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Gli enzimi sono catalizzatori biochimici essenziali per la vita. I saggi enzimatici vengono utilizzati per studiare le proprietà cinetiche delle reazioni enzimatiche, chiarendo gli effetti catalitici degli enzimi. Questo video tratterà la cinetica e i saggi enzimatici, esaminerà una procedura generale e mostrerà alcune applicazioni.
Gli enzimi sono proteine, o meno spesso RNA, che agiscono su un reagente specifico, indicato come substrato. Un enzima riduce l'energia di attivazione necessaria per avviare una reazione biochimica, facendo sì che la reazione avvenga a un ritmo più veloce.
Le reazioni enzimatiche possono essere suddivise in tre componenti elementari. La prima è la formazione del complesso enzima-substrato, formato dal legame del substrato al sito attivo dell'enzima. Il complesso può decomporsi nei suoi costituenti originali. Questa è la seconda reazione elementare. In alternativa, il complesso può formare il prodotto e recuperare l'enzima, la terza reazione elementare.
La cinetica di una reazione elementare è data dall'equazione elementare della legge della velocità. Le equazioni della legge di velocità forniscono la velocità in termini di concentrazione dei reagenti e di una costante di velocità. Ciascuna delle reazioni elementari ha un'equazione individuale della legge di velocità, con la propria costante di velocità. Queste equazioni possono essere distillate in un modello cinetico noto come equazione di Michaelis-Menten. Questo fornisce la velocità di reazione in termini di concentrazione del substrato; che può essere determinato sperimentalmente. Alcune tendenze generali per le reazioni enzimatiche possono essere identificate utilizzando l'equazione di Michaelis-Menten. Ad alta concentrazione del substrato, viene raggiunto un punto di saturazione, chiamato Vmax. In questo caso, il tasso è limitato dalla concentrazione totale dell'enzima e dal numero di molecole di substrato che un enzima converte in prodotto per un dato tempo, noto anche come kcat. Nella cinetica di Michaelis-Menten kcat è una delle due costanti che governano la velocità di reazione. L'altra costante, KM, è nota come costante di affinità. KM è anche equivalente alla concentrazione in cui la velocità di reazione è equivalente a metà Vmax . Un enzima con un'affinità più alta avrà una KM più bassa e raggiungerà Vmax più velocemente, mentre un enzima con un'affinità più bassa avrà una KM più alta e impiegherà più tempo per raggiungere la Vmax. Conoscere kcat e KM consente di confrontare gli enzimi. Per fare questo usiamo un rapporto chiamato efficienza enzimatica. Un kcat più alto e un KM più basso si traducono in una maggiore efficienza, mentre un kcat più basso e un KM più alto si traducono in un KM inferiore.
I fattori utilizzati per chiarire la cinetica enzimatica devono essere determinati sperimentalmente. Questi saggi vengono in genere eseguiti mescolando un enzima e una soluzione di substrato in un ambiente controllato. Le osservazioni vengono effettuate misurando le variazioni di concentrazione del substrato, del prodotto o dei sottoprodotti rispetto al tempo.
La variazione della concentrazione nel tempo viene utilizzata per determinare la velocità di reazione. Per determinare la cinetica, i dati sulla velocità devono essere ottenuti a più concentrazioni. Se un grafico della velocità iniziale inversa rispetto alla concentrazione iniziale inversa, noto come diagramma di Lineweaver-Burk, è lineare, allora la reazione segue la cinetica di Michaelis-Menten. La pendenza e l'intercetta della linea consentono di determinare i parametri cinetici KM e Vmax, che possono quindi essere utilizzati per calcolare kcat e l'efficienza enzimatica.
Ora che i principi della cinetica enzimatica sono stati discussi, diamo un'occhiata a come viene eseguito un tipico test enzimatico.
In questa procedura viene dimostrato un test colorimetrico. ? Il primo passo consiste nel generare una curva standard, che correlerà l'assorbanza con la concentrazione del substrato. Le soluzioni di concentrazione nota vengono preparate insieme a un campione di controllo. Viene aggiunta una soluzione di sviluppo che reagisce con il substrato per produrre un composto colorato. L'assorbanza viene misurata e tracciata rispetto alla concentrazione per generare la curva standard.
Per eseguire il saggio, viene preparata una concentrazione nota di substrato insieme alla quantità appropriata di enzima. L'enzima e il substrato vengono miscelati e lasciati incubare per un determinato intervallo di tempo. Il pH e la temperatura sono controllati con soluzioni tampone e blocchi riscaldanti. Viene aggiunto un agente di estinzione per fermare la reazione. La soluzione di sviluppo viene quindi aggiunta alle reazioni e miscelata. Le soluzioni vengono quindi poste in cuvette e viene misurata l'assorbanza. La quantità di substrato consumata viene determinata confrontando l'assorbanza misurata con la curva standard. Utilizzando i dati raccolti, le velocità di reazione iniziali vengono determinate tracciando la concentrazione nel tempo. Infine, con i dati di velocità e concentrazione, viene realizzato il grafico di Michaelis-Menten. Ciò consente di determinare le proprietà cinetiche dell'enzima, come il numero di turnover e l'efficienza dell'enzima.
Ora che abbiamo esaminato una procedura di analisi, diamo un'occhiata ad altri modi in cui vengono eseguiti i saggi e alle loro applicazioni.
In questa procedura l'analisi FRET viene utilizzata per studiare la cinetica di una proteasi che idrolizza un legame peptidico di una proteina. Queste emissioni possono essere misurate, consentendo un'analisi continua e quantitativa del consumo e della produzione del substrato, aiutando nella determinazione della cinetica di reazione.
I saggi enzimatici possono essere utilizzati nelle scienze ambientali per determinare i livelli di attività enzimatica extracellulare nell'ambiente. Le acque, i terreni e i sedimenti possono essere raccolti dall'ambiente e lavorati in laboratorio. L'attività enzimatica extracellulare di questi materiali può quindi essere caratterizzata utilizzando saggi enzimatici. Questo è uno strumento utile per capire come l'ambiente elabora il materiale organico.
Il meccanismo di riparazione del DNA di una cellula può essere valutato studiando la cinetica degli enzimi presenti nel nucleo. La velocità con cui un enzima rimuove le lesioni o i danni al DNA può essere misurata utilizzando fari molecolari fluorescenti, che emettono fluorescenza solo quando sono legati a sequenze di DNA uniche. Il livello di riparazione del DNA può essere misurato in tempo reale rilevando i prodotti di scissione marcati in fluorescenza.
Hai appena visto il video di JoVE sulla cinetica e i saggi enzimatici. Questo video spiegava la cinetica enzimatica, copriva i concetti dei saggi, esaminava una procedura generale e descriveva alcune applicazioni.
Grazie per l'attenzione!