun. 481 (1-2), 125-131 (2016).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tea+tree+oil+exhibits+antifungal+activity+against+Botrytis+cinerea+by+affecting+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Chem%22%5BJournal%5D)">Tea tree oil exhibits antifungal activity against Botrytis cinerea by affecting mitochondria.</a> Food Chem. 234, 62-67 (2017).</li>
<li>Grunig, D., Felser, A., Bouitbir, J., Krahenbuhl, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+catechol-O-methyltransferase+inhibitors+tolcapone+and+entacapone+uncouple+and+inhibit+the+mitochondrial+respiratory+chain+in+HepaRG+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+In+Vitro%22%5BJournal%5D)">The catechol-O-methyltransferase inhibitors tolcapone and entacapone uncouple and inhibit the mitochondrial respiratory chain in HepaRG cells.</a> Toxicol In Vitro. 42, 337-347 (2017).</li>
<li>Mayor, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G+protein-coupled+receptor+kinase+2+%28GRK2%29+as+an+integrative+signalling+node+in+the+regulation+of+cardiovascular+function+and+metabolic+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Signal%22%5BJournal%5D)">G protein-coupled receptor kinase 2 (GRK2) as an integrative signalling node in the regulation of cardiovascular function and metabolic homeostasis.</a> Cell Signal. , (2017).</li>
<li>Clark, A., Mach, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Crosstalk+between+the+Gut+Microbiota+and+Mitochondria+during+Exercise%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Physiol%22%5BJournal%5D)">The Crosstalk between the Gut Microbiota and Mitochondria during Exercise.</a> Front Physiol. 8, 319(2017).</li>
<li>Robicsek, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolated+Mitochondria+Transfer+Improves+Neuronal+Differentiation+of+Schizophrenia-Derived+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+and+Rescues+Deficits+in+a+Rat+Model+of+the+Disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Schizophr+Bull%22%5BJournal%5D)">Isolated Mitochondria Transfer Improves Neuronal Differentiation of Schizophrenia-Derived Induced Pluripotent Stem Cells and Rescues Deficits in a Rat Model of the Disorder.</a> Schizophr Bull. , (2017).</li>
<li>Akinrotimi, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shp+deletion+prevents+hepatic+steatosis+and+when+combined+with+Fxr+loss+protects+against+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Shp deletion prevents hepatic steatosis and when combined with Fxr loss protects against type 2 diabetes.</a> Hepatology. , (2017).</li>
<li>Rosa, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+insights+into+the+antioxidant+role+of+tauroursodeoxycholic+acid+in+experimental+models+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Novel insights into the antioxidant role of tauroursodeoxycholic acid in experimental models of Parkinson's disease.</a> Biochim Biophys Acta. , (2017).</li>
<li>Matondo, A., Kim, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted-Mitochondria+Antioxidants+Therapeutic+Implications+in+Inflammatory+Bowel+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Drug+Target%22%5BJournal%5D)">Targeted-Mitochondria Antioxidants Therapeutic Implications in Inflammatory Bowel Disease.</a> J Drug Target. , 1-30 (2017).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Fondamentale per il successo del protocollo di rilevamento è l'uso di una varietà di metodi sperimentali che sono stati trattati lo studio dal fenotipo al meccanismo. In questo studio, le cellule Dicale sono state colturate in DMEM con penicillina e streptomicina e siero bovino fetale al 10%. Quando le cellule hanno raggiunto il 40-50% di confluenza, β-HCH (0, 10, 100 ng/mL) sono stati aggiunti e incubati per 24 h. In primo luogo abbiamo usato TEM che ha mostrato i cambiamenti ultrastrutturali nell'eparitocita causati da...

Gli effetti dei pesticidi organoclori (OC) sulla salute, ad esempio l'interferenza riproduttiva, la tossicità immunologica, i cambiamenti metabolici sono stati precedentementestudiati 1,2,3. I metodi per rilevare il metabolismo cellulare e scoprire la disfunzione mitocondriale hanno permesso agli scienziati di comprendere il ruolo della funzionemitocondriale (cioè., livelli di STAT3 mitocondriale, lattato, piruvato, rapporto lattato-piruvate, coenzime Q10, perdita di protono mitocondriale, bioenergetica, biogenesi e dinamica) in aree come l'invecchiamento, l'obesità, il diabete, la funzione cardiovascolare, il cancro e la tossicità di sicurezza4,5,6,7. In questo articolo, descriviamo i metodi per valutare la disfunzione mitocondriale causata da OCP.
Abbiamo esposto le cellule DiPG2 a β-esachlorocyclohexane (β-HCH), un OCP rappresentativo, per 24 h ad una dose equivalente all'esposizione interna dell'uomo. In primo luogo, TEM è stato applicato per osservare l'ultrastruttura degli epariti, come nuclei, mitocondri e endoplasmice reticulum8. Rispetto ai normali microscopi, TEM consente di esplorare l'ultrastruttura 2D e 3D di cellule e componenti cellulari (linee cellulari o tessuti), la morfologia, la composizione chimica, nonché la funzione di materiali naturali o artificiali che svolgono un ruolo fondamentale nella scienza e nella tecnologia moderne. La funzione mitocondriale è stata ulteriormente valutata dall'intensità della fluorescenza mitocondriale, dai livelli di adenosina 5'-triphosphate (ATP), dal tasso di consumo di ossigeno (OCR) e dal potenziale di membrana mitocondriale (MMP)nelle cellule HepG2 incubate con β-HCH. Mito-tracker green è una sonda fluorescente verde mitocondri che può essere utilizzata per la colorazione fluorescente specifica mitocondriale a cellule vive. I mitocondri negli eparociti sono stati macchiati da soluzione verde mito-tracker e intensità di fluorescenza mitocondriale, numero e modello sono stati osservati con una microscopia confocale9. La sonda fluorescente verde mitocondriale può essere utilizzata per macchiare le cellule vive. Rispetto alla rodamina 123 o JC-1, la sonda fluorescente verde mitocondriale non dipende dal potenziale di membrana mitocondriale per la colorazione mitocondriale. I livelli di ATP sono stati determinati da un kit luciferasi-luciferina e normalizzati dalla concentrazione di proteine. Kit di analisi ATP può essere utilizzato per rilevare i livelli di ATP in soluzioni comuni, cellule o tessuti. Questo kit si basa sulla luciferasi luccilice catalizzato dalla fluoresina per generare fluorescenza, quando l'ATP è necessario per fornire energia. Quando la luccilice luciferasi e la fluoresina sono eccessive, in un certo intervallo di concentrazione, la generazione di fluorescenza è proporzionale alla concentrazione di ATP. Inoltre, questo kit è stato appositamente progettato per ottimizzare la chemiluminescenza di ATP. L'ATP, come le molecole energetiche più importanti, svolge un ruolo importante nei vari processi fisiologici o patologici delle cellule. I cambiamenti nei livelli ATP possono riflettere i difetti nella funzione cellulare, in particolare la produzione di energia mitocondriale. Di solito sotto apoptosi, necrosi o in qualche stato tossico, i livelli di ATP cellulare ridotto 10. Il kit di analisi MMPs con JC-1 è un kit che utilizza JC-1 come sonda fluorescente per rilevare cellule, tessuti o MMP purificati in modo rapido e sensibile. Può essere utilizzato per la diagnosi precoce di apoptosi. Il colorante cationico JC-1 è una sonda fluorescente utilizzata per rilevare l'MMP che può essere analizzata sotto la citometria di flusso indicata dai cambiamenti del rapporto di fluorescenza verde e rossa. Quando l'MMP è alto, JC-1 viene aggregato nella matrice dei mitocondri per formare un polimero (J-aggregati), che produce fluorescenza rossa. Quando l'MMP è basso, JC-1 non può accumularsi e forma monomero che produce fluorescenza verde11. Quindi il rapporto tra fluorescenza rossa e verde può riflettere il livello di MMP. L'OCR delle cellule è un indicatore cruciale della normale funzione cellulare12. È considerato come un parametro per la ricerca della funzione mitocondriale. Cell mito stress test kit fornisce un metodo stabile per l'analisi dei parametri chiave della funzione mitocondriale. Il kit fornisce il controllo di qualità e reagenti predittivi, nonché un metodo standard per l'esecuzione di test di stress mitocondriale cellulare. Può essere utilizzato per rilevare tutti i tipi di cellule, comprese le cellule primarie, linee cellulari, cellule sospese, e anche per isolotti, nematodi, lieviti e mitocondri isolati.
La misurazione OCR può fornire preziose informazioni sullo stato fisiologico o sulle alterazioni delle cellule. È stato determinato con un analizzatore di flusso extracellulare per rilevare la linea di base respiratoria, la perdita di protoni, il massimo respiratorio, il turnover ATP e la capacità di riserva. In breve, dopo le misurazioni di base di OCR, OCR è stato rilevato dopo l'aggiunta sequenziale a oligomicina (ATP Coupler), FCCP (fosforilazione ossidativa mitocondriale) per pozzo.
Nel tentativo di facilitare lo sviluppo di un protocollo più specifico per rilevare la funzione mitocondriale negli eparociti in vitro, presentiamo qui esperimenti di TEM, microscopia confocale, luminometro, citometria di flusso e analizzatore di flusso extracellulare con futura applicazione nello studio dei danni ai mitocondri relativi agli esiti avversi.

<table><tbody><tr><td>Microscopio elettronico a trasmissione&nbsp;</td><td>FEI</td><td>Tecnai G2 Spirit Bio TWIN</td><td>Imaging ad alto contrasto e ad alta risoluzione, Osservazione e imaging a basse dosi, Osservazione a bassa temperatura, Prestazioni analitiche eccezionali, Automazione per comodità e prestazioni</td></tr><tr><td>Mito-Tracker Green</td><td>Beyotime</td><td>C1048</td><td>Mito-Tracker Green è una sonda fluorescente verde mitocondriale che può essere utilizzata per la colorazione fluorescente mitocondriale specifica per cellule vive.</td></tr><tr><td>Microscopio confocale a scansione laser</td><td>Zeiss</td><td>700B</td><td>Il design è compatto, stabile, il percorso della luce è il più breve, l'alta precisione della luce, la tecnologia creativa e la sofisticata tecnologia di scansione insieme per produrre un'immagine perfetta del campione tridimensionale.</td></tr><tr><td>Kit per il dosaggio dell'ATP potenziato</td><td>Beyotime</td><td>S0027</td> Il <td>kit per il dosaggio dell'ATP potenziato può essere utilizzato per rilevare i livelli di ATP (adenosina 5'-trifosfato) in soluzioni, cellule o tessuti comuni. Le cellule e i campioni di tessuto possono essere divisi per completare la preparazione del campione, la sensibilità di rilevamento fino a 0,1 nmol / L, la chemiluminescenza può essere sostenuta per 30 minuti.</td></tr><tr><td>Luminometro</td><td>Berthold</td><td>Centro LB 960</td><td>Il luminometro è un rivelatore di chemiluminescenza, il campione di prova stesso può essere leggero, non ha bisogno di stimolare. Il luminometro è lo strumento che rileva la chemiluminescenza.</td></tr><tr><td>Kit per il dosaggio delle proteine BCA</td><td>Beyotime</td><td>P0012</td> Il <td>kit per il dosaggio delle proteine BCA è uno dei metodi più comunemente usati per rilevare le concentrazioni proteiche.</td></tr><tr><td>Lettore multimodale</td><td>TECAN</td><td>InfiniteM200</td><td>Il lettore multimodale può essere utilizzato per rilevare l'autorizzazione delle proteine.</td></tr></tbody></table>

protocollo sperimentale per il rilevamento della funzione mitocondriale negli eparitociti esposti ai pesticidi organoclorina

Experimental Protocol for Detecting Mitochondrial Function in Hepatocytes Exposed to Organochlorine Pesticides

Questo documento presenta metodi dettagliati per rilevare la funzione mitocondriale epatico per comprendere meglio la causa dei disturbi metabolici causati dai pesticidi organoclori ambientali (OOC) negli epatociti. Le cellule di HepG2 sono state esposte β-hexachlorocyclohexane (β-HCH) per 24 h ad una dose equivalente di esposizione interna nella popolazione generale. L'ultrastruttura negli eparociti è stata esaminata dalla microscopia elettronica a trasmissione (TEM) per mostrare il danno dei mitocondri. La funzione mitocondriale è stata ulteriormente valutata dall'intensità della fluorescenza mitocondriale, dai livelli di adenosina 5'-triphosphate (ATP), dal tasso di consumo di ossigeno (OCR) e dal potenziale della membrana mitocondriale (MMP) nelle cellule HepG2 incubate con β-HCH. L'intensità della fluorescenza dei mitocondri dopo essere stata osservata con una microscopia a fluorescenza verde mitocondriale è stata osservata con una microscopia a fluorescenza. La reazione luciferina-luciferasi è stata utilizzata per determinare i livelli ATP. L'MMP è stato rilevato dal colorante cationico JC-1 e analizzato sotto la citometria di flusso. L'OCR è stato misurato con un analizzatore di flusso extracellulare. In sintesi, questi protocolli sono stati utilizzati nel rilevamento della funzione mitocondriale negli eparitociti con per indagare sui danni dei mitocondri.

I mitocondri di cellule HepG2 esposte a β-HCH sono stati notevolmente danneggiati. I mitocondri sparsi erano leggermente espansi, di forma irregolare, e la cresta mitocondriale scomparve con un'architettura mitocondriale relativamente anormale (Figura 1).
Intensità media di fluorescenza verde mitocondriale, che rappresenta i mitocondri, diminuita nelle cellule HepG2 esposte a β-HCH (<strong class="x...

Comprendere l'influenza dei pesticidi organoclori ambientali (OC) sulla funzione mitocondriale negli epariti è importante per esplorare il meccanismo degli OC Che causano disturbi metabolici. Questo documento presenta metodi dettagliati per rilevare la funzione mitocondriale epatico.

Protocollo sperimentale per il rilevamento della funzione mitocondriale negli eparitociti esposti ai pesticidi organoclorina

This paper presents detailed methods on detecting hepatic mitochondrial function for a better understanding the cause of metabolic disorders caused by ...

È un pasticcio che chiama rispondere a una domanda chiave che hai anche in funzione di campo come il livello ATP e i tassi di consumo di ossigeno. La nuova o la vecchia di una pagina, questa tecnica è che è facile da eseguire ed è molto per una valutazione speciale della funzione mitocondriale cellulare. Per iniziare questo esperimento, semina 20.000 cellule HepG2 in una piastra di Petri con fondo di vetro.Aggiungere beta-esaclorocicloesano o B-HCH in incubatrice a 37 gradi Celsius e al cinque per cento di CO2 per 24 ore. Preparare una soluzione di sonda a fluorescenza verde mitocondriale millimolare aggiungendo DMSO anidro al mezzo di coltura cellulare DMEM. Quindi aggiungere un millilitro per piatto di questa soluzione alle celle nelle piastre di Petri con fondo di vetro.E incubare a 37 gradi Celsius per 45 minuti. Dopo l'incubazione, rimuovere la soluzione di sonda fluorescente verde mitocondriale dalle cellule. Aggiungere un millilitro per piatto di mezzo di coltura cellulare DMEM appena preparato a 37 gradi Celsius.Per rilevare la fluorescenza verde nei mitocondri, osservare le cellule al microscopio confocale. Per valutare i livelli di ATP cellulare, seme a 20.000 cellule Hep

experimental-protocol-for-detecting-mitochondrial-function

Research

Ricerca

JoVE Journal

Environment

Ambiente

Il confronto del potenziale di membrana mitocondriale tra i campioni fornisce informazioni preziose sullo stato cellulare. Vengono descritti i passaggi dettagliati per isolare i mitocondri e valutare la risposta agli inibitori e ai disaccoppiatori utilizzando la fluorescenza. Il metodo e l'utilità di questo protocollo sono illustrati dall'uso di una coltura cellulare e di un modello animale di stress cellulare.

Isolamento e analisi funzionale dei mitocondri da cellule in coltura e Tissue mouse

De novo lipogenesi e acido ossidazione β-grassi costituiscono importanti vie metaboliche in epatociti, percorsi che sono perturbate in diversi disordini metabolici, tra cui malattia del fegato grasso. Qui mostriamo isolamento di epatociti primari di topo e descriviamo la quantificazione di ossidazione degli acidi β-grassi e lipogenesi.

Determinazione della ossidazione degli acidi grassi e la lipogenesi nel topo primaria Epatociti

Viene descritto un protocollo per il rilevamento in vivo degli effetti degli inibitori mitocondriali nell'organismo modello Caenorhabditis elegans e per l'identificazione di potenziali composti potenzianti. Questo protocollo può essere utilizzato per lo screening di librerie di farmaci alla ricerca di composti che modulano la funzione mitocondriale.

Un Screenable<em&gt; In Vivo</em&gt; Saggio per mitocondriale modulatori Uso Transgenic Bioluminescent<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Qui, si condividono i metodi di misurazione del consumo di ossigeno mitocondriale, un concetto di definizione di energetica nutrizionale e perdita di protone, la causa primaria di inefficienza nella generazione mitocondriale di ATP. Questi risultati possono rappresentare 30% di energia perdita nell'utilizzazione dei nutrienti per aiutare a valutare la funzione mitocondriale.

Misurazione del consumo dell'ossigeno mitocondriale del fegato e cinetica di perdita del protone per stimare la respirazione mitocondriale nei bovini da latte Holstein

Abbiamo esposto un sistema microfisiologico (MPS) con organoidi intestinali e epatici ad acetaminofene (APAP). Questo articolo descrive i metodi per la produzione di organoidi e le valutazioni della proprietà farmacocinetica e tossicologica APAP nelle MPS. Descrive anche le analisi della funzionalità tissutale necessarie per convalidare i risultati.

Un sistema microfisiologico intestino/fegato per la valutazione farmacocinetica e tossicologica

Abbiamo sviluppato un protocollo pratico e un approccio analitico per valutare la fosforilazione ossidativa mitocondriale e la capacità di trasferimento di elettroni negli omogeneizzati tumorali freschi. Questo protocollo può essere facilmente adattato per esaminare varie funzioni mitocondriali che contribuiscono all'inizio, alla progressione e alla risposta al trattamento del cancro.

Determinazione analitica della funzione mitocondriale degli omogeneizzati tumorali solidi asportati

In questo lavoro, descriviamo un protocollo modificato per testare il flusso del substrato respiratorio mitocondriale utilizzando la perfringolisina O ricombinante in combinazione con la respirometria basata su micropiastre. Con questo protocollo, mostriamo come la metformina influisce sulla respirazione mitocondriale di due diverse linee cellulari tumorali.

Misurazione del flusso del substrato mitocondriale in cellule ricombinanti perfringolisina O-permeabilizzate

Qui, presentiamo una raccolta di saggi per misurare direttamente la funzione mitocondriale nelle cellule di mammifero indipendentemente dalla loro capacità di consumare ossigeno molecolare.

Saggi indipendenti dall'ossigeno per misurare la funzione mitocondriale nei mammiferi

Il protocollo descrive un nuovo metodo per valutare la citotossicità integrale dei metaboliti dei pesticidi triazolici nelle piante.

Valutazione della citotossicità dei metaboliti dei tipici pesticidi triazolici nelle piante

Questo studio introduce una metodologia per lo studio degli effetti degli xenobiotici sulla funzione mitocondriale tramite saggi respirometrici ed enzimatici. Esamina la modulazione della catena di trasporto degli elettroni in varie specie, offrendo approfondimenti per lo sviluppo mirato di biopesticidi contro le malattie trasmesse da insetti vettori.

Svelare il trasporto e gli effetti degli xenobiotici nei mitocondri isolati: approfondimenti da saggi respirometrici ed enzimatici

Scopri come valutare la funzione mitocondriale in epatociti HepG2 esposti a pesticidi organoclorina. Questo metodo permette di misurare livelli di ATP e consumo di ossigeno per studiare i disordini metabolici.

Protocollo sperimentale per il rilevamento della funzione mitocondriale negli eparitociti esposti ai pesticidi organoclorina

Esplora altri video