Ingegneria fluorescenza 'D'oro' per incorporazione di pressione selettiva di aminoacidi Non canonico e l'analisi della proteina di fluorescenza e di spettrometria di massa

L'obiettivo di questo esperimento è quello di sostituire un amminoacido canonico con un amminoacido non canonico per la produzione di proteine ricombinanti mediante incorporazione di pressione selettiva per produrre la nuova proteina fluorescente d'oro. Il metodo di incorporazione selettiva della pressione ha lo scopo di produrre proteine con nuove caratteristiche chimiche. Ciò è particolarmente utile quando si tenta di comprendere o ingegnerizzare la funzione delle proteine.

Il vantaggio principale di questa tecnica è che è relativamente semplice da condurre perché è simile alla comune produzione di proteine ricombinanti. La fluorescenza correlata al tempo e alla lunghezza d'onda è utile per studiare la dinamica dello stato eccitato della proteina modificata, che a sua volta rende più facile comprendere l'influenza dell'amminoacido non canonico introdotto nel cromoforo sulle proprietà ottiche. In linea di principio, l'SPI può essere applicato a qualsiasi ambiente di produzione proteica per il quale sono disponibili ceppi auxotrofici e terreni chimicamente definiti.

Ciò include altri ceppi batterici e anche colture cellulari di mammiferi. La tempistica e l'impostazione delle condizioni di espressione sono fondamentali poiché è obbligatorio sopprimere la produzione della proteina wild-type non modificata. Ecco perché alcuni parametri come la temperatura, il tempo di induzione o la composizione del terreno di coltura devono essere ottimizzati.

Abbiamo avuto l'idea di questo metodo dopo gli studi iniziali sull'estratto proteico con aminoacidi contenenti metile come la selenometionina. A dimostrare la procedura sarà Almut Pelzer, uno studente del mio laboratorio. Per iniziare questa procedura, trasformare le cellule di E.coli auxotrofiche di triptofano con il plasmide di espressione per ECFP.

Utilizzare una singola colonia per inoculare una precoltura di cinque millilitri di terreno LB integrato con ampicillina in una provetta di coltura. Incubare per una notte a 37 gradi Celsius e 200 giri/min. Il giorno successivo, inoculare 100 millilitri di terreno NMM19 integrato utilizzando un millilitro della coltura notturna in un pallone di Erlenmeyer da un litro.

Quindi, incubare la coltura per una notte in un agitatore orbitale a 200 giri/min e 30 gradi Celsius. Il giorno successivo, misurare la densità ottica a 600 nanometri ogni 30 minuti fino a quando il valore cambia di meno di 0,05 in 30 minuti. Quindi, centrifugare la coltura a 5.000 volte g e quattro gradi Celsius per 10 minuti per raccogliere le cellule batteriche.

Scartare il surnatante con la decantazione. Risospendere le cellule in terreno NMM19 integrato con ampicillina per un volume totale di 100 millilitri. Trasferire nuovamente questa sospensione nella stessa fiaschetta di Erlenmeyer.

Aggiungere il 4-ammino-indolo ad una concentrazione finale di un millimolare. Incubare in un agitatore orbitale per 30 minuti a 30 gradi Celsius e 200 giri/min. Dopo 30 minuti, aggiungere IPTG alla coltura a una concentrazione finale di 0,5 millimolari per indurre l'espressione genica bersaglio.

Incubare per una notte in un agitatore orbitale a 30 gradi Celsius e 200 giri/min. Il giorno successivo, raccogliere le cellule batteriche centrifugando a 5.000 volte g e quattro gradi Celsius per 10 minuti. Scartare il surnatante con la decantazione.

Congelare il pellet cellulare a meno 20 gradi Celsius o meno 80 gradi Celsius fino al momento di eseguire la purificazione delle proteine target. Innanzitutto, prepara il lisato di cellule batteriche come indicato nel protocollo di testo. Dopo aver preparato la colonna cromatografica secondo le istruzioni del produttore, utilizzare il tampone legante per equilibrare la colonna cromatografica di affinità con ioni metallici immobilizzati.

Caricare il lisato sulla colonna fino al completamento. Si noti la proteina color oro legata alla resina per cromatografia. Lavare la colonna con il tampone legante.

Quindi, eluire la proteina bersaglio utilizzando il tampone di eluizione. Raccogli e raggruppa tutte le frazioni eluite che contengono proteina fluorescente dell'oro, che può essere identificata dal colore dorato visibile. Successivamente, preparare una membrana per dialisi con un limite di peso molecolare compreso tra 5.000 e 10.000 secondo le istruzioni del produttore.

Dializzare un campione da un millilitro con almeno 100 millilitri di tampone per un minimo di due ore. Per iniziare, utilizzare il tampone MS per diluire il campione proteico a 0,1 milligrammi per millilitro, in modo tale che il volume finale sia di 80 microlitri. Pipettare accuratamente per mescolare.

Trasferire la soluzione in un flaconcino di autocampionatore MS con inserto in vetro e chiuderlo con un tappo. Sbattere la fiala per rimuovere le bolle d'aria. Quindi, preparare uno spazio vuoto contenente tampone MS in una seconda fiala.

Inserire entrambe le fiale nell'autocampionatore HPLC. Successivamente, preparare e calibrare lo strumento MS secondo le istruzioni del produttore. Impostare il volume di iniezione dell'autocampionatore su cinque microlitri per la cromatografia liquida ad alte prestazioni abbinata al metodo di spettrometria di massa a tempo di volo con ionizzazione elettrospray.

Creare un elenco di lavoro per l'esecuzione vuota, seguita dall'esecuzione di esempio GdFP. Assegnare il volume di iniezione, le posizioni corrispondenti della fiala dell'autocampionatore ed eseguire la lista di lavoro. Per iniziare, preparare una soluzione proteica fluorescente d'oro e il rivelatore per il conteggio dei singoli fotoni correlati al tempo e alla lunghezza d'onda, come indicato nel protocollo di testo.

Utilizzando il software di conteggio dei singoli fotoni, è possibile acquisire l'emissione di fluorescenza a una velocità di conteggio di circa 200.000 fotoni al secondo fino a quando non si accumulano circa 10.000 conteggi nel massimo di acquisizione delle curve di decadimento della fluorescenza. Successivamente, sostituire la cuvetta del campione con una cuvetta di quarzo da un centimetro riempita con silice colloidale in tampone PBS. Estrarre il filtro laser e regolare il reticolo per l'acquisizione di fotoni a 470 nanometri nel canale centrale del rivelatore.

Quindi, acquisire la funzione di risposta strumentale fino a quando non si accumulano circa 10.000 conteggi nel massimo di emissione. Converti, adatta e traccia i dati risultanti come descritto nel protocollo di testo per ottenere gli spettri associati al decadimento, che rappresentano la dipendenza dei tempi di decadimento della fluorescenza dalla lunghezza d'onda di emissione. In questo studio, la spettrometria di massa viene utilizzata per confermare che la variante fluorescente spettrale del tipo di proteina fluorescente verde spostata verso il rosso, chiamata proteina fluorescente d'oro, viene prodotta con successo.

Mentre l'ECFP wild-type ha una massa proteica calcolata di 28.283,9 dalton dopo la maturazione del cromoforo, la massa corrispondente della proteina fluorescente d'oro è di 28.313,9 dalton. Lo spettro ESI-MS decontorto della proteina fluorescente d'oro mostra un picco di massa principale a circa 28.314,1 dalton, deviando dal valore teorico di meno di 10 parti per milione. Ciò conferma l'incorporazione dell'amminoacido non canonico mediante incorporazione per pressione selettiva.

Lo spettro di assorbimento dell'ECFP ha due massimi caratteristici a 434 nanometri e 452 nanometri. Al contrario, la proteina fluorescente dell'oro è caratterizzata da un'ampia banda di assorbimento spostata verso il rosso con il massimo a 466 nanometri. Mentre il massimo di assorbimento di EGFP è ulteriormente spostato verso il rosso a 488 nanometri, lo spettro di emissione della fluorescenza della proteina fluorescente all'oro e il corrispondente spostamento di Stokes della GdFP significano che è il più spostato verso il rosso di tutti i derivati della proteina fluorescente verde Aequorea victoria.

L'emissione di fluorescenza risolta nel tempo monitorata mediante conteggio di singoli fotoni è mostrata qui. Le curve di decadimento mostrano un decadimento della fluorescenza leggermente più veloce a 600 nanometri che a 550 nanometri. L'emissione di fluorescenza della proteina fluorescente dorata dipende fortemente dal pH, come è tipico per molte varianti proteiche fluorescenti verdi.

Come si vede qui, c'è una chiara diminuzione della fluorescenza a pH più basso, anche se le caratteristiche spettrali rimangono costanti. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in tre giorni partendo da colonie di cellule batteriche trasformate o da stock di glicerolo congelati. Durante il tentativo di questa procedura, è importante assicurarsi che l'aminoacido mirato sia esaurito.

L'ncAA deve essere assorbito dalla cellula, biocompatibile e incorporato nelle proteine dal ceppo auxotrofico scelto. Seguendo questa procedura, è possibile generare una grande varietà di proteine per scopi ingegneristici. A seconda delle proteine bersaglio, i metodi come gli analizzatori di stabilità proteica, i saggi di attività enzimatica, la spettroscopia di fluorescenza o la cristallizzazione delle proteine, possono essere utilizzati per descrivere l'influenza dell'amminoacido non canonico sulle proprietà funzionali e strutturali.

Dopo il suo sviluppo, questa tecnica si è rivelata molto utile nel campo della biologia sintetica, fornendole proteine e proteomi nuovi per la natura. Questo espande le capacità chimiche per l'ingegneria delle proteine. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come incorporare amminoacidi non canonici in proteine ricombinanti mediante incorporazione di pressione selettiva, come verificare l'introduzione di un amminoacido artificiale mediante spettrometria di massa e come analizzare una proteina fluorescente mediante fluorescenza risolta nel tempo.