Trans-inner Cell Mass iniezione delle cellule staminali embrionali porta a tassi più elevati di chimerismo
29 maggio 2018
Qui presentiamo un protocollo per aumentare la produzione di chimera senza l'uso di nuove attrezzature. Un cambiamento di orientamento semplice dell'embrione per iniezione può aumentare il numero di embrioni prodotti e potenzialmente ridurre la timeline di trasmissione nella linea germinale.
L'obiettivo generale di questa procedura modificata è quello di aumentare la produzione chimerica senza incorrere in costi aggiuntivi o lunghi periodi di formazione. Questo metodo può aiutare i laboratori a diventare più efficienti nella produzione di chimere, soprattutto nei casi in cui le cellule ES non sono ottimali. Il vantaggio principale di questa tecnica è che non richiede attrezzature aggiuntive e nessuna formazione specializzata.
A dimostrare la procedura oggi sarà Thomas Hagler. È un biologo e studente laureato che lavora nel laboratorio principale. Per prelevare gli embrioni, tamponare l'utero su un tessuto di laboratorio per rimuovere il sangue in eccesso e posizionare l'organo in un nuovo piatto da 60 millimetri sotto un microscopio da dissezione a basso ingrandimento.
Usando una pinza da dissezione per tenere con cura e delicatezza l'utero vicino all'ovidotto, inserire un ago da 25 gauge collegato a una siringa da 10 millilitri contenente 10 millilitri di terreno di raccolta dell'esplosione al centro dell'utero appena oltre le punte delle pinze su un piano il più parallelo possibile. Applicare pressione sulla pinza per fissare l'ago all'interno dell'utero e sciacquare delicatamente circa un millilitro di terreno attraverso il corno uterino. Quando tutte le blastocisti sono state espulse, assemblare l'apparecchio per pipette orali e utilizzare la pipetta orale per trasferire i singoli embrioni in singole gocce di terreno di raccolta blastica in un secondo piatto da 60 millimetri.
Quindi lavare ogni embrione in una seconda goccia di terreno di raccolta e trasferire gli embrioni in una capsula a quattro pozzetti fino all'iniezione. Per iniziare, utilizzare un microiniettore per applicare il vuoto all'ago per iniezione. Posizionare una capsula di cellule ES sotto il microscopio per iniezione dove sono attaccati l'ago per iniezione e la pipetta porta embrioni.
È essenziale per il successo dell'iniezione prendersi il tempo necessario per impostare correttamente il microscopio. Ciò include la corretta quantità di fluido nell'ago e il corretto allineamento dell'asse z. Utilizzare un microiniettore per applicare il vuoto all'ago per iniezione.
Mantenendo il minor spazio possibile tra le cellule, aspira cellule embrionali di piccole e medie dimensioni dalla superficie liscia senza difetti evidenti dal piatto degli embrioni. Dopo aver raccolto almeno 15 cellule, posizionare un embrione vicino all'apertura del supporto. Applicare il vuoto per fissare l'embrione al supporto e spostare la pipetta di supporto verso l'alto o verso il basso per regolare l'asse z fino a quando l'embrione non tocca appena il vetrino.
Mettere a fuoco con precisione la zona della pellucida e regolare l'asse z dell'ago per iniezione fino a quando le cellule embrionali vicino alla punta dell'ago sono a fuoco. Se necessario, utilizzare l'ago per iniezione per far rotolare delicatamente la blastocisti fino a quando la massa cellulare interna non si trova nella posizione appropriata per l'iniezione. Esercitando una spinta decisa ma controllata, inserire l'ago per iniezione attraverso la zona di pellucida nella massa cellulare interna e applicare una leggera pressione sul microiniettore dell'ago per iniezione per evitare il collasso del blastocele.
Una volta che l'ago è penetrato nel blastocele, applicare pressione al microiniettore per trasferire tutte le cellule staminali embrionali nell'embrione, fermandosi brevemente quando lo smusso dell'ago inizia a uscire dall'embrione per consentire alla pressione nell'embrione di tornare alla normalità pur mantenendo le cellule. Quando tutte le blastocisti sono state iniettate, utilizzare un dispositivo di trasferimento embrionale non chirurgico per consegnare gli embrioni ai topi Swiss Webster allo stadio embrionale 2.5 secondo le istruzioni del produttore e alloggiare i topi singolarmente dopo ogni trasferimento fino al parto e al successivo svezzamento. In questo esperimento rappresentativo, i tassi di gravidanza erano invariati tra la massa di cellule interne trans iniettate e i gruppi di controllo tradizionalmente iniettati e un numero uguale di cuccioli è sopravvissuto allo svezzamento da ciascun gruppo.
In particolare, mentre il numero di topi allo svezzamento è rimasto invariato, un numero significativamente più elevato di cuccioli del gruppo iniettato con massa cellulare interna trans ha mostrato un chimerismo del colore del mantello rispetto al gruppo di controllo iniettato. La parte migliore di questa tecnica è che richiede solo un semplice cambiamento nell'orientamento dell'embrione per facilitare una maggiore produzione nelle chimere. La corretta configurazione del microscopio è essenziale.
Se il microscopio e i manipolatori non sono configurati correttamente e mantenuti bene, il processo di iniezione non funzionerà. Se non conosci le iniezioni di embrioni, la ripetizione è l'unico modo per imparare. Per i principianti, la manipolazione degli embrioni tende ad essere la parte più difficile della procedura.
Essere in grado di spostare gli embrioni in modo efficiente da un piatto all'altro senza perderne nessuno è la parte più cruciale dell'esperimento. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come una semplice modifica alla tua tecnica di iniezione standard possa aiutarti a diventare più efficiente nella produzione di chimere.
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Panoramica
Questo articolo presenta un protocollo modificato volto ad aumentare la produzione chimerica senza la necessità di attrezzature aggiuntive. La tecnica si concentra su un semplice cambiamento di orientamento dell'embrione durante l'iniezione, che può migliorare la resa degli embrioni e potenzialmente ridurre i tempi per la trasmissione della linea germinale.
Componenti chiave dello studio
Area della scienza
- Neuroscienza
- Biologia dello sviluppo
- Genetica
Sfondo
- La produzione chimerica è essenziale per vari studi biologici.
- I metodi tradizionali possono richiedere attrezzature costose e una formazione approfondita.
- Migliorare l'efficienza nella produzione di chimere può beneficiare molti laboratori.
- Questo protocollo mira a semplificare il processo mantenendo l'efficacia.
Obiettivo dello studio
- Migliorare la produzione di chimere senza incorrere in costi aggiuntivi.
- Ridurre il tempo di formazione richiesto per il personale di laboratorio.
- Fornire un metodo semplice che possa essere facilmente adottato dai ricercatori.
Metodi utilizzati
- Raccolta degli embrioni tamponando l'utero per rimuovere il sangue in eccesso.
- Utilizzo di un microscopio dissecante a bassa magnificazione per il posizionamento dell'embrione.
- Implementazione di un orientamento modificato dell'embrione durante l'iniezione.
- Dimostrazione della procedura da parte di un biologo qualificato.
Risultati principali
- La procedura modificata ha aumentato con successo la produzione chimerica.
- I laboratori hanno riportato una maggiore efficienza senza costi aggiuntivi.
- I partecipanti hanno trovato il metodo facile da apprendere e implementare.
- È stato osservato un potenziale per tempi ridotti di trasmissione della linea germinale.
Conclusioni
- Questo protocollo offre una soluzione economica per migliorare la produzione chimerica.
- Semplifica il processo, rendendolo accessibile a più laboratori.
- Studi futuri potrebbero esplorare ulteriori ottimizzazioni della tecnica.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Efficient generation of genetically modified mouse models is a critical inflection point in early discovery and target validation pipelines. The trans-inner cell mass (TICM) injection protocol increases chimerism rates without additional equipment or specialized training, directly improving throughput and resource allocation for in vivo model generation. This operational advance supports portfolio-wide acceleration of hypothesis-driven research and risk-adjusted progression of candidate targets.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables rapid production of high-chimerism mouse models for functional genomics studies.
- Improves biological de-risking by increasing the likelihood of germline transmission in engineered lines.
- Supports robust target validation through efficient generation of genetically modified cohorts.
- Facilitates portfolio triage by reducing bottlenecks in in vivo model availability.
Screening & Assay Development
- Provides validated chimeric animals for downstream phenotypic screening and assay development.
- Standardizes embryo injection procedures, enhancing reproducibility across projects.
- Delivers quantitative outputs (chimerism rates) to benchmark protocol performance.
- Enables scalable model production for compound evaluation workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational research by supporting continuity from genetic modification to preclinical model validation.
- Reduces risk of late-stage biological failure by improving model generation efficiency.
- Supports biomarker discovery and validation in genetically engineered systems.
Pipeline & Workflow Integration
The TICM injection protocol integrates at the interface of early discovery and preclinical model development, streamlining the transition from genetic engineering to in vivo validation.
- Discovery Biology: Increases predictive confidence in target function studies by enabling higher chimerism rates.
- Screening: Standardizes embryo injection for reproducible model generation and downstream screening readiness.
- Analytics: Provides quantitative chimerism data to inform protocol optimization and cross-study comparisons.
- Translational Research: Enhances continuity from genetic modification to preclinical efficacy and safety studies.
- Enterprise Reuse: Offers a broadly adoptable protocol for core facilities and project teams without additional capital investment.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in genetically engineered models.
- Operational Value: Delivers standardization, reproducibility, and scalability in chimera production workflows.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions and capital efficiency by accelerating model availability.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of discovery programs.
Implementation Considerations
- Requires technical expertise in embryo handling and microinjection.
- Depends on precise microscope and manipulator setup for reproducibility.
- Necessitates cross-team standardization of embryo orientation and injection technique.
- Adaptable across inbred and hybrid mouse strains as demonstrated in the study.
- Embryo handling proficiency is critical to minimize loss and maximize yield.
