Catturare la cinetica di interazione di una proteina di canale ionico con piccole molecole mediante il saggio di interferometria di Bio-strato

L'obiettivo generale di questo saggio di interferometria a biostrato è misurare la potenziale interazione tra la proteina del canale ionico hEAG1 purificata e i lipidi di piccole molecole. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della farmacologia dei canali ionici, ad esempio se la piccola molecola di interesse può interagire direttamente con questo canale ionico e quali sono le cinetiche dell'interazione? Il vantaggio principale di questa tecnica è che si tratta di un metodo privo di manodopera e ad alta produttività.

È necessaria solo una piccola quantità di proteine immobilizzate. In generale, le persone che sono nuove a questo metodo avranno difficoltà perché un test di successo prevede più passaggi, tra cui l'espressione delle proteine, la purificazione, la marcatura, il sensore accuratamente sintonizzato e l'analisi dei dati. Dopo aver coltivato le cellule T HEK293 che esprimono hEAG1 per due o tre giorni, raccogliere le cellule rimuovendo il mezzo di crescita e utilizzare quattro millilitri di PBS per lavare le cellule due volte.

Scartare il PBS. Svuotare le cellule in due millilitri di PBS per piatto e utilizzare una pipetta da un millilitro per trasferire le cellule in una provetta da 15 millilitri. Centrifugare la sospensione della cella a 420 volte la gravità e quattro gradi Celsius per cinque minuti.

Quindi, decantare il surnatante e utilizzare quattro millilitri di tampone di lisi per risospendere il pellet. Incubare la sospensione su ghiaccio per 30 minuti, agitando accuratamente il lisato ogni 10 minuti. Quindi, centrifugare il lisato cellulare a 12.000 volte la gravità e quattro gradi Celsius per 10 minuti.

Quindi, trasferire il surnatante in una provetta da cinque millilitri e tenerlo in ghiaccio per un uso immediato. Per preparare la resina di affinità anti-FLAG M2, sospendere accuratamente la resina mediante una leggera inversione per assicurarsi che il flacone di gel anti-FFINITY M2 sia una sospensione uniforme di perle di gel. Trasferire immediatamente 400 microlitri di sospensione in un tubo raffreddato da 1,5 millilitri.

Quindi, centrifugare la sospensione a 8.000 volte la gravità e quattro gradi Celsius per 30 secondi e scartare con cura il surnatante per lavare via il tampone di stoccaggio. Per risospendere il pellet di resina, aggiungere 500 microlitri di surnatante di estratto proteico alla resina e trasferire la sospensione in un nuovo tubo da cinque millilitri raffreddato. Pipettare altri 500 microlitri di estratto proteico nella provetta originale per raccogliere eventuali perle rimanenti e trasferire l'estratto nella provetta da cinque millilitri.

Incubare la miscela su uno shaker a otto giri/min e quattro gradi Celsius durante la notte per legare la proteina di fusione FLAG alla resina. Quindi, centrifugare la miscela a 1.000 volte la gravità a quattro gradi Celsius per 10 minuti. Scartare il surnatante e lavare il pellet tre volte con 500 microlitri di un x PBS.

Tienilo sul ghiaccio per un uso immediato. Aggiungere 10 microlitri di tre soluzioni di eluizione FLAG a 390 microlitri di PBS per una concentrazione finale di 200 nanogrammi per microlitro. Quindi, aggiungere 400 microlitri di tre soluzioni di eluizione FLAG alle perle di gel precedentemente preparate.

Incubare il campione su un incubatore vibrante a otto giri/min e quattro gradi Celsius per due ore. Quindi, centrifugare la resina a 8000 volte la gravità per 30 secondi. Trasferire il surnatante in un tubo fresco da 1,5 millilitri e conservarlo a quattro gradi Celsius per un uso immediato.

Utilizzare il dosaggio delle proteine BCA secondo le istruzioni del produttore per determinare la concentrazione della proteina purificata. Quindi, utilizzare un campione da 30 microlitri per l'analisi Western Blot con un anticorpo anti-Flag per confermare che la proteina di interesse è stata purificata. Per etichettare la proteina purificata con biotina, preparare cinque milligrammi per millilitro di soluzione madre di biotina in PBS.

Per ogni test di due biosensori, aggiungere un eccesso di biotina di tre volte molare a 20 microgrammi di proteina purificata per ottenere una preferibile biotinilazione N-terminale della proteina purificata nella PBS. Incubare il campione al buio su ghiaccio per almeno 30 minuti. Per rimuovere la biotina non legata e il tampone, scambiare la proteina in tampone SD.

Trasferire la proteina in un dispositivo di ultrafiltrazione con un taglio molecolare di 30 kilodalton. Quindi, aggiungere il tampone SD e centrifugare il campione a 12.000 volte la gravità e quattro gradi Celsius per 10 minuti. Rimuovere l'ultrafiltrato dalla provetta da centrifuga.

Aggiungere 200 microlitri di tampone SD nel dispositivo di filtraggio e centrifugare nuovamente il campione. Ripeti il processo almeno tre volte. Raccogliere il campione tampone sostituito capovolgendo il dispositivo di filtrazione e posizionarlo in una provetta da 1,5 millilitri.

Centrifugare il campione a 2.000 volte la gravità e quattro gradi Celsius per cinque minuti. Tenere il campione sul ghiaccio per un uso immediato. Per eseguire il test BLI, 30 minuti prima dello studio, preriscaldare l'apparecchiatura accendendo lo strumento.

Controllare la finestra di stato dello strumento per confermare che la macchina sia pronta prima di iniziare. Assicurarsi che lo sportello dello strumento sia chiuso prima di aprire il software di acquisizione dati e nella procedura guidata dell'esperimento, scegliere il Nuovo esperimento cinetico. Definisci i pozzetti da utilizzare sulla piastra a 96 pozzetti facendo clic con il pulsante destro del mouse per scegliere il buffer, il carico e il campione.

Per i pozzetti del campione, l'unità di concentrazione di PIP2 deve essere inserita come molari. Per definire le fasi del saggio, scegliere una fase e fare doppio clic sulla rispettiva colonna. Per i sensori di controllo viene impostato un duplicato della definizione del saggio.

Impostare il numero di giri su 1.000. Scegli un minuto per la fase di base e da cinque a 10 minuti rispettivamente per il caricamento, l'associazione e la dissociazione. Eseguire il test a temperatura ambiente.

Fare clic sulle colonne che contengono i sensori e fare clic su Riempi per indicare la posizione dei sensori nel vassoio del sensore. Rivedi tutti i passaggi pianificati per verificare la presenza di errori e torna indietro per correggerli. Nell'intera operazione del saggio BLI, la fase di revisione di tutti i passaggi pianificati potrebbe essere trascurata dal ricercatore.

Tuttavia, è molto importante verificare che tutti i passaggi pianificati siano corretti. Impostare la posizione dei file di dati e fare clic su Vai per avviare il test. Eseguire il test e analizzare i dati secondo il protocollo di testo.

Come si è visto in questo esperimento di patch clamp in una cellula T HEK293, che esprime stabilmente hEAG1, le correnti di potassio verso l'esterno dipendenti dal voltaggio suggeriscono che i canali funzionali di hEAG1 sono altamente espressi nelle cellule. Utilizzando l'anticorpo anti-FLAG, questo Western Blot di hEAG1 da campioni di proteine purificate indica la qualità e la specificità della proteina purificata. La proteina canale purificata è stata biotinilata per eseguire un saggio di interazione con il lipide PIP2 utilizzando il saggio BLI in tempo reale.

Qui è mostrata una tipica curva di legame tra hEAG1 e PIP2. hEAG1 è legato a PIP2 in modo dipendente dalla concentrazione. Le concentrazioni accumulate di PIP2 corrispondono alle tracce di dati del biosensore.

Questo test rappresentativo mostra i cambiamenti nell'interferenza ottica in diverse concentrazioni di PIP2. Infine, è stato ottenuto un adattamento della curva con l'equazione di Hill dal valore di picco del segnale di interferenza ottica misurato a diverse concentrazioni di PIP2 e sono state determinate le costanti di dissociazione di equilibrio tra hEAG1 e PIP2. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in circa un'ora se eseguita correttamente.

Quando si tenta questa procedura, è molto importante ricordarsi di rivedere tutti i passaggi pianificati, per assicurarsi che questa procedura sia corretta. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come il patch clamp per rispondere a ulteriori domande come l'identificazione della funzione di questo canale ionico dopo aver legato la piccola molecola. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dello screening dei ligandi dei canali ionici per esplorare i nuovi ligandi nella scoperta di farmaci sui canali ionici.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare la proteina del canale ionico e di come testare la sua interazione con piccole molecole, con il metodo BLI.