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La "cromatografia" si riferisce a un'ampia gamma di metodi utilizzati per isolare un componente da una miscela complessa, un passaggio essenziale prima che le proprietà e le attività di una biomolecola possano essere determinate. Ogni tecnica cromatografica ha un meccanismo di separazione diverso, a seconda della matrice del campione e del composto target. Questo video si concentrerà sui principi e sul funzionamento di due metodi comuni alla biochimica: la cromatografia ad esclusione dimensionale e la cromatografia di affinità.
La cromatografia ad esclusione dimensionale o SEC si basa sulle dimensioni dei composti nel campione. Una fase mobile contenente il campione viene aggiunta a una colonna con un materiale poroso: la fase stazionaria. Le molecole nel campione rientrano in 1 delle 3 categorie.
Le molecole troppo grandi per entrare nei pori percorrono la distanza più breve attraverso la colonna. Tutte le specie con un peso molecolare superiore a questo "limite di esclusione" usciranno contemporaneamente dalla colonna. Le molecole abbastanza piccole da entrare liberamente nei pori verranno trattenute più a lungo e usciranno insieme dalla colonna. Il peso molecolare che consente l'ingresso completo dei pori è il "limite di permeazione".
Solo le molecole tra questi limiti saranno separate l'una dall'altra, poiché trascorrono quantità variabili di tempo a diffondersi dentro e fuori dai pori. Le molecole più piccole vengono trattenute più a lungo sulla colonna perché trascorrono più tempo nella fase stazionaria, mentre le molecole più grandi entro questi limiti escono prima.
I pesi molecolari compresi tra 1 e 2 ordini di grandezza rientrano in questi limiti. Le colonne vengono scelte tenendo presente questo aspetto, oppure è possibile utilizzare più colonne in serie se esiste un'ampia gamma di composti desiderati.
Ora che hai visto la teoria della SEC, diamo un'occhiata a come viene eseguita.
Per iniziare la procedura SEC, la colonna deve essere bilanciata con acqua deionizzata e tampone cromatografico. Una volta preparato, il tampone contenente il campione viene iniettato sulla colonna. Il tampone viene quindi spinto a bassa portata. Un rivelatore monitora ciò che esce dalla colonna per determinare la presenza dell'analita desiderato. Contemporaneamente dalla colonna escono molecole di grandi dimensioni con pesi molecolari superiori al limite di esclusione. Piccole frazioni dalla colonna vengono raccolte in tubi. Ogni frazione viene testata per la qualità della molecola bersaglio mediante elettroforesi su gel o altre tecniche analitiche.
Ora diamo un'occhiata alla cromatografia di affinità o AC, uno dei modi più efficienti per purificare le proteine. Molte biomolecole si legano selettivamente a certi ligandi, una proprietà che l'AC utilizza facendo aderire un ligando specifico alla fase stazionaria.
Quando la miscela scorre attraverso la colonna, le molecole bersaglio si attaccano al ligando e il resto fluisce attraverso. Dopo che la miscela è passata attraverso la colonna, la molecola bersaglio può essere raccolta attraverso uno dei due metodi di eluizione in base alla specificità.
Si può dire che la bioeluizione abbia un ruolo "normale" o "inverso". Nell'eluizione biospecifica a ruolo normale, viene aggiunto un agente che compete con il ligando aderente per legarsi con la biomolecola bersaglio.
Nell'eluizione biospecifica a ruolo inverso, un agente compete con il bersaglio per legarsi al ligando aderito. Il secondo tipo di eluizione, l'eluizione "non specifica", riduce il legame bersaglio-ligando modificando il pH, la forza ionica o la polarità della soluzione. Se una proteina non si lega a un ligando che può essere immobilizzato, la proteina può essere espressa contenente un "tag": brevi sequenze peptidiche ingegnerizzate per legarsi al ligando.
Una varietà è la cromatografia di affinità con ioni metallici immobilizzati, "IMAC" in breve, in cui un legante metallico aderito, come il nichel o il cobalto, si lega ai residui di istidina sulla proteina modificata. Attraverso tecniche di biologia molecolare, le proteine bersaglio vengono generate con residui ripetuti di istidina, chiamati tag poliistidinici, che si legano al metallo attraverso la catena laterale dell'imidazolo sull'istidina. Una volta legata, la proteina può essere raccolta con l'imidazolo libero tramite eluizione specifica a ruolo inverso e successivamente utilizzata in un'ampia varietà di applicazioni a valle. Ora che hai visto la teoria della cromatografia di affinità, diamo un'occhiata a una procedura IMAC in laboratorio.
Nell'IMAC, la fase stazionaria può essere aggiunta direttamente alla miscela di fase mobile e campione, consentendo il legame della proteina marcata con his. Questo impasto viene quindi versato nella colonna, dove i composti non legati gocciolano nei rifiuti, mentre il liquame rimane. Il contenitore del liquame viene risciacquato per raccogliere la resina residua e il campione, che viene aggiunto alla colonna.
La resina viene agitata per garantire che i componenti non legati scorrano liberamente. L'aggiunta di un tampone di lavaggio aiuta a sciacquarli. Una volta rimossi tutti i componenti non legati, i rifiuti vengono sostituiti con un contenitore per raccogliere la proteina bersaglio.
Il tampone contenente imidazolo viene aggiunto, mescolato e lasciato riposare per slegare la molecola bersaglio. L'imidazolo si lega al metallo, sostituendo e rilasciando la proteina marcata. La proteina liberata viene raccolta e il passaggio dell'imidazolo viene ripetuto per garantire la raccolta totale. Per purificare ulteriormente il campione, il SEC può essere eseguito sul campione prima dell'analisi.
Ora che abbiamo visto la teoria e la procedura di queste due tecniche, diamo un'occhiata ad alcuni dei modi in cui vengono applicate in campo biochimico.
Un motivo comune per purificare le proteine è studiare il loro ruolo nelle malattie. La fibrosi cistica è causata da difetti nella proteina regolatrice della conduttanza transmembrana della fibrosi cistica, o CFTR. Dopo aver coltivato la proteina con un his-tag nel lievito, sia la cromatografia di affinità che quella ad esclusione dimensionale consentono l'isolamento della proteina, seguita dallo studio della sua funzione.
In alcuni casi, la presenza di un tag poliistidina può modificare la struttura di una proteina, influenzandone così la funzione. Un altro tag comune è la proteina legante il maltosio o MBP, che si lega all'amilosio legato in una colonna. Il maltosio viene quindi utilizzato per rilasciare il complesso. L'MBP può quindi essere scisso e rimosso con SEC per produrre la proteina pura desiderata.
Hai appena guardato il video di JoVE sull'esclusione dimensionale e la cromatografia di affinità. Copriva la teoria delle tecniche, esaminava le procedure generali e copriva alcuni degli usi delle tecniche.
Grazie per l'attenzione!
