Combinando le analisi quantitativa l'ingestione di cibo e forzatamente attivazione di neuroni per studiare l'appetito in Drosophila
24 aprile 2018
Analisi quantitativa di assunzione di cibo con cibo tinto forniscono un robusto e ad alta velocità significa valutare motivazione d'alimentazione. Combinando l'analisi del consumo di cibo con termogenetica e schermi optogenetica è un approccio potente per studiare i circuiti neurali sottostanti l'appetito in adulto Drosophila melanogaster.
L'obiettivo generale di questa procedura è quello di misurare quantitativamente l'assunzione di cibo di Drosophila adulta, che fornisce un mezzo per valutare gli effetti di manipolazioni genetiche come le attivazioni termogenetiche e optogenetiche dei neuroni. Queste misure possono aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'alimentazione, come la neuromeccanica della fame, della sazietà e dell'appetito. Il vantaggio principale di questa tecnica è che quantifica simultaneamente l'assunzione di cibo di più gruppi di mosche, rendendola particolarmente utile per identificare le mosche che si nutrono in modo anomalo negli screening genetici.
Per iniziare, raccogli le provviste per preparare il contenitore esterno. Sospendere 0,5 grammi di agarosio e 50 millilitri di acqua bidistillata. Scaldare agitando frequentemente e far bollire per sciogliere completamente su un agitatore magnetico con una piastra riscaldante.
Quando l'1% di agarosio si raffredda a circa 60 gradi Celsius, trasferisci cinque millilitri in un contenitore esterno vuoto e tieni il contenitore aperto fino a quando l'agarosio non si è raffreddato a temperatura ambiente per produrre un tampone di agarosio. Successivamente, aggiungere 0,5 grammi di agarosio a 50 millilitri di acqua bidistillata. Scaldare agitando frequentemente e far bollire per sciogliere completamente su un agitatore magnetico con piastra riscaldante.
Quando l'agarosio all'1% si raffredda a circa 60 gradi Celsius, aggiungi 1,71 grammi di saccarosio all'agarosio per ottenere 100 millimoli di saccarosio. Aggiungere 0,25 grammi di colorante blu alla soluzione di agarosio per ottenere lo 0,5% in peso per volume di alimenti colorati etichettati. Quindi preparare il contenitore interno.
Mettere i contenitori interni vuoti su una superficie piana orizzontale. Quindi aggiungere 750 microlitri di cibo etichettato con colorante blu ai singoli contenitori per alimenti. Lasciate solidificare per almeno cinque minuti.
Trasferire un contenitore interno pieno in un contenitore esterno preparato e posizionarlo al centro del tampone di agarosio. Preparare le camere di alimentazione con cibo privo di coloranti per la sottrazione dello sfondo. Lasciare le camere di alimentazione aperte a temperatura ambiente per 40 minuti, fino a quando la parete del contenitore esterno non è priva di condensa.
Prima degli esperimenti comportamentali, equilibrare le camere di alimentazione preparate alla temperatura sperimentale di 30 gradi Celsius per due ore per garantire che la temperatura sia relativamente uniforme nelle camere di alimentazione. Per iniziare il processo di alimentazione, trasferire con cura 20 mosche dalla fiala di casa in una camera di alimentazione preriscaldata picchiettando delicatamente. Continuare il processo di alimentazione a 30 gradi Celsius per 60 minuti.
Interrompere l'alimentazione congelando le camere di alimentazione a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius per 30 minuti. Trasferire con cura 20 mosche da una fiala in una camera di alimentazione picchiettando delicatamente. E poi posizionare la camera lateralmente sulla configurazione dell'illuminazione.
Per la manipolazione optogenetica, utilizzare una serie di LED arancioni come fonte di stimolazione luminosa e fissare una piastra orizzontale in plexiglass sopra i LED per sostenere le camere di alimentazione durante l'illuminazione. Conservare l'impianto in un'incubatrice a 25 gradi Celsius con il 60% di umidità. Stimolare il controllo genetico delle mosche in parallelo con le mosche Taotie-GAL4 UAS CsChrimson, ma in diverse camere di alimentazione.
Continuare il processo di alimentazione per 60 minuti con la retroilluminazione della luce arancione. Quindi congelare le camere di alimentazione a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius per 30 minuti. Dopo aver cessato l'alimentazione, versare tutte le 20 mosche dalla camera di alimentazione su un pezzo di carta per pesare.
Quindi trasferirli in un tubo da 1,5 millilitri utilizzando un pennello morbido. Aggiungere 500 microlitri di PBST al tubo e omogeneizzare le mosche utilizzando un mulino di macinazione a 60 hertz per cinque secondi. Quindi confermare un'omogeneizzazione sufficiente mediante osservazione quando non ci sono frammenti rilevabili di parti del corpo.
Centrifugare le provette con omogeneizzati per 30 minuti a 1300 giri/min per rimuovere i detriti. Dopo la centrifugazione, trasferire 100 microlitri di surnatante in un pozzetto di piastra da 96 pozzetti. Per evitare l'errore di calcolo degli assorbenti causato dai detriti, estrarre delicatamente il tubo utilizzato dalla centrifuga e far cadere con cautela il surnatante senza disturbare il pallet.
Dopo che tutti i campioni sono stati caricati, posizionare la piastra in un lettore di piastre per misurare gli assorbenti dei campioni a 630 nanometri. La risposta alimentare è stata quantificata ispezionando visivamente e valutando i moscerini con colorante rilevabile nell'intestino. Dopo l'attivazione dei neuroni di Taotie, circa il 58% dei moscerini di Taotie dTRPA1 ha mostrato forti comportamenti alimentari.
E il 23% di questi ha mostrato comportamenti alimentari lievi. I neuroni Taotie-GAL4 attivati acutamente da TRPA1 hanno aumentato notevolmente l'assunzione di cibo, suggerendo che i neuroni marcati con Taotie-GAL4 partecipano alla regolazione dell'assunzione di cibo di Drosophila adulta. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come quantificare la quantità di cibo assunto dopo aver manipolato l'attività dei neuroni per studiare i meccanismi neurologici del controllo dell'alimentazione nella Drosophila melanogaster adulta.
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Panoramica
In questo articolo viene descritto un saggio quantitativo dell'assunzione alimentare mediante l'utilizzo di cibo colorato per valutare la motivazione alimentare in Drosophila melanogaster adulti. Il metodo consente un'analisi ad alto rendimento ed è combinabile con schermate termogenetiche e optogenetiche per esplorare i circuiti neurali coinvolti nella regolazione dell'appetito.
Componenti Chiave dello Studio
Settore Scientifico
- Neuroscienze
- Biologia del Comportamento
- Genetica
Sfondo
- Comprendere il comportamento alimentare è fondamentale per ottenere informazioni sulla regolazione dell'appetito.
- Le manipolazioni genetiche possono influenzare la motivazione alimentare e la sazietà.
- Sono necessari metodi ad alto rendimento per analizzare contemporaneamente più soggetti.
- Drosophila melanogaster si rivela un organismo modello per lo studio di questi meccanismi.
Scopo dello studio
- Misurare quantitativamente l'assunzione di cibo in Drosophila adulte.
- Valutare gli effetti delle manipolazioni genetiche sul comportamento alimentare.
- Studiare la neuro-meccanica della fame e dell'appetito.
Metodi Utilizzati
- Preparazione del cibo a base di agarosio per il saggio.
- Utilizzo di cibo colorato per tracciare il consumo.
- Applicazione di tecniche termogenetiche e optogenetiche.
- Misurazione simultanea dell'assunzione di cibo in più gruppi di moscerini.
Risultati principali
- Il saggio quantifica efficacemente l'assunzione di cibo in diversi background genetici.
- Identifica moscerini con schemi alimentari anomali in schermate genetiche.
- Fornisce informazioni sui circuiti neurali che regolano l'appetito.
- Dimostra l'affidabilità del metodo per analisi ad alto rendimento.
Conclusioni
- L'assaggio dell'assunzione di cibo è uno strumento prezioso per lo studio del comportamento alimentare.
- La combinazione di questo metodo con manipolazioni genetiche migliora la comprensione della regolazione dell'appetito.
- Studi futuri potranno sfruttare questo approccio per esplorare comportamenti alimentari complessi.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Saggi quantitativi sull'assunzione di cibo combinati con l'attivazione neuronale in Drosophila permettono un'analisi precisa dei circuiti neurali che regolano l'appetito e il comportamento alimentare. Questo approccio supporta la validazione precoce di bersagli e la riduzione dei rischi meccanicistici per vie neurobiologiche implicate in disturbi metabolici e dell'appetito. La scalabilità del metodo e i suoi risultati quantitativi lo posizionano come una piattaforma solida per schermate genetiche ad alto rendimento e analisi funzionale delle vie nei percorsi di scoperta.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Consente la validazione funzionale di bersagli neurali che influenzano la motivazione alimentare e la sazietà.
- Supporta la riduzione del rischio meccanicistico collegando l'attivazione neuronale a output comportamentali quantificabili.
- Facilita il triage di vie candidate per ulteriori indagini in modelli di malattie metaboliche.
Sviluppo di screening e saggi
- Fornisce un saggio standardizzato e quantitativo per valutare perturbazioni genetiche e farmacologiche.
- Consente una misurazione riproducibile e ad alto rendimento dell'assunzione di cibo in diversi gruppi sperimentali.
- Permette l'identificazione affidabile di fenotipi alimentari anomali in schermate genetiche.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Si allinea a meccanismi rilevanti per la malattia modellando la regolazione dell'appetito in un sistema accessibile.
- Permette una continuità dalla scoperta alla validazione preclinica di bersagli neurobiologici.
- Offre un valore predittivo per studi successivi in modelli più complessi dei disturbi alimentari.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo metodo si integra nel percorso di scoperta, dall'analisi iniziale delle ipotesi fino all'identificazione dei composti promettenti e alla selezione dei modelli preclinici.
- Biologia della scoperta: La misurazione quantitativa dell'assunzione di cibo consente un'analisi basata su ipotesi dei circuiti neurali.
- Screening: La standardizzazione e la scalabilità del saggio supportano flussi di lavoro robusti per screening genetici e farmacologici.
- Analisi: La quantificazione basata sull'assorbanza fornisce letture oggettive e confrontabili per l'analisi comparativa tra diverse condizioni.
- Ricerca traslazionale: I risultati funzionali informano l'allineamento dei biomarcatori e la continuità traslazionale per bersagli legati all'appetito.
- Riutilizzo aziendale: La piattaforma del saggio è adattabile a diverse manipolazioni genetiche e campagne di screening.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione degli obiettivi neurali e riduce l'ambiguità meccanicistica.
- Valore operativo: Fornisce risultati di saggio standardizzati, riproducibili e scalabili per l'uso condiviso tra diversi gruppi di lavoro.
- Valore strategico: Migliora il processo decisionale di avanzamento o interruzione dei progetti e l'efficienza nell'uso del capitale, consentendo una riduzione precoce dei rischi associati alle ipotesi biologiche.
- Impatto sul portafoglio: Favorisce la priorizzazione e la progressione mirate a ridurre i rischi degli obiettivi neurobiologici nei percorsi di sviluppo per le malattie metaboliche.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche in genetica di Drosophila e tecniche di manipolazione neurogenetica.
- Necessita dell'accesso a lettori di piastre, sistemi di stimolazione controllati per temperatura e luce, e infrastrutture di base per la biologia molecolare.
- Richiede una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro riguardo alle condizioni del saggio e ai protocolli di analisi dei dati.
- È adattabile a diversi background genetici e a diversi bersagli neuronali all'interno del modello Drosophila.
- I limiti includono i vincoli associati all'organismo modello e la necessità di una corretta sottrazione del background nelle misurazioni di assorbanza.
