Produzione e purificazione di Baculovirus per applicazione di terapia genica

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di produrre baculovirus in coltura cellulare di insetti, purificare con cromatografia di affinità con eparina e concentrarsi con ultracentrifugazione. Il prodotto finale può essere utilizzato per il trasferimento genico in vivo o come vaccino. Questo metodo può aiutare i ricercatori che desiderano utilizzare baculovirus purificato e concentrato per l'applicazione della terapia genica.

Le particelle di baculovirus possono contenere detriti cellulari e proteine provenienti dalla coltura di Sf9 che possono indurre infiammazione o una risposta immunitaria se usati nelle persone. Per evitare la tossicità, il baculovirus viene purificato e separato dalle particelle contaminanti. Alcune parti della procedura saranno dimostrate da Marilou Narciso, un'assistente di ricerca del mio laboratorio.

Per impostare la coltura in sospensione, seminare 50 millilitri di cellule Sf9 in un terreno di coltura per insetti in un pallone di Erlenmeyer in policarbonato da 250 millilitri. E posizionare il pallone in un'incubatrice con agitatore orbitale. Aggiungere due millilitri di stock di baculovirus P2 alle cellule e agitare a 135 giri/min mantenendo una temperatura costante di 28 gradi Celsius.

Quattro giorni dopo l'infezione, l'intera popolazione di cellule Sf9 mostrerà un effetto citopatico, che è un'indicazione della produzione di baculovirus ad alto titolo. Amplificare sequenzialmente il baculovirus fino a ottenere il volume desiderato, aumentando il volume della coltura cellulare in ogni infezione successiva da 10 a 50 volte. Dopo aver centrifugato il surnatante finale del baculovirus per 30 minuti a 1000 g e quattro gradi Celsius per separare i detriti cellulari del corso, trasferire il surnatante in un recipiente pulito e trattare con nucleasi a 50 unità per millilitro per due ore a 37 gradi Celsius per digerire il DNA e l'RNA genomico.

Infine, filtrare il surnatante virale attraverso un'unità di filtrazione da 0,45 micron. Impostare il sistema cromatografico posizionando la linea del tampone di lavaggio dalla porta di ingresso A1 in un flacone contenente almeno 500 millilitri di tampone di lavaggio. Utilizzare la porta di ingresso del tampone A2 per caricare il tampone di eluizione.

Inserire diverse provette coniche da 50 millilitri nel collettore di frazioni per raccogliere il surnatante del baculovirus passante della colonna, il tampone di lavaggio e il baculovirus eluso. Equilibrare la colonna di eparina con cinque volumi di colonna da 7,9 millilitri di tampone di lavaggio a una portata lineare di sette millilitri al minuto. Caricare 250 millilitri di surnatante del baculovirus sulla colonna di eparina utilizzando la pompa di campionamento della porta di ingresso del campione a una portata lineare di due millilitri al minuto.

Quindi far scorrere 10 volumi di colonna di tampone di lavaggio attraverso la colonna di eparina a una portata lineare di due millilitri al minuto fino a quando la curva di assorbanza ultravioletta non è tornata alla linea di base e si è stabilizzata. Eludere le particelle di baculovirus dalla colonna di eparina con cinque volumi di colonna di tampone di eluizione a una velocità di flusso lineare di quattro millilitri al minuto. Osservare un picco di eluizione acuta della proteina sul cromatogramma quando le particelle di baculovirus si dissociano dalla colonna di eparina.

Dopo l'eluizione, diluire immediatamente il surnatante del baculovirus eluso di 10 volte utilizzando un tampone fosfato di sodio da 20 millimetri per prevenire l'attivazione delle particelle di baculovirus dallo shock osmotico durante la successiva centrifugazione. Iniziare la procedura di concentrazione aggiungendo un volume uguale di surnatante del baculovirus in autoclave alle provette per ultracentrifuga. Misurare il peso della provetta con una bilancia e regolare il peso del contenuto delle provette per ultracentrifuga con PBS sterile.

Posizionare ciascuna delle provette dell'ultracentrifuga in un secchio opposto del rotore SW 32 Ti e far funzionare l'ultracentrifuga a 80.000 g per 90 minuti a quattro gradi Celsius. Dopo la centrifugazione, aprire le provette per ultracentrifuga in una cappa di coltura tissutale e aspirare il liquido in modo asettico senza rimuovere il pellet di baculovirus. Aggiungere 200 microlitri di PBS contenente lo 0,5% di BSA e risospendere ogni pellet pipettando energicamente su e giù.

Infine, trasferire da 50 a 100 microlitri di aliquote di baculovirus concentrato in crioviali e conservare a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius. I titoli di baculovirus sono stati stimati mediante infezione delle cellule HT1080. La linea collegata da diamanti mostra le unità infettive totali di baculovirus in ciascuna frazione.

Le particelle di baculovirus si legano fortemente alla colonna di eparina, quindi non viene rilevata alcuna quantità significativa di virus nel tampone di lavaggio della colonna. Durante l'eluizione si osserva un forte picco di proteine, che corrisponde alla frazione del baculovirus. I parametri utilizzati in questo protocollo massimizzano la resa e minimizzano l'inattivazione delle particelle infettive del baculovirus.

Questo protocollo può essere utilizzato per la purificazione di altri virus e proteine che hanno un'affinità per l'eparina.