Elettroforesi bidimensionale su gel

L'elettroforesi su gel bidimensionale, o 2D, è una tecnica che utilizza due metodi di separazione distinti in grado di separare migliaia di proteine da una singola miscela. Una delle tecniche, SDS-PAGE o elettroforesi su gel di poliacrilammide sodio dodecil solfato, non può separare completamente le miscele complesse da sola. L'elettroforesi su gel 2D accoppia la SDS-PAGE a un secondo metodo, la focalizzazione isoelettrica o IEF, che separa in base ai punti isoelettrici, consentendo la risoluzione di tutte le proteine in un lisato cellulare. Questo video mostrerà i principi dell'elettroforesi su gel 2D, una procedura generale e alcune delle sue applicazioni biomediche.

L'elettroforesi su gel 2D inizia con IEF come prima dimensione. Ogni proteina ha un valore di pH, chiamato punto isoelettrico o pI, dove la carica netta è zero. Quando una proteina è sottoposta a un campo elettrico, si muoverà verso l'elettrodo con carica opposta. I campioni di interesse vengono caricati su strisce di gradiente di pH immobilizzato, o IPG, che hanno anfoliti incorporati, molecole contenenti sia gruppi acidi che basici. Un campo elettrico viene quindi applicato alla striscia di gradiente di pH, provocando la migrazione delle proteine fino a raggiungere il valore di pH corrispondente al loro pI, dove perdono la loro carica netta.

Prima di eseguire la seconda dimensione, le proteine incorporate vengono trattate con SDS, denaturandole e fornendo una carica negativa uniforme. Una volta completate, le strisce IPG vengono posizionate su un gel di poliacrilammide. Un campo elettrico applicato attira le proteine verso l'anodo, con le proteine più grandi che si muovono più lentamente attraverso il gel.

Una volta che la miscela proteica è stata separata in base al pI e al peso molecolare, la mappa del proteoma viene visualizzata utilizzando le colorazioni e vengono identificate le proteine di interesse.

Ora che abbiamo discusso i principi dell'elettroforesi su gel 2D, esaminiamo una tipica procedura di laboratorio.

Prima che l'esperimento possa essere eseguito, le proteine devono essere solubilizzate in terreni. La solubilizzazione del campione si ottiene deaggregando le proteine con una combinazione di agenti caotropici per interrompere le interazioni tra legami idrogeno, detergenti non ionici per prevenire l'alterazione della carica delle proteine, agenti riducenti per rompere i legami disolfuro e tamponi. Per rimuovere le proteine abbondanti che interferiscono e altre molecole, il materiale viene estratto in sequenza mediante centrifugazione e raccolta del pellet risultante; seguito da un trattamento con endonucleasi, un enzima utilizzato per consumare qualsiasi DNA che interferirebbe con l'esperimento.

Una volta che le proteine sono state solubilizzate, le strisce IPG vengono preparate risciacquando con una soluzione detergente e lasciate asciugare capovolte. Ad ogni striscia viene quindi assegnato un numero di supporto della striscia. Una volta pronto, l'estratto cellulare viene caricato sulle strisce con un movimento lento e scorrevole dal lato negativo a quello positivo. Ai fini della reidratazione, la carta assorbente umida viene posizionata sopra l'elettrodo e sotto le strisce di gel; le strisce IPG vengono quindi allineate sullo strumento IEF. Viene applicata un'elevata corrente elettrica e le proteine iniziano a migrare.

Dopo il completamento della prima dimensione, il gel per SDS-PAGE viene preparato in un apparecchio di colata. Le strisce IPG vengono trattate posizionandole a faccia in giù in un tampone di equilibrio contenente SDS. L'unità di elettroforesi è predisposta con l'aggiunta di tampone per elettroforesi. Le strisce IPG trattate vengono raccolte utilizzando una pinzetta, posizionate sopra le piastre di gel e sigillate con una soluzione sigillante all'agarosio. Una sorgente di tensione applica quindi un campo elettrico, che viene mantenuto fino a quando le proteine che si muovono più velocemente si trovano a 1 cm dal fondo del gel.

Dopo il completamento dell'elettroforesi, le proteine devono essere visualizzate. Tradizionalmente questo viene eseguito colorando con nitrato blu di Coomassie o nitrato d'argento. Le proteine di interesse possono essere trasferite dal gel e analizzate mediante analisi Western blot.

Un secondo approccio di identificazione prevede l'escissione delle proteine dal gel, la loro digestione, quindi l'analisi mediante spettrometria di massa.

Ora che abbiamo esaminato una procedura, diamo un'occhiata ad alcuni degli usi dell'elettroforesi su gel 2D.

Uno degli usi più comuni di questa tecnica è l'identificazione delle molecole coinvolte nell'inizio e nella progressione della malattia. L'elettroforesi su gel 2D, abbinata alla spettrometria di massa, è in grado di rilevare l'up- o il down-regulation di proteine specifiche nelle aree malate rispetto a quelle sane.

Inoltre, l'elettroforesi su gel 2D è utile per seguire l'andamento della risposta dei pazienti a un potenziale farmaco terapeutico. I campioni possono essere prelevati dai pazienti in vari momenti dopo la somministrazione del trattamento. In questo modo, l'elettroforesi su gel 2D abbinata all'analisi Western blot o alla spettrometria di massa, può rilevare proteine associate a risposte negative come l'infiammazione; o l'assenza di proteine in uno stato alleviato.

Un altro uso dell'elettroforesi su gel 2D è lo studio della struttura e della funzione delle proteine in seguito a modifiche post-traduzionali, o PTM, che sono aggiunte alle proteine in seguito alla loro traduzione dall'mRNA. I PTM possono regolare una varietà di funzioni, tra cui la segnalazione delle proteine, l'espressione genica o causare danni ossidativi. L'elettroforesi su gel 2D è sensibile a modifiche come la metilazione o l'acetilazione, che possono causare uno spostamento del pI e del peso molecolare.

Hai appena visto il video di JoVE sull'elettroforesi su gel 2D. Questo video descrive i principi della tecnica, una tipica procedura sperimentale, e diverse delle sue applicazioni nel campo della biomedicina.

Grazie per l'attenzione!