Biochimica

La dialisi è una tecnica comune utilizzata in biochimica per separare le molecole in base alla diffusione. In questa procedura, una membrana semipermeabile consente il movimento di determinate molecole in base alle dimensioni. Questo metodo può essere applicato alla rimozione del tampone, noto come desalazione, o allo scambio di molecole tampone o ioni da una soluzione proteica. Questo video copre i principi della dialisi insieme a una procedura generale.  Vengono esaminate diverse applicazioni...

La cinetica enzimatica descrive gli effetti catalitici degli enzimi, che sono biomolecole che facilitano le reazioni chimiche necessarie per gli organismi viventi. Gli enzimi agiscono sulle molecole, denominate substrati, per formare prodotti. I parametri cinetici enzimatici sono determinati tramite saggi che misurano direttamente o indirettamente i cambiamenti nella concentrazione del substrato o del prodotto nel tempo. Questo video coprirà i principi di base della cinetica enzimatica...

La ionizzazione a desorbimento laser assistito da matrice (MALDI) è una sorgente ionica di spettrometria di massa ideale per l'analisi di biomolecole. Invece di composti ionizzanti allo stato gassoso, i campioni sono incorporati in una matrice, che viene colpita da un laser. La matrice assorbe la maggior parte dell'energia; parte di questa energia viene quindi trasferita al campione, che si ionizza di conseguenza. Gli ioni campione possono quindi essere identificati utilizzando un analizzatore...

Nella spettrometria di massa tandem una biomolecola di interesse viene isolata da un campione biologico e quindi frammentata in più subunità per aiutare a chiarire la sua composizione e sequenza. Ciò si ottiene avendo spettrometri di massa in serie. Il primo spettrometro ionizza un campione e ioni filtra di uno specifico rapporto massa/carica. Gli ioni filtrati vengono quindi frammentati e passati a un secondo spettrometro di massa dove vengono analizzati i frammenti. Questo video introduce i...

La cristallizzazione delle proteine, ottenendo un reticolo solido di biomolecole, chiarisce la struttura delle proteine e consente lo studio della funzione proteica. La cristallizzazione comporta l'essiccazione di proteine purificate sotto una combinazione di molti fattori, tra cui pH, temperatura, forza ionica e concentrazione proteica. Una volta ottenuti i cristalli, la struttura proteica può essere chiarita mediante diffrazione a raggi X e calcolo di un modello di densità elettronica. Questo...

In biochimica, i metodi di purificazione basati sulla cromatografia sono impiegati per isolare i composti da una miscela complessa. Due di questi metodi usati comunemente dai biochimici sono la cromatografia ad esclusione dimensionale e la cromatografia di affinità. Nella cromatografia ad esclusione dimensionale, una colonna piena di perle porose separa i componenti di una miscela in base alle dimensioni. D'altra parte, la cromatografia di affinità consente una separazione più specifica delle...

L'elettroforesi su gel bidimensionale (2DGE) è una tecnica in grado di risolvere migliaia di biomolecole da una miscela. Questa tecnica prevede due distinti metodi di separazione che sono stati accoppiati insieme: la messa a fuoco isoelettrica (IEF) e l'elettroforesi su gel di poliacrilammide dodecilsolfato di sodio (SDS-PAGE). Questo separa fisicamente i composti attraverso due assi di un gel dai loro punti isoelettrici (una proprietà elettrochimica) e dai loro pesi molecolari. La procedura in...

L'etichettatura metabolica viene utilizzata per sondare le trasformazioni e le modifiche biochimiche che si verificano in una cellula. Ciò si ottiene utilizzando analoghi chimici che imitano la struttura delle biomolecole naturali. Le cellule utilizzano analoghi nei loro processi biochimici endogeni, producendo composti che sono etichettati. L'etichetta consente l'incorporazione di tag di rilevamento e affinità, che possono quindi essere utilizzati per chiarire le vie metaboliche utilizzando...

Il test di spostamento della mobilità elettroforetica (EMSA) è una procedura biochimica utilizzata per chiarire il legame tra proteine e acidi nucleici. In questo test vengono miscelati un acido nucleico radiomarcizzato e una proteina di prova. Il legame è determinato tramite elettroforesi su gel che separa i componenti in base a massa, carica e conformazione. Questo video mostra i concetti di EMSA e una procedura generale, tra cui la preparazione di gel e proteine, il legame, l'elettroforesi e...

La misurazione della concentrazione è un passo fondamentale di molti saggi biochimici. La determinazione fotometrica delle proteine sfrutta il fatto che più un campione contiene sostanze che assorbono la luce, meno la luce trasmetterà attraverso di esso. Poiché la relazione tra concentrazione e assorbimento è lineare, questo fenomeno può essere utilizzato per misurare la concentrazione in campioni in cui è sconosciuta. Questo video descrive le basi della determinazione fotometrica delle...

L'ultracentrifugazione a gradiente di densità è una tecnica comune utilizzata per isolare e purificare biomolecole e strutture cellulari. Questa tecnica sfrutta il fatto che, in sospensione, le particelle più dense del solvente si sedimenteranno, mentre quelle meno dense galleggieranno. Un ultracentrifuga ad alta velocità viene utilizzato per accelerare questo processo al fine di separare le biomolecole all'interno di un gradiente di densità, che può essere stabilito stratificando liquidi di...

I saggi di co-immunoprecipitazione (CoIP) e pull-down sono metodi strettamente correlati per identificare interazioni proteine-proteine stabili. Questi metodi sono correlati all'immunoprecipitazione, un metodo per separare una proteina bersaglio legata a un anticorpo da proteine non legate. In CoIP, una proteina legata agli anticorpi è a sua volta legata a un'altra proteina che non si lega con l'anticorpo, questo è seguito da un processo di separazione che preserva il complesso...

La ricostituzione è il processo di ritorno di una biomolecola isolata alla sua forma o funzione originale. Ciò è particolarmente utile per lo studio delle proteine di membrana, che consentono importanti funzioni cellulari e influenzano il comportamento dei lipidi vicini. Per studiare la funzione delle proteine di membrana purificate in situ, devono essere ricostituite integrandole in una membrana lipidica artificiale. Questo video introduce i concetti di ricostituzione delle proteine di...

Il trasferimento di energia di risonanza di Förster (FRET) è un fenomeno utilizzato per studiare le interazioni biochimiche a distanza ravvicinata. In FRET, una molecola fotoluminescente donatrice può trasferire in modo non radiativo energia a una molecola accettore se i rispettivi spettri di emissione e assorbanza si sovrappongono. La quantità di energia trasferita – e di conseguenza l'emissione complessiva del campione – dipende dalla vicinanza di una coppia accettore-donatore di molecole...

La risonanza plasmonica di superficie (SPR) è il fenomeno ottico alla base dei biosensori privi di etichette per valutare l'affinità molecolare, la cinetica, la specificità e la concentrazione delle biomolecole. In SPR, le interazioni biomolecolari avvengono su un biosensore costituito da un sottile strato di metallo su un prisma. Le interazioni in tempo reale delle biomolecole possono essere monitorate misurando i cambiamenti di luce riflessa dalla parte inferiore del metallo. Questo video...