Usando tre colori singola molecola FRET per studiare la correlazione delle interazioni della proteina

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di studiare la dinamica di sistemi proteici complessi in modo quantitativo con particolare attenzione alle interazioni correlate come la cooperatività. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia quantitativa in cui i complessi proteici e le loro interazioni dinamiche sono di importanza centrale. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente di applicare FRET dinamico multicolore a singola molecola a sistemi biologicamente rilevanti.

Prima di assemblare la camera di flusso, tagliare un canale di flusso in una pellicola adesiva trasparente spessa 40 micron, spruzzare l'adesivo a fissaggio rapido sul lato non adesivo della pellicola e lasciare asciugare l'adesivo. Per iniziare l'assemblaggio della camera di flusso, ottenere un vetrino in quarzo fuso funzionalizzato PEG con biotina PEG di tre millimetri di spessore con fori di ingresso e uscita. Applicare il lato rivestito di adesivo spray della pellicola per controsoffitti sul lato funzionalizzato della guida allineando il canale con i ganci di ingresso e uscita.

Scaldare il vetrino a 80 gradi Celsius su una piastra calda per un minuto. Premere la pellicola sul vetrino per 30 secondi utilizzando un vetrino da microscopio aggiuntivo per distribuire uniformemente la pressione. E poi lasciare raffreddare il gruppo per un minuto.

Staccare il foglio protettivo che copre l'adesivo. Posizionare un vetrino coprioggetti sull'adesivo esposto per formare la camera di flusso. Riscaldare la camera a 80 gradi Celsius per un minuto.

Premere il vetrino coprioggetto sull'adesivo per 30 secondi per sigillare la camera e lasciare raffreddare la camera assemblata. Applicare una goccia di glicerolo sulla faccia del prisma prima di posizionare la camera di flusso sopra il prisma. Montare la camera di flusso in un supporto per un microscopio TIRF a prisma multicolore.

Al termine, collegare i tubi di ingresso e di uscita. Per iniziare a configurare lo strumento per la misurazione a tre colori, aprire il software della telecamera CCD a moltiplicazione di elettroni, impostare il sensore EMCCD alla temperatura più bassa possibile. Impostare la velocità di spostamento verticale della fotocamera su 3,3 microsecondi, scegliere la normale tensione di clock verticale, impostare la velocità di lettura orizzontale su 17 Millihertz a 16 bit, il guadagno di pre-amplificazione su tre e il livello di guadagno del moltiplicatore di elettroni su 1000.

Scegli l'attivazione dell'acquisizione esterna. Impostare il tempo di esposizione su 70 millisecondi. E la durata della registrazione del filmato a 750 cicli di acquisizione.

Creare una nuova cartella per i file di misurazione. Abilita il salvataggio automatico nel software EMCCD e imposta il formato del file del fotogramma del filmato su TIFF. Impostare il percorso del file di salvataggio automatico nella cartella appena creata.

Quindi aprire il software che controlla il filtro sintonizzabile acusto-ottico, il software di controllo laser e il software di trigger che sincronizza i laser, l'AOTF, gli otturatori ottici e le telecamere. Utilizzare l'AOTF per regolare la potenza del laser a circa tre milliwatt prima di entrare nel prisma. Caricare il modello di trigger che sincronizza tutti i dispositivi per l'eccitazione laser alternata, quindi montare il supporto del campione nello strumento.

Posizionare l'estremità del tubo di ingresso in una provetta da microcentrifuga contenente il tampone dell'esperimento. Collegare il tubo di uscita a una pompa a siringa impostata per la modalità di prelievo. Lavare la camera con 150 microlitri di tampone.

Focalizzare la telecamera CCD sull'interfaccia funzionalizzata, allineare i fasci di eccitazione e sbiancare i contaminanti fluorescenti. Quindi far fluire 300 microlitri di una soluzione da 0,25 milligrammi per millilitro di avidina deglicosilata e tampone nella camera e incubare per un minuto. Eliminare l'avidina deglicosilata non legata dalla camera con il tampone.

Quindi far scorrere 300 microlitri di tampone con una concentrazione di BSA di 0,5 milligrammi per millilitro attraverso la camera per bloccare i difetti di funzionalizzazione della superficie. Quindi, caricare la camera di flusso con porzioni da 150 microlitri di Hsp90 biotinilato marcato in fluorescenza in BSA contenente tampone a concentrazioni crescenti di Hsp90 fino a raggiungere una densità superficiale sufficiente. Lavare le proteine non legate dalla camera con 300 microlitri di tampone contenente BSA.

Caricare 150 microlitri di una soluzione a 25 nanomolari di tampone marcato AMP-PMP e BSA contenente nella camera e incubare per cinque minuti. Ripetere il caricamento e l'incubazione una volta. Quindi utilizzare un piezoelettrico passo-passo per spostare la camera del campione perpendicolarmente al fascio di eccitazione per modificare il campo visivo come desiderato.

Se necessario, regolare la messa a fuoco dell'immagine. Avviare le registrazioni della telecamera nel software della telecamera facendo clic sul pulsante Prendi segnale come mostrato. Avviare i cicli di acquisizione dell'eccitazione nel software di attivazione per iniziare l'acquisizione dei dati.

Per iniziare l'analisi dei dati, aprire il software di analisi e importare i filmati registrati delle due fotocamere. Fare clic su Trova tracce per determinare le tracce di intensità di fluorescenza corrispondenti a potenziali singole molecole. Per ogni molecola, calcola la somma di tutte le tracce di quella macchia con lo stesso colore di eccitazione.

Valutare i profili di intensità in tutti i canali per ottenere un plateau approssimativamente piatto nell'intensità grezza del giunto e un singolo passaggio di sbiancamento per tutti i colori di eccitazione. Cercare il comportamento anti-correlato nei canali di rilevamento appropriati e la presenza di fluorescenza rossa nella traccia. Se tutti i criteri sono soddisfatti, conservare le tracce di fluorescenza per ulteriori analisi.

Solo la molecola indicata soddisfa i criteri in questo esempio. Escludere le tracce che non presentano plateau piatti, che mostrano eventi di lampeggiamento piuttosto che anti correlazione o che hanno più fasi di sbiancamento. La selezione delle tracce è un passaggio critico in tutte le tecniche a singola molecola.

Devono essere selezionate solo le tracce che soddisfano criteri ben definiti. Qui questi criteri sono l'anti correlazione, le singole fasi di sbiancamento e i plateau piatti. Quindi, visualizza le molecole salvate una dopo l'altra e una serie di tracce di intensità seleziona un intervallo di tempo in cui tutti i quattro piani sono già sbiancati.

Calcolare l'intensità del fondo del fascio per questo intervallo di tempo, quindi selezionare l'intervallo di efficienza FRET in cui sono presenti entrambi i coloranti su Hsp90, assicurandosi di escludere tracce con eventi lampeggianti. Calcola le tracce parziali di fluorescenza. Escludere le molecole con un basso rapporto segnale/rumore nelle tracce.

Successivamente, generare proiezioni 2D di binding dei dati di fluorescenza parziale e avviare lo strumento di calcolo della popolazione relativa. Fare clic su Init. Disegna un poligono attorno al picco di interesse.

E fai clic su conteggio per calcolare la popolazione relativa per quel picco. Genera un istogramma 3D dei dati di fluorescenza parziale e normalizza l'istogramma. Eccedere i parametri iniziali per un adattamento gaussiano 3D e aggiungere le popolazioni di stato alla fine del vettore di parametri.

Adatta i dati e visualizza i risultati. Dopo aver definito la posizione e la larghezza di ogni stato nello spazio fluorescente parziale 3D, inizializzare l'interfaccia del modello di Markov nascosto. Selezionare il numero appropriato di stati, il numero di dimensioni del segnale di ingresso e il tipo di ingresso.

Ottimizzare i parametri HMM per determinare gli stimatori di massima verosimiglianza per le probabilità di transizione. Ripetere la selezione della popolazione, l'adattamento e l'ottimizzazione HMM per i sottoinsiemi di dati. Infine, calcola l'intervallo di confidenza per le probabilità di transizione e comprimi gli stati conformazionali per semplificare i dati per ulteriori analisi.

Gli stati conformazionali della proteina Hsp90 sono stati studiati con FRET a tre molecole a colori in presenza del nucleotide reporter marcato AMP-PMP. Cinque stati conformazionali erano distinguibili per intensità di fluorescenza, quattro dei quali erano funzionalmente distinti. Il FRET a tre colori a singola molecola ha prodotto i dati di fluorescenza parziale che coprono uno spazio 3D.

Le proiezioni 2D sono state utilizzate per aiutare a separare gli stati poiché tutti gli stati teoricamente attesi nelle condizioni dell'esperimento sono distinguibili dalla loro parziale fioritura nelle proiezioni 2D. Le popolazioni relative di questi stati sono state determinate dalle proiezioni 2D e sono state utilizzate come vincoli per gli adattamenti gaussiani 3D. La successiva ottimizzazione e modellazione dell'HMM 3D dell'ensemble ha fornito le probabilità di transizione di stato estratte.

Gli intervalli di confidenza sono stati calcolati per ogni costante di velocità estratta. La ripetizione degli esperimenti in presenza di ulteriori 250 micromolari di AMP-PMP non marcati ha chiarito l'influenza del legame di un nucleotide sul secondo sito di legame nel dimero Hsp90. Il collasso delle conformazioni legate e non legate ha permesso il calcolo del tempo medio di permanenza per la dissociazione fluorescente di AMP-PMP da Hsp90 in presenza e assenza di ulteriore AMP-PMP non marcato.

Dopo aver visto questo video dovresti avere una buona comprensione di come estrarre informazioni cinetiche da un sistema proteico dinamico utilizzando FRET multicolore e un microscopio TIRF. Questa tecnica apre la strada ai ricercatori nelle scienze della vita per determinare le interazioni correlate nei sistemi multiproteici. Ciò è importante per una comprensione più profonda dei meccanismi normativi fondamentali come la cooperatività.