Name: Combinando le analisi quantitativa lingestione di cibo e forzatamente attivazione di neuroni per studiare lappetito in Drosophila (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-24T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 24 s
Description: Scopri come misurare quantitativamente l'ingestione di cibo in Drosophila melanogaster adulte usando cibo colorato e tecniche termogenetiche. Questo metodo ad alto rendimento permette di analizzare i circuiti neurali che regolano l'appetito.

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Questo lavoro è stato supportato in parte dalla base nazionale ricerca programma della Cina (2012CB825504), National Natural Science Foundation of China (91232720 e 9163210042), Accademia cinese delle scienze (CAS) (GJHZ201302 e QYZDY-SSW-SMC015), Bill e Melinda Gates Programma Foundation (OPP1119434) e 100-talenti di CAS a Y. Zhu.

1. preparare la camera di alimentazione
Nota: La camera di alimentazione per analisi d'etichettatura della tintura d'alimentazione è costituito da due parti: il contenitore esterno (come copertura) e l'interno contenitore (come fonte di cibo).
<ol><li>Modificare il contenitore esterno da un flaconcino di vetro per la coltura della drosofila con (un diametro interno di 31,8 mm) e un'altezza di 80 mm (Figura 1A, 1C). Coprire il fondo del contenitore con uno strato di agarosio all'1% (5 mL) per mantenere l'alimentazione installazione correttamente umidificato e servire come un substrato morbido per le mosche a piedi al momento (Figura 1B). Il contenitore fornisce quindi un ambiente controllato ma naturalistico che trasportano con minimo sforzo o disturbo per le mosche.<ol>
<li>Preparare il contenitore esterno. Sospendere 0,5 g di agarosio in 50 mL di acqua distillata doppia, calore con agitazione frequente e far bollire per sciogliere completamente su un agitatore magnetico con una piastra di calore.</li>
		<li>Quando la si raffredda agarosio 1% a circa 60 ° C, trasferire 5 mL di agarosio all'1% a vuoto all'esterno del contenitore (Figura 1B) e lasciare che il contenitore rimangono aperti fino al raffreddamento a temperatura ambiente per produrre un pad di agarosio.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparare il cibo tingere-contrassegnati. Composizione del cibo tingere-contrassegnati varia secondo gli scopi sperimentali differenti. Ecco un esempio di preparazione del cibo tingere-contrassegnati contenente solo saccarosio.<ol>
<li>Aggiungere 0,5 g di agarosio a 50 mL di acqua distillata doppia, calore con agitazione frequente e far bollire per sciogliere completamente su un agitatore magnetico con una piastra di calore.</li>
		<li>Quando l'agarosio 1% sopra si raffredda a circa 60 ° C, aggiungere 1,71 g di saccarosio per l'agarosio per ottenere saccarosio di 100 mM.</li>
		<li>Aggiungere 0,25 g di colorante blu (erioglaucine disodico) per la soluzione di agarosio per procurarsi il cibo di tingere-contrassegnati di 0,5% (p/v).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparare l'interno contenitore. Mettere il vuoto all'interno di contenitori su una superficie piana orizzontale, poi aggiungere 750 µ l di blu cibo tingere-contrassegnati da contenitore per alimenti singoli, lasciarlo solidificare per almeno 5 min. Nota: All'interno contenitore è un piccolo piatto di plastica con un diametro interno di 13,6 mm e un'altezza di 7,5 mm (Figura 1A, 1C). Esso è riempito con cibo tingere-contrassegnati e quindi è posizionato al centro del riquadro dell'agarosi del contenitore esterno.</li>
	<li>Trasferimento debitamente compilata all'interno del contenitore in un contenitore esterno preparato e posizionarlo al centro del riquadro dell'agarosi. Lasciate che gli alloggiamenti di alimentazione rimangono aperti a temperatura ambiente per 40 minuti fino a quando la parete del contenitore esterno è libera di condensa. Nota: Muro a secco è necessario impedire che le mosche essere bloccato sulla parete contattando gocce d'acqua.</li>
	<li>Preparare alloggiamenti d'alimentazione con alimenti privi di tintura (stessa composizione ma senza colorante) per la sottrazione di sfondo.</li>
</ol>2. preparazione di mosche
Nota: Femmina adulta Vola 5 a 10 giorno dopo eclosion sono normalmente utilizzati per l'alimentazione dei saggi. Si consiglia di preparare mosche di genotipi differenti, inclusi i controlli genetici e di testare in parallelo. 20 mosche (da una camera di alimentazione) generano un punto di dati.
<ol><li>Prendere in considerazione la densità di popolazione per l'allevamento di mosche adulte. In genere, è possibile controllare la densità di popolazione variando il numero di mosche parentale secondo i ceppi e le dimensioni dei flaconi per coltura. Ad esempio, trasferire 15 maschi e 30 femmine di Cantone-S per una bottiglia di cultura con (un diametro di 31,8 mm) e un'altezza di 80 mm e lasciare che le femmine per deporre le uova per rimuovere che l'adulto Vola poi un giorno.</li>
	<li>Preparare mosche per attivazione termogenetica.<ol>
<li>Utilizzare il sistema Gal4/UAS38 per esprimere dTRPA133 in vari neuroni incrociando che UAS-dTrpA1 Vola con diverse linee di driver GAL4 (Figura 2B).</li>
		<li>Mantenere le mosche adulte il cibo standard a 22 ° C, umidità relativa di 60% e un ciclo luce-buio di 12 h/12 h.</li>
		<li>Due giorni prima l'alimentazione dosaggio, ordinare e raccogliere mosche su una rampa di volare2 CO sotto un microscopio stereo in un flacone di cibo fresco e mantenere una densità di 20 mosche per flaconcino.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparare mosche per attivazione optogenetica.<ol>
<li>Utilizzare il sistema Gal4/UAS38 per esprimere CsChrimson36 a diversi neuroni da attraversamento UAS-CsChrimson mosche con diverse linee di driver GAL4.</li>
		<li>Raccogliere appena mosche obtecta (entro 24h) e trasferirli in un flacone con cibo standard contenente 400 µM all-trans-retinale.</li>
		<li>Per evitare l'attivazione prematura, avvolgere le fiale allevamento con carta stagnola e poi metterli in una scatola scuro per proteggere mosche da stimolazione luminosa indesiderata. Tenere lontane le mosche a 25 ° C, umidità 60% al buio per 4-6 giorni.</li>
		<li>Due giorni prima del test d'alimentazione, donna sorta Vola sul CO2 Vola tappetino sotto un microscopio stereo. Raccogliere 20 mosche nel flaconcino di un alimento e tenerli al buio prima della prova di alimentazione.</li>
		<li>Svolgere tutte le operazioni sotto la luce fioca più rapidamente possibile per evitare gli effetti causati dalla luce ambientale. Utilizzare una lampada a LED posizionata lontano dall'area di lavoro, l'intensità alla zona di lavoro è 5 µW/cm2. Nota: Uso di fame Cantone-S Vola come un controllo positivo per il dosaggio di alimentazione. Privare queste mosche di cibo e mantenere su agarosio all'1% per 24 h prima della prova di alimentazione. I livelli di consumo alimentare di queste mosche aiutano a valutare le fluttuazioni quotidiane.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. termogenetica attivazione
<ol><li>Effettuare tutte le prove di alimentazione allo stesso tempo del giorno, nei dintorni di Zeitgeber tempo 4-631,32, per minimizzare le variazioni a causa di ritmi circadiani.</li>
	<li>Preparare un incubatore (o una piccola stanza con un riscaldatore termostatato) come ambiente di riscaldamento.</li>
	<li>Prima di esperimenti comportamentali, equilibrare gli alloggiamenti di alimentazione preparati alla temperatura sperimentale (30 ° C) per 2 h garantire che la temperatura è uniforme relativa nella camera di alimentazione.</li>
	<li>Per avviare il processo di alimentazione, attentamente trasferimento 20 mosche da loro casa flaconcino in una camera di alimentazione preriscaldata in picchiettando. Continuare il processo di alimentazione a 30 ° C per 60 min ( Figura 3A) . Nota: Frequenti agitazioni, come aprire e chiudere lo sportello dell'incubatore, influenzare negativamente il comportamento alimentare, così dovrebbero essere minimizzate.</li>
	<li>Cessare di alimentazione a 60 min congelando gli alloggiamenti d'alimentazione a-80 ° C (o -20 ° C) per 30 min. Nota: Congelamento aiuta a fermare le poppate in tutte le camere contemporaneamente. Mosche a-80 ° C di congelamento serve a due scopi, per eutanasia le mosche e archiviazione fino alla omogeneizzazione fino ad una settimana.</li>
	<li>Per il gruppo di controllo di temperatura, è necessario trasferire 20 mosche in una temperatura ambiente alimentazione camera con cibo colorante color per avviare il processo di alimentazione a 22 ° C per 60 min.</li>
	<li>Cessare l'alimentazione del gruppo di controllo di temperatura di congelamento gli alloggiamenti a-80 ° C (o -20 ° C) per 30 min.</li>
</ol>4. optogenetica attivazione
<ol><li>Effettuare tutte le prove di alimentazione allo stesso tempo del giorno, nei dintorni di Zeitgeber tempo 4-631,32, per minimizzare le variazioni a causa di ritmi circadiani.</li>
	<li>Trasferire con cautela 20 mosche da un flaconcino in una camera di alimentazione da picchiettando e poi mettere la camera lateralmente sull'installazione di illuminazione (Figura 4A, 4B).<ol>
<li>Per la manipolazione di optogenetica, utilizzare una matrice di LED arancione (607 nm) come la fonte di stimolazione luminosa e fissare una piastra orizzontale plexiglass sopra i LED per supportare l'alimentazione chambers durante l'illuminazione. Mantenere l'installazione in un incubatore a 25 ° C con umidità del 60% (Figura 4A, 4B).</li>
		<li>Stimolare le mosche di controllo genetico in parallelo con il Taotie > CsChrimson Vola, ma in diversi alloggiamenti di alimentazione.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Continuare il processo di alimentazione per 60 min con retroilluminazione di luce arancione.<ol>
<li>Determinare l'intensità di illuminazione ottimale per optogenetica sperimentalmente36. Per la Taotie > CsChrimson mosche, un'intensità di 2,2 mW/mm2 induce paralisi (cessazione della locomozione) e perdita del controllo posturale, pertanto, utilizzare un'intensità intermedia di 0.1 mW/mm2 per stimolare la Taotie > CsChrimson mosche durante la prova di alimentazione.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cessare l'alimentazione mediante congelamento alimentazione chambers a-80 ° C (o -20 ° C) per 30 min.</li>
</ol>5. visual stima del consumo alimentare
Nota: L'approccio di valutazione visivo fornisce una stima semi-quantitativa dei consumi alimentari. Sebbene non sia più obiettivo il metodo ottico, questo metodo consente passando attraverso un gran numero di ceppi di volare in modo tempestivo, che lo rende adatto per il primo round di una schermata genetica per restringere rapidamente l'elenco dei candidati per i successivi test.
<ol><li>Dopo il processo di alimentazione, anestetizzare e segnare le mosche su una CO2 pad volare sotto un microscopio stereo. Dare punteggio individuale per ogni volo basato sul volume e l'intensità del colore della tintura cibo nel suo addome (Figura 2A). Nota: Criteri per la valutazione visiva: il sistema di punteggio ha 4 livelli di assunzione di cibo corrispondente a diversi volumi e intensità di cibo colorato nell'addome.<ol>
<li>Punteggio ottenuto Vola senza cibo colorante color rilevabile un punteggio pari a 0; quelli con debole colorante blu (a mala pena rilevabile) o con cibo colorante color che occupa meno di un terzo del volume dell'addome e dare un punteggio di 1.</li>
		<li>Punteggio ottenuto Vola con cibo di tintura di colore intenso che occupa metà dell'addome un punteggio pari a 2.</li>
		<li>Quelli con intenso tinto contenuto che occupa metà dell'addome superiore Punteggio ottenuto un punteggio pari a 3 (Figura 2A).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Calcolare la proporzione di mosche con punteggi diversi in ogni condizione sperimentale (Figura 2B).</li>
</ol>6. colorimetrico quantificazione del consumo alimentare
<ol><li>Dopo sospensione dell'alimentazione, versare 20 tutte le mosche da un'alimentazione dell'alloggiamento su un pezzo di carta di pesatura e quindi trasferirli in una provetta da 1,5 mL utilizzando una spazzola morbida. Nota: Non prenda tutti gli alloggiamenti fuori di-80 ° C stoccaggio allo stesso tempo per evitare mosche attaccarsi alla parete della camera a causa di condensa di acqua sulla camera fredda.</li>
	<li>Aggiungere 500 µ l di PBST al tubo e omogeneizzare le mosche usando un mulino di macinazione a 60 Hz per 5 s.<ol>
<li>Confermare sufficiente omogeneizzazione di osservazione quando non ci sono nessun rilevabili frammenti di parti del corpo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Girare i tubi con omogeneati per 30 min a 13.000 giri/min per eliminare i detriti.</li>
	<li>Dopo la centrifugazione, trasferire 100 µ l del surnatante in un pozzetto di una piastra a 96 pozzetti.</li>
	<li>Dopo tutti i campioni vengono caricati, mettere la piastra in un lettore di piastra per misurare l'assorbanza dei campioni a 630 nm.</li>
	<li>Per rimuovere l'assorbanza di fondo, sottrarre l'assorbanza dei surnatanti dalle mosche sul cibo senza tintura si autoalimenta con l'assorbanza del surnatante dalle mosche blu cibo-federazione. Nota: Questo passaggio è facoltativo, a seconda delle composizioni del cibo utilizzato. Quando un alimento (senza tintura) genera assorbanza a 630 nm, è necessario eseguire questo passaggio per eliminare lo sfondo.</li>
</ol>

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Gli autori non dichiarano concorrenti interessi finanziari.

Questo rapporto si concentra sul processo tecnico di saggi d'alimentazione colorante-etichettatura del consumo alimentare nel contesto di termogenetica e optogenetica attivazione per manipolare i neuroni di controllo alimentazione. Questo protocollo semplice e affidabile vi aiuterà a chiarire la funzione dei neuroni del candidato nel controllo, per misurare la preferenza dell'alimento di mosche e per identificare nuovi giocatori nei circuiti di controllo alimentazione tramite schermi genetici basati su alimentazione<sup ...

Quantificare la quantità di cibo ingerito è importante per valutare gli aspetti multipli di alimentazione comandi dal cervello in risposta alle esigenze interne (ad esempio Stati di fame) e fattori esterni (ad esempio, cibo di qualità e appetibilità)1, 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9. negli ultimi anni, gli sforzi di decifrare i substrati neurali di controllo dell'alimentazione in Drosophila conducono allo sviluppo di saggi multipli per quantificare la quantità di cibo ingerito o servire come un indicatore di alimentazione motivazione direttamente 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16.
Il capillare dell'alimentatore (CAFE) dosaggio12,13 è stato sviluppato per misurare la quantità di consumo di liquidi alimentari in un microcapillary di vetro. Il dosaggio CAFE è altamente sensibile e riproducibile17 e semplifica la misurazione del consumo di cibo, soprattutto per la quantificazione di alimentazione a lungo termine18. Tuttavia, questo test richiede le mosche a salire fino alla punta della microcapillary e nutrire la testa in giù, che non è adatto per tutti i ceppi. Inoltre, perché le mosche da testare usando l'analisi CAFE hanno ad essere allevato su alimenti liquidi, l'effetto di queste condizioni il metabolismo status o la malnutrizione potenziale di allevamento rimane per essere determinata.
La risposta di estensione di proboscide (PER) dosaggio11,14 conta la frequenza delle risposte di estensione proboscide verso garbati tocchi di gocce di cibo. PER test che si è rivelato come un ottimo modo per valutare l'alimentazione motivazione della Mosca individuo e asini l'influenza dell'appetibilità e contenuto di cibo18,19. Tuttavia, non si tratta di una quantificazione diretta della quantità di assunzione.
Recentemente, è stato sviluppato un metodo semi-automatico, il saggio (MAFE)15, di alimentazione manuale. In MAFE, una singola Mosca immobilizzata è alimentata manualmente con un microcapillary contenenti alimenti. Dato che le risposte di estensione di proboscide e consumo alimentare possono essere controllati simultaneamente, MAFE è adatto per valutare i valori nutrizionali e gli effetti di manipolazione farmacologica. Tuttavia, immobilizzando una Mosca potrebbe compromettere le prestazioni comportamentali, compresa l'alimentazione.
Inoltre, volare proboscide e Activity Detector (FlyPAD)10 è stato sviluppato per quantificare automaticamente il comportamento alimentare. Utilizzando metodi di visione della macchina, FlyPAD registra interazioni fisiche tra un volo e cibo per quantificare la frequenza e la durata delle estensioni di proboscide come un indicatore di alimentazione motivazione. FlyPAD fornisce un approccio di alto-rendimento per monitorare i comportamenti d'alimentazione di una Mosca liberi di muoversi, anche se la sensibilità e la robustezza di questo sistema rimane per essere ulteriormente confermata da più studi12.
Strategie d'etichettatura sono frequentemente utilizzate per stimare l'ingestione di cibo in mosche. È comune per etichettare il cibo con traccianti chimici e, dopo la poppata, misurare la quantità di tracciante ingerito per calcolare la quantità di assunzione di cibo. Traccianti radioattivi16,17,20,21,22,23,24,25 consentono la rilevazione attraverso la cuticola senza omogeneizzazione delle mosche. Questo metodo fornisce notevolmente bassa variabilità e alta sensibilità18ed è fattibile per studio a lungo termine dell'ingestione di cibo. Tuttavia, la disponibilità di radioisotopi utilizzabile e diversi tassi di assorbimento ed escrezione devono tener conto quando si lavora con questo test.
Etichettatura e rintracciabilità assunzione di cibo con colori atossici alimentari è un più sicuro e semplice alternativa2,3,26,27,28. Mosche sono omogeneizzati dopo l'alimentazione con alimenti contenenti coloranti solubili e non assorbibili, e la quantità del colorante ingerito più tardi è quantificata utilizzando un spettrofotometro3,24,28,29 . La strategia di etichettatura è facile da eseguire e fornisce alta efficienza, ma con un avvertimento. Il volume dell'ingestione di cibo stimato da tintura ingerita è più piccolo di volume effettivo perché escrezione inizia già a 15 min dopo mosche avviare l'alimentazione17. Inoltre, il test valuta l'ingestione di cibo in genere entro un periodo di 60 minuti, che è adatto solo per indagine di alimentazione a breve termine comportamento24,28. Inoltre, molteplici fattori interni ed esterni, come genotipo17, genere17, accoppiato stato17, allevamento densità30, ritmo circadiano31,32e cibo di qualità3 , 8 , 16, influenza l'ingestione di cibo. Pertanto, la durata di alimentazione potrebbe essere necessario essere regolata in base alle specifiche condizioni sperimentali. Oltre a facilitare la quantificazione dell'ingestione di cibo, coloranti alimentari sono utilizzati anche per valutare il cibo scelte2,19,27e di visualizzare il menisco in un microcapillary in CAFE dosaggio12.
Qui, presentiamo una protocollo combinato manipolazione dell'attività neuronale con approccio d'etichettatura della tintura. Questa strategia si è dimostrata utile nel nostro studio Neurogenetica il controllo dell'alimentazione in mosche adulte frutta24. Il metodo di giudizio visivo permette per una rapida stima del consumo di cibo; Pertanto, è utile per lo screening attraverso un gran numero di ceppi in modo tempestivo. I candidati dalla schermata vengono poi analizzati in dettaglio utilizzando un metodo colorimetrico per fornire obiettivo e quantificazione precisa in studio aggiuntivo.
Oltre a saggi d'alimentazione, abbiamo inoltre descrivono i termogenetica27,33,34,35 e optogenetica36 metodi del forzatamente attivazione di neuroni bersaglio in drosofila. Per attivare i neuroni da termogenetica operazione è semplice e conveniente con Drosophila Transient Receptor potenziali Ankyrin 1 (dTRPA1), che è un canale cationico temperatura e tensione-gated che aumenta l'eccitabilità neuronale quando l'ambiente temperatura superiore a 23 ° C33,37; Tuttavia, gli esperimenti su animali ad alte temperature potrebbe produrre effetti negativi sul comportamento. Un altro approccio efficace per attivare i neuroni in Drosophila utilizza optogenetica con CsChrimson36, che è una variante rosso-spostato di channelrhodopsin che aumenta l'eccitabilità dei neuroni quando esposto alla luce. Optogenetica offre risoluzione temporale superiore e minore dispersione a comportamenti di thermogenetics. Combinando la misurazione quantitativa dell'ingestione di cibo con la manipolazione dell'attività neuronale rappresenta un efficace approccio per lo studio dei meccanismi neurali di alimentazione.
Descriviamo in dettaglio la preparazione della camera di alimentazione e le mosche da testare. Utilizzando Taotie-Gal4 mosche come un modello24, descriviamo i neuroni d'attivazione di thermogenetics e optogenetica. Due saggi di quantificazione del consumo alimentare con cibo tingere-contrassegnati sono anche descritti nel protocollo.

<table><tbody><tr><td>UAS-CSCchrimson</td><td>Bloomintoon</td><td>55135</td><td></td></tr><tr><td>UAS-dTrpA1</td><td>Bloomintoon</td><td>26263</td><td></td></tr><tr><td>TDC1-GAL4&nbsp;</td><td>Bloomintoon</td><td>9312</td><td></td></tr><tr><td>TDC2-GAL4</td><td>Bloomintoon</td><td>9313</td><td></td></tr><tr><td>sNPF-GAL4</td><td></td><td></td><td>Fornito da Z. Zhao</td></tr><tr><td>NPF-GAL4</td><td></td><td></td><td>Fornito da Y. Rao</td></tr><tr><td>TH-GAL4</td><td></td><td></td><td>Fornito da Y. Rao</td></tr><tr><td>5-HT-GAL4</td><td></td><td></td><td>Fornito da Y. Rao</td></tr><tr><td>AKH-GAL4</td><td></td><td></td><td>Fornito da Y. Rao</td></tr><tr><td>dip2-GAL4</td><td></td><td></td><td>Fornito da Y. Rao</td></tr><tr><td>Taotie-GAL4</td><td></td><td></td><td>Fornito da J. Carlson</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Biowest</td><td>G-10</td><td></td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>Sigma</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>Erioglaucina sale disodico</td><td>Sigma</td><td>861146</td><td></td></tr><tr><td>all-trans-retinal&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>R2500</td><td>conservato al buio</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Amresco</td><td>9002-93-01</td><td></td></tr><tr><td>Cibo</td><td></td> per mosche <td>1 L di cibo contiene: 77,7 g di farina di mais, 32,19 g di lievito, 5 g di agar, 0,726 g di CaCl2, 31,62 g di saccarosio, 63,2 g di glucosio, 2 g di sorbato di potassio, pH &nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; 1x tampone PBS&nbsp;</td><td></td><td>1 L 1X PBS contiene: 8 g di Nacl, 0,2 g di Kcl, 1,44 g di Na2HPO4, 0,24 g di KH2PO4, pH 7,4</td><td></td></tr><tr><td>tampone</td><td></td> PBST <td>1X PBS con 1% di Triton X-100</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Mulino di macinazione</td><td>Shang Hai Jing Xin</td><td>Tissuelyser-24</td><td></td></tr><tr><td>Incubatore</td><td>Ning Bo Jiang Nan</td><td>HWS-80</td><td></td></tr><tr><td>Agitatore magnetico con piastra riscaldante</td><td>Chang Zhou Bo Yuan</td><td>CJJ 78-1</td><td></td></tr><tr><td>Spettrometro</td><td>Thorlabs</td><td>CCS200 / M</td><td></td></tr><tr><td>Spettrofotometro per micropiastre</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>Multiskan GO Tipo: 1510, REF 51119200</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscopio a fluorescenza&nbsp;</td><td>Leica</td><td>&nbsp; M205FA</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscopio</td><td>Leica&nbsp;</td><td>S6E</td><td></td></tr><tr><td>Contenitore esterno</td><td>Jiang Su Hai Men</td><td>fiala di vetro con un diametro di 31,8 mm e un'altezza di 80 mm (dimensione interna)</td><td></td></tr><tr><td>Contenitore interno&nbsp;</td><td>Pechino Yi Ran macchina fabbrica</td><td>piatto di plastica con un diametro di 13,6 mm e un'altezza di 7,5 mm (dimensione interna)</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml Eppendorf tubi</td><td>Hai Men Ning Mong</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; piastra a 96 pozzetti</td><td>Corning Incorporated</td><td>&nbsp; Costar 3599</td><td></td></tr><tr><td>LED</td><td>Xin Xing Yuan Guangdian</td><td>607 nm, 3W&nbsp;</td><td>https://item.taobao.com/item.htm?id=20158878058</td></tr></tbody></table>

combinando le analisi quantitativa l'ingestione di cibo e forzatamente attivazione di neuroni per studiare l'appetito in drosophila

Combining Quantitative Food-intake Assays and Forcibly Activating Neurons to Study Appetite in Drosophila

Consumo alimentare è sotto il controllo stretto del cervello, che integra la condizione fisiologica, appetibilità e contenuto nutrizionale del cibo e problemi di comandi per avviare o interrompere l'alimentazione. Decifrare i processi che sottendono il processo decisionale di tempestiva e moderata alimentazione trasporta importanti implicazioni nella nostra comprensione dei disturbi fisiologici e psicologici legati al controllo dell'alimentazione. Metodi semplici, quantitativi e robusti sono necessari per misurare l'ingestione di cibo di animali dopo manipolazione sperimentale, come ad esempio forzatamente aumentando l'attività di determinati neuroni bersaglio. Qui, abbiamo introdotto analisi alimentazione colorante-etichettatura-based per facilitare lo studio Neurogenetica di controllo dell'alimentazione in adulti mosche della frutta. Esaminiamo saggi di alimentazione disponibile e quindi descrivere i nostri metodi passo-passo dal programma di installazione per l'analisi, che combinano termogenetica e optogenetica manipolazione dei neuroni controllo alimentazione motivazione con dosaggio di assunzione di cibo tingere-contrassegnati. Abbiamo anche discutere i vantaggi e le limitazioni dei nostri metodi, confrontati con altri saggi d'alimentazione, per aiutare i lettori a scegliere un'analisi appropriata.

Schermo termogenetica.
Anormalmente aumentato appetito provoca l'ingestione di cibo con privilegi elevati, indipendentemente dalle esigenze fisiologiche. Abbiamo utilizzato questo schema per progettare un alto-rendimento schermo comportamentale per ottenere maniglie genetiche dei neuroni legate alla fame e sazi stati (Figura 1). Lo schermo ha reso Taotie-Gal424. Quan...

Analisi quantitativa di assunzione di cibo con cibo tinto forniscono un robusto e ad alta velocità significa valutare motivazione d'alimentazione. Combinando l'analisi del consumo di cibo con termogenetica e schermi optogenetica è un approccio potente per studiare i circuiti neurali sottostanti l'appetito in adulto Drosophila melanogaster.

Combinando le analisi quantitativa l'ingestione di cibo e forzatamente attivazione di neuroni per studiare l'appetito in Drosophila

Food consumption is under the tight control of the brain, which integrates the physiological status, palatability, and nutritional contents of the food, ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di misurare quantitativamente l'assunzione di cibo di Drosophila adulta, che fornisce un mezzo per valutare gli effetti di manipolazioni genetiche come le attivazioni termogenetiche e optogenetiche dei neuroni. Queste misure possono aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'alimentazione, come la neuromeccanica della fame, della sazietà e dell'appetito. Il vantaggio principale di questa tecnica è che quantifica simultaneamente l'assunzione di cibo di più gruppi di mosche, rendendola particolarmente utile per identificare le mosche che si nutrono in modo anomalo negli screening genetici.Per iniziare, raccogli le provviste per preparare il contenitore esterno. Sospendere 0,5 grammi di agarosio e 50 millilitri di acqua bidistillata. Scaldare agitando frequentemente e far bollire per sciogliere completamente su un agitatore magnetico con una piastra riscaldante.Quando l'1% di agarosio si raffredda a circa 60 gradi Celsius, trasferisci cinque millilitri in un contenitore esterno vuoto e tieni il contenitore aperto fino a quando l'agarosio non si è raffreddato a temperatura ambiente per produrre un tampone di agarosio. Successi

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La registrazione simultanea dei segnali di calcio da parte dei neuroni identificati e comportamento alimentare di Drosophila melanogaster</em

Larve di Drosophila sono in grado di associare stimoli odore con la ricompensa gustativa. Qui descriviamo un semplice paradigma comportamentale che permette l'analisi di appetitivo apprendimento associativo olfattivo.

Appetitivo apprendimento associativo olfattiva in<em&gt; Drosophila</em&gt; Le larve

Questo video descrive il saggio delle preferenze gustative, un metodo comportamentale utilizzato per misurare l'attrazione o l'evitamento verso soluzioni colorate che hanno un sapore diverso valutando la colorazione addominale della mosca dopo l'ingestione della sostanza preferita. Il protocollo presentato dimostra la procedura utilizzata per misurare la preferenza dei moscerini verso soluzioni con concentrazioni variabili di saccarosio.

Saggio delle preferenze gustative: un metodo per misurare il comportamento alimentare in Drosophila

Questo video descrive il test CApillary FEeder, o CAFE, un metodo comportamentale che misura l'assunzione di cibo e la preferenza dei moscerini della frutta non frenati. Il protocollo presentato mostra come eseguire il test con un'evaporazione minima dai capillari pieni di liquido utilizzati per erogare il cibo e monitorarne l'assunzione.

Il test CApillary FEeder (CAFE): un metodo per monitorare il consumo e la preferenza alimentare in Drosophila

In questo articolo video, descriviamo un test automatico per misurare l'effetto della fame o sazietà su olfattiva dipende comportamento di ricerca di cibo nel frutto adulto Drosophila melanogaster.

A Single-fly saggio per comportamento alimentare in Drosophila

Descriviamo un protocollo per indurre gratificante e nonrewarding esperienze nei moscerini della frutta (Drosophila melanogaster) utilizzando il consumo di etanolo volontaria come misura per le modifiche negli stati di ricompensa.

Un modo semplice per misurare alterazioni in ricompensa il comportamento di ricerca Utilizzando<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Il test CApillary FEeder (CAFE) è un metodo semplice, economico e altamente affidabile per studiare i meccanismi alla base dell'assunzione di cibo. Utilizzato con l'organismo modello genetico altamente versatile Drosophila melanogaster, fornisce un potente mezzo per acquisire nuove informazioni sui meccanismi di regolazione dell'assunzione di cibo.

Il capillare alimentatore Assay Misure assunzione di cibo in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Qui descritto è un protocollo che consente la quantificazione colorimetrica della quantità di cibo mangiata entro un intervallo di tempo definito dalle larve di Drosophila melanogaster esposte a diete di diversa qualità macronutriente. Questi test sono condotti nel contesto di uno schermo termogenetico neuronale.

Quantificazione dell'assunzione di macronutrienti in uno schermo neuronale termogenetico usando larve di Drosophila

Presentiamo un protocollo per un saggio di alimentazione a due scelte per le mosche. Questo test di alimentazione è veloce e facile da eseguire ed è adatto non solo per la ricerca di laboratorio su piccola scala, ma anche per schermi comportamentali ad alta produttività nelle mosche.

Un saggio rapido di preferenza alimentare in Drosophila

Il test dell'alimentatore di micropiasche offre un metodo economico e ad alta produttività per quantificare il consumo di alimenti liquidi in Drosophila. Un dispositivo stampato in 3D collega una micropiastra a 96 pozzette in cui le mosche sono alloggiate a una micropiastra da 1536 pozzene da cui le mosche consumano una soluzione di alimentazione con un colorante tracciante. Il declino del volume della soluzione viene misurato spettrofotometricamente.

Un test di alimentazione a micropiasche ad alta produttività per la quantificazione del consumo in Drosophila

Un approccio di imaging del calcio consente la registrazione delle risposte indotte dal gusto nel cervello dei moscerini svegli mentre una soluzione viene applicata al labello. Le risposte gustative primarie in Drosophila melanogaster sono utilizzate come esempio, ma questo protocollo può essere adattato per studiare i neuroni a valle o altre specie.

In vivo Imaging del calcio delle risposte neurali indotte dal gusto nella Drosophila adulta

Scopri come misurare quantitativamente l'ingestione di cibo in Drosophila melanogaster adulte usando cibo colorato e tecniche termogenetiche. Questo metodo ad alto rendimento permette di analizzare i circuiti neurali che regolano l'appetito.

Combinando le analisi quantitativa lingestione di cibo e forzatamente attivazione di neuroni per studiare lappetito in Drosophila (Video) | JoVE Journal

Combinando le analisi quantitativa l'ingestione di cibo e forzatamente attivazione di neuroni per studiare l'appetito in Drosophila

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