Name: Modelli murini di patologie gastriche e infezione da Helicobacter (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 43 s
Description: Scopri come stabilire modelli murini di infezione da Helicobacter pylori per studiare patogenesi gastrica e sviluppare terapie. Questo metodo permette analisi istopatologiche dettagliate in vivo.

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Gli autori vorrei ringraziare la sig. ra r. De Paoli e MS. Georgie Wray-McCann per assistenza tecnica. Gli autori riconoscono l'uso dei servizi e l'assistenza tecnica della piattaforma di istologia di Monash, dipartimento di anatomia e biologia inerente allo sviluppo, Monash University. Il laboratorio è sostenuto da finanziamenti del National Health and Medical Research Consiglio (NHMRC) per RLF (APP1079930, APP1107930). RLF è supportato da un Senior Research Fellowship da NHMRC (APP1079904). KD e MC sono entrambi supportati da Monash laurea Borse di studio. KD è supportato anche dal centro per l'immunità innata e contagiosa malattie, Hudson Institute of Medical Research, mentre MC ha una borsa di studio post-laurea internazionale dalla facoltà di medicina, infermieristica e scienze di salute, Università di Monash. Ricerca presso l'Hudson Institute of Medical Research è supportata dal programma di supporto dell'infrastruttura operativa del governo vittoriano.

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<li>Ng, G., Every, A., McGuckin, M., Sutton, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+Helicobacter+felis+colonization+in+male+129%2FSv+mice+fails+to+suppress+gastritis%5BTitle%5D)+AND+%22Gut+Microbes%22%5BJournal%5D)">Increased Helicobacter felis colonization in male 129/Sv mice fails to suppress gastritis.</a> Gut Microbes. 2 (6), 358-360 (2011).</li>
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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Questo protocollo descrive l'uso di un modello di topo in vivo per l'infezione di Helicobacter . I punti critici della procedura sono la: 1) preparazione di Helicobacter inoculi contenenti batteri vitali e mobili; 2) consegna dei numeri appropriati di batteri al mouse tramite sonda gastrica intragastrica; 3) rilevamento delle infezioni batteriche da Colonia contando e/o PCR; e 4) elaborazione dei tessuti gastrici per consentire la valutazione della istopatologia in infettato gli stomaci. Ulteri...

Helicobacter pylori è un patogeno gastrico a forma di spirale, gram-negativo, umano presente in tutte le popolazioni in tutto il mondo, con tassi di infezione nei paesi in via di sviluppo stimati nell'ordine di 80%1. Anche se la maggior parte dei pilori del H.-individui infetti sono asintomatici, alcuni sviluppano malattie più gravi, che vanno dall'ulcerazione peptica a cancro gastrico2. H. pylori-tumori associati ampiamente sono caratterizzati da cambiamenti maligni in cellule epiteliali (GECs) o dalla formazione di tessuti linfoidi supplementare-nodale nello stomaco, risultante nell'adenocarcinoma gastrico o mucosa-collegato linfoide linfoma del tessuto (malto), rispettivamente. H. pylori è altamente adattato per sopravvivere nella nicchia ecologica dura dello stomaco dovuto alla presenza di vari fattori di virulenza e meccanismi che agevolino la sua adesione, la crescita e il metabolismo in questa nicchia. In particolare, i ceppi virulenti di H. pylori possiedono il 40 kb cag isola di patogenicità (cagPAI) che codifica circa 30 geni richiesti per la produzione di una tipo 4 secrezione sistema (T4SS)3,4 . CAG PAI-positivi sforzi dei pilori del H. sono associati con l'induzione dei livelli elevati di infiammazione cronica nell'ospite, che è stato implicato come un precursore essenziale di adenocarcinoma gastrico5.
In vivo modelli animali, soprattutto topi, sono state altamente informativi, consentendo ai ricercatori di studiare i contributi relativi di host, fattori ambientali e batterici su infezione da H. pylori e malattia risultato6. Gli studi hanno dimostrato in precedenza che prolungato di H. pylori infezione dei topi sui risultati C57BL/6 background genetico nello sviluppo della gastrite cronica e la ghiandola atrofia, entrambi tratti distintivi di H. pylori infezione7. Inoltre, l'infezione con la specie affini batterica felino/canino, H. felis, ha dimostrato di indurre la formazione di malto in topi con simile patologia e progressione di malattia come visto in umano MALT linfoma8,9. Il più comunemente usato H. pylori isolato negli studi di colonizzazione del mouse è il "Sydney sforzo 1" (SS1) ceppo10, che è cagPAI+ , ma ha un non-funzionale T4SS (T4SS−)11. Altri ceppi ampiamente usati includono H. pylori B128 7.13 (cagPAI+/T4SS+)12 e X47-2AL (cagPAI–/T4SS−)13. Per infezioni da H. felis , il ceppo CS1 ("gatto a spirale 1", cagPAI–/T4SS−) è generalmente usato14.
Qui, forniamo un protocollo che descrive la preparazione di Helicobacter inoculi per l'infezione in vivo , la procedura per sonda gastrica intragastrica di topi, nonché metodi per la lavorazione dei tessuti per lo studio dei cambiamenti istopatologici nello stomaco. In particolare, questo articolo si concentrerà sui metodi istologici utilizzati per visualizzare la colonizzazione batterica e valutare i cambiamenti istopatologici, compreso formazione di malto, nella mucosa gastrica dei topi infettati. Alcuni dei metodi descritti qui può essere adattato allo studio di altri agenti patogeni dell'intestino quali S. Typhimurium o rodentium c..

<table><tbody><tr><td><forte>Reagenti batteriologici</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sangue Ossoide Agar Base No.2</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>CM0271B</td><td>Sciogliere in acqua deinonizzata prima della sterilizzazione</td></tr><tr><td>Sangue di cavallo defibrinato di alta qualità</td> Australian <td>Ethical Biologicals PDHB100</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bacto Brain Heart Infusion Brodo</td><td>BD Bioscience</td><td>237500</td><td>Sciogliere in acqua deinonizzata prima della sterilizzazione</td></tr><tr><td>Confezioni di gas CampyGen</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>CN0035A/CN0025A</td><td></td></tr><tr><td>Reagenti istologici</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Formalina, tamponato neutro, 10%</td> <td>alcol assoluto Sigma Aldrich</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>, 100% denaturato</td><td>ChemSupply</td><td>AL048-20L-P</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanolo (2-propanolo)</td><td>Merck</td><td>100995</td><td></td></tr><tr><td>Xilene (senza zolfo)</td><td>ChemSupply</td><td>XT003-20L</td><td></td></tr><tr><td>Mayer's Haematoxylin</td><td>Amber Scientific</td><td>MH-1L</td><td>Filtro prima dell'uso</td></tr><tr><td>Eosina, Colorazione acquosa</td><td>Amber Scientific</td><td>EOCA-1L</td><td>Filtro prima dell'uso</td></tr><tr><td>Wright-Giemsa Stain, modificato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>WG80-2.5L</td><td>Diluire prima dell'uso (20% Giemsa, 80% acqua deionizzata)</td></tr><tr><td>Histolene</td><td>Grale Scientific</td><td>11031/5</td><td></td></tr><tr><td>DPX terreno di montaggio</td><td>VWR</td><td>1.00579.0500</td><td></td></tr><tr><td>Reagenti per biologia molecolare</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA BR Assay Kit</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>Q32850</td><td></td></tr><tr><td>Oligonucleotidi</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>La temperatura di ricottura dei primer ureB utilizzati in questo studio è di 61 gradi; C</td></tr><tr><td>GoTaq Flexi DNA polimerasi</td><td>Promega</td><td>M8291</td><td>Il kit include 10 tamponi PCR e</td></tr><tr><td>dNTP</td> di cloruro di magnesio <td>Bioline</td><td>BIO-39028</td><td>Diluire a 10 mM in acqua sterile priva di nucleasi prima dell'uso</td></tr><tr><td>Agarosio di grado molecolare</td><td>Bioline</td><td>BIO-41025</td><td></td></tr><tr><td>Carbonato acido di sodio</td><td>Univar (Ajax Fine Chemicals)</td><td>A475-500G</td><td></td></tr><tr><td>Magnesio Solfato eptaidrato</td><td>Chem-Supply</td><td>MA048-500G</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotics</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vancomicyn</td><td>Sigma Aldrich</td><td>V2002-1G</td><td>Sciogliere in acqua deionizzata</td></tr><tr><td>Polymyxin B</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4932-5MU</td><td>Sciogliere in acqua deionizzata</td></tr><tr><td>Trimetoprim (&ge; 98% HPLC)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T7883</td><td>Sciogliere in 100% (assoluto) Etanolo</td></tr><tr><td>Amfotericina</td><td>Amresco (Astral Scientific)</td><td>E437-100MG</td><td>Sciogliere in acqua deionizzata</td></tr><tr><td>Bacitracina da Bacillus licheniformis</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B0125</td><td>Sciogliere in acqua deionizzata</td></tr><tr><td>Acido naladissico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N8878</td><td>Sciogliere in acqua deionizzata</td></tr><tr><td>Altri reagenti</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Methoxyflurane (Pentrhox)</td><td>Medical Developments International</td><td>Non applicabile</td><td></td></tr><tr><td>Cera di paraffina</td><td>Paraplast Plus, Leica Biosystems</td><td>39601006</td><td></td></tr><tr><td>Attrezzature e plastica</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oxoid Anaerobic Jars</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>HP0011/HP0031</td><td></td></tr><tr><td>Pipette COPAN Pasteur Interpath</td><td>Services</td><td>200CS01</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td></td><td></td> Eppendorf 5810R <td>Raccogli pellet batterici mediante centrifugazione a 2.200 giri/min per 10 minuti a 4 &deg; C</td></tr><tr><td>23 g ago di scorrimento di precisione</td><td>BD Bioscience</td><td>301805</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>Bemis, VWR</td><td>PM996</td><td></td></tr><tr><td>Portex tubo in polietilene a foro fine</td><td>Smiths Medical</td><td>800/100/200</td><td></td></tr><tr><td>Cateteri di alimentazione in plastica</td><td>Instech&nbsp; Laboratori</td><td>FTP20-30</td><td></td></tr><tr><td>Siringhe monouso da 1 mL di tubercolina luer slip</td><td>BD Bioscience</td><td>302100</td><td></td></tr><tr><td>Micropestello Eppendorf per provette da 1,2 - 2 mL</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z317314</td><td>Pestelli in polipropilene autoclavabili utilizzati per l'omogeneizzazione dello stomaco</td></tr><tr><td>GentleMACs Dissociator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td>Utilizzare un programma gentleMACS preimpostato per il tessuto dello stomaco del topo</td></tr><tr><td>Tubi M (tappo arancione)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>30-093-236</td><td></td></tr><tr><td>Qubit Fluorimetro</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>Q33216</td><td></td></tr><tr><td>Anello in plastica sterile</td><td>LabServ</td><td>LBSLP7202</td><td></td></tr><tr><td>Cold Plate, Leica EG1160 Sistema di inclusione</td><td>Leica Biosystems</td><td>Non applicabile</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek Base Mold System, Base Mold 38 x 25 x 6</td><td>Sakura, Alphen aan den Rijn</td><td>4124</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek III Uni-Casette System</td><td>Sakura, Alphen aan den Rijn</td><td>4170</td><td></td></tr><tr><td>Microtome, Leica RM2235</td><td>Leica Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vetrini in vetro SuperFrost Plus caricati Menzel</td><td>Glaser, Thermo Fischer Scientific</td><td>4951PLUS4</td><td></td></tr></tbody></table>

modelli murini di patologie gastriche e infezione da helicobacter

Mouse Models Of Helicobacter Infection And Gastric Pathologies

Helicobacter pylori è un agente patogeno gastrico che è presente a metà della popolazione mondiale ed è una causa significativa della morbosità e della mortalità negli esseri umani. Diversi modelli di mouse dell'infezione gastrica Helicobacter sono stati sviluppati per lo studio dei meccanismi molecolari e cellulari per cui H. pylori batteri colonizzano lo stomaco degli umani e causare la malattia. Qui, descriviamo i protocolli per: 1) preparare sospensioni batteriche per l'infezione in vivo dei topi tramite sonda gastrica intragastrica; 2) determinare i livelli di colonizzazione batterica in tessuti gastrici del mouse, da reazione a catena della polimerasi (PCR) e contando praticabile; e 3) valutare le alterazioni patologiche, dall'istologia. Per stabilire la Helicobactinfezione nei topi, animali (SPF) esenti da patogeni specifici prima vengono inoculati con sospensioni (contenenti ≥ 105 unità formanti colonie, CFUs) di mouse-colonizzazione di ceppi di entrambi i pilori di Helicobacter o altre speci di Helicobacter gastrico da animali, come Helicobacter felis. Presso post-l'infezione tempo-punti appropriati, stomaci sono asportati e dissecati sagittally in due frammenti di tessuto uguale, ciascuno costituito da regioni antrum e corpo. Uno di questi frammenti viene quindi utilizzato per conteggio praticabile o estrazione del DNA, mentre l'altro è sottoposto a elaborazione istologica. Colonizzazione batterica e cambiamenti istopatologici nello stomaco possono essere valutati ordinariamente in sezioni di tessuto gastrico macchiate con macchie Warthin-Stellato, Giemsa o Haematoxylin ed eosina (H & E), come appropriato. Analisi immunologiche supplementari possono essere effettuati anche da immunohistochemistry o immunofluorescenza su sezioni di tessuto gastrico di topo. I protocolli descritti di seguito sono progettati specificamente per consentire la valutazione nei topi di patologie gastriche che assomigliano a quelli in umani relativi pilori del H. malattie, compreso infiammazione, atrofia della ghiandola e formazione follicolo linfoide. La preparazione dell'inoculo e protocolli intragastrico "gavage" possono anche essere adattati per studiare la patogenesi di altri patogeni enterici umani che colonizzano i topi, come Salmonella Typhimurium o Citrobacter rodentium.

Questo protocollo descrive una tecnica di alimentazione mediante sonda gastrica orale per raggiungere intragastrica infezione da H. pylori o H. felis in modelli murini murino (Figura 1). A seguito di eutanasia, stomaci vengono rimossi, pesati e diviso in 2 metà uguali comprendenti antro, corpo e regioni non ghiandolare dei tessuti gastrici (Figura 2). La regione non ghiandolare viene rimosso prima di eseguire qualsiasi analisi.
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Topi rappresentano un modello prezioso in vivo per studiare l'infezione e malattie causate da microrganismi gastrointestinale. Qui, descriviamo i metodi utilizzati per studiare la colonizzazione batterica e cambiamenti istopatologici in modelli murini di Helicobacter pylori-malattia correlata.

Modelli murini di patologie gastriche e infezione da Helicobacter

Helicobacter pylori is a gastric pathogen that is present in half of the global population and is a significant cause of morbidity and mortality in ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della gastroenterologia sull'impatto dei membri del microbiota, in particolare quelli del genere Helicobacter, sull'infiammazione e sul cancro. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente lo studio dell'infezione da Helicobacter e del suo impatto sullo stomaco in condizioni fisiologiche. Le implicazioni di questa tecnica si estendono verso lo sviluppo di terapie per la prevenzione o l'eliminazione dell'infezione da Helicobacter o delle sue conseguenze, inclusi antibiotici, farmaci o vaccini.Questi metodi forniscono informazioni specifiche sulla patogenesi dell'infezione da Helicobacter. Tuttavia, molte delle tecniche possono essere adattate allo studio di altri agenti patogeni gastrointestinali. Generalmente, gli individui nuovi a questo metodo avranno difficoltà con la preparazione di un inoculo batterico in grado di stabilire un'infezione nei topi.È imperativo che gli isolati helicobacter siano ceppi noti che colonizzano il topo e che non hanno subito un'ampia sottocultura in vitro. Inoltre, deve essere registrato il numero di sottoculture in vitro per questi ceppi. Aggiungere sospensioni batteriche a tubi in polistirolo da 15 millilitri e utilizzare un anello di plastica per trasferire una goccia da 10 a 20 microlitri da ogni coltura su singoli vetrini al microscopio.Quindi, valutare la vitalità e la motilità dei batteri sotto microscopia a contrasto di fase con un ingrandimento 100 volte superiore. Utilizzare l'inocula H.pylori solo se la maggior parte dei batteri ha una forma bacillare. H.felis inocula dovrebbe contenere principalmente batteri a forma elicoiale.E caricare l'inoculo in siringhe individuali, usa e getta, da un millilitro. Dotare ogni siringa di un ago calibro 23 e utilizzare pellicola di paraffina di plastica per attaccare un catetere monouso in polietilene a ciascun ago. Successivamente, trattenere manualmente un topo privo di agenti patogeni specifici di sei-otto settimane e privo di Helicobacter per il collo e la coda e inserire un catetere al centro della mascella aperta.Guida il catetere in un caudale verso l'esofago, estendendo il collo del topo per consentire facilità di accesso allo stomaco attraverso l'esofago e lontano dalla trachea fino a quando la maggior parte o tutto il catetere non è più visibile e si sente una resistenza. Quindi, consegnare almeno uno per 10 al quinto batterio per garantire una colonizzazione ottimale e una patologia della malattia. Alla fine dell'esperimento, utilizzare forbici fini e curve per aprire la cavità addominale per l'escissione dello stomaco.Tagliare lo stomaco lungo la curvatura maggiore e lavare delicatamente l'organo due volte in un tubo da 50 millilitri di PBS fresco per lavaggio per rimuovere eventuali alimenti residui. Dopo il secondo lavaggio, posizionare il tessuto in una piastra di Petri di plastica tarata di sei centimetri per registrare il peso umido. Dopo aver appiattito lo stomaco, bisect il campione sagittally in due frammenti di tessuto uguali che comprendono le regioni antrum, corpo e forestamach non ghiandolare.Rimuovere la regione non ghiandolare e pesare la metà di ogni stomaco prima di conservare il pezzo di tessuto nella soluzione appropriata per l'analisi a valle pianificata. Aggiungere l'altra metà del tessuto dello stomaco a un tubo conico da 15 millilitri contenente il 10% di formalina, appiattindo i tessuti contro i lati superiore dei tubi dopo 10 secondi. Quando i tessuti sono stati apposti sulle pareti del tubo, immergere di nuovo i campioni nella formalina per almeno 24 ore.Per contare il numero di H.pylori vitali nello stomaco dopo l'infezione, omogeneizzare i campioni di stomaco conservati in BHI ed eseguire diluizioni seriali duplicate degli omogeneati gastrici risultanti in brodo fresco e sterile. Dividere le piastre pre-essiccate di sangue di cavallo, o HBA, integrate con antibiotici aggiuntivi in tre o quattro segmenti e, utilizzando un adattamento della tecnica Miles e Misra, aggiungere da 10 a 100 microlitri di ogni diluizione omogenea dello stomaco su un segmento di ogni piastra di agar. Stendere gli omogenei con anelli di plastica sterili e lasciare asciugare le piastre.Quindi, posizionare le piastre in posizione invertita in barattoli di gas anaerobe contenenti una piastra di petri d'acqua e una confezione di gas. Quindi, incubare i barattoli a 37 gradi Celsius per quattro o sette giorni. Quando le colonie possono essere osservate, enumerare i segmenti contenenti tra 10 e 100 colonie isolate.Dopo l'eutanasia, lo stomaco viene raccolto dagli animali e pesato. La regione non ghiandolare viene rimossa e lo stomaco è diviso in due metà uguali che comprendono l'antro e il corpo. La colonizzazione riuscita è tipicamente confermata eseguendo un conteggio praticabile e una successiva enumerazione di singole colonie da omogeneati gastrici striate su piastre HBA.Si noti che la presenza di batteri contaminanti dal microbiota gastrico del topo o da un gran numero di colonie di H.pylori può complicare l'enumerazione dei CFC H.pylori. In alternativa, la PCR può essere utilizzata per verificare l'infezione utilizzando primir convalidati specifici diretti a una regione di coppia a 325 basi dei geni H.felis e H.pylori ureB. In questo esperimento rappresentativo, i topi C57 Black-6 di tipo selvatico mostrarono segni moderati di infiammazione, tra cui iperplasia e atrofia della ghiandola a sei mesi dopo l'infezione da H.felis, così come l'infiltrazione cellulare della sottomucosa.Infiammazione più grave si osserva nei topi knockout nello stesso momento, con l'ulteriore presenza di follicoli linfoidi osservati in prossimità degli infiltrati cellulari. I batteri H.felis possono anche essere visualizzati in sezioni macchiate di Giemsa del tessuto dello stomaco del topo infetto. Seguendo questa procedura, altri metodi come pcr quantitativo, immunoistochimica o immunofluorescenza possono essere eseguiti per rispondere a domande aggiuntive sui tipi di risposte dell'ospite indotte durante l'infezione da Helicobacter.Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha spianato la strada ai ricercatori nel campo della microbiologia e della gastroenterologia per esplorare il ruolo causale dell'Helicobacter pylori nella malattia dello stomaco nell'uomo. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come infettare riproducibilmente i topi con le specie di Helicobacter e studiare la patologia associata all'infezione. Non dimenticare che i ceppi Helicobacter utilizzati in questo protocollo sono infettivi, e quindi le procedure standard di biosicurezza dovrebbero sempre essere seguite mentre si lavora con questi batteri.

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Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

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Una tecnica di gavage intragastrica per l'infezione controllata da Helicobacter nei topi

In questo video, descriviamo un protocollo per quantificare il carico di Helicobacter pylori nei tessuti dello stomaco del topo dopo l'infezione per confermarne la colonizzazione.

Quantificazione del carico di Helicobacter pylori nello stomaco di un topo infetto

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Modelli murini di patologie gastriche e infezione da Helicobacter

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