Visualizzando l'actina e Cytoskeletons dei microtubuli alla sinapsi della B-cellula Immune usando la microscopia di svuotamento (STED) emissione stimolata

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di colorare i citoscheletri di actina e microtubuli nella sinapsi immunitaria delle cellule B per la deplezione di emissione stimolata, o microscopia STED, e l'imaging della loro struttura, organizzazione in relazioni spaziali. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave sull'organizzazione del citoscheletro durante l'attivazione delle cellule B, inclusa la riorganizzazione dei citoscheletri di actina e microtubuli durante la formazione delle sinapsi immunitarie. Il vantaggio principale della microscopia STED multicolore è che consente l'imaging simultaneo del citoscheletro di actina, della rete di microtubuli e delle proteine chiave associate al citoscheletro con una risoluzione su scala nanometrica.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sull'attivazione delle cellule B, può anche essere applicato alla formazione di sinapsi immunitarie di altri tipi di cellule immunitarie come le cellule natural killer e le cellule T. In generale, le persone che non conoscono questo metodo scopriranno che l'ottimizzazione delle impostazioni del microscopio per l'imaging simultaneo e più fluorofori utilizzando STED richiederà un po' di pratica. A dimostrare questa procedura insieme a Jia e Madison saranno Kate Choi e Caitlin Pritchard.

Iniziare centrifugando da 2,5 volte 10 a 6 cellule di linfoma B A20 per ogni trasfezione e ri-sospendere le cellule in 100 microlitri di reagente di trasfezione integrato con uno o 2,5 microgrammi del DNA plasmatico di interesse. Mescolare delicatamente le soluzioni e trasferire ogni aliquota di cellule nei singoli pozzetti di una piastra a sei pozzetti. Regolare il volume in ciascun pozzetto a due millilitri con un terreno completo a 37 gradi Celsius e posizionare le cellule in un incubatore a 37 gradi Celsius per 18 ore.

La mattina successiva, immergere 1,5 vetrini coprioggetti rotondi da 18 millimetri in metanolo al 100% e lasciare asciugare completamente i vetrini coprioggetti per circa 10 minuti. Posizionare i vetrini coprioggetti essiccati nei pozzetti individuali di una piastra di coltura tissutale a 12 pozzetti e aggiungere 400 microlitri di anticorpo anti-immunoglobulina G di capra al centro di ciascun vetrino coprioggetti in modo che si formi una bolla al centro e si diffonda ai bordi senza gocciolare nel pozzetto. Incubare i vetrini coprioggetti a temperatura ambiente per 30 minuti.

Quindi sciacquare i vetrini coprioggetti con un millilitro di PBS sterile per pozzetto, tre volte, per rimuovere eventuali anticorpi non legati. Dopo l'ultimo lavaggio, conservare ogni vetrino coprioggetti in un millilitro di PBS fresco e sterile fino alla semina cellulare. Quando le cellule trasfettate sono pronte, raccoglierle in una provetta conica da 15 millilitri mediante centrifugazione e risospendere i pellet in un millilitro di soluzione salina tamponata HEPES modificata integrata con FBS.

Dopo il conteggio, diluire le cellule a una concentrazione di due per 10 fino alla 5a cellula per millilitro e soluzione salina tamponata HEPES modificata più FBS e utilizzare una pinza per trasferire ciascun vetrino coprioggetti su un pezzo di pellicola di paraffina. Aggiungere 250 microlitri di cellule a ciascun vetrino coprioggetti e incubare i vetrini coprioggetti a 37 gradi Celsius per 15 minuti al buio per consentire alle cellule di diffondersi sulle superfici rivestite di anti-immunoglobulina G. Al termine dell'incubazione, rimuovere la soluzione fisiologica in eccesso da ogni vetrino e rivestire ogni vetrino coprioggetti con 350 microlitri di fissativo, avendo cura che l'intera superficie sia coperta.

Dopo 10 minuti al buio a temperatura ambiente, utilizzare una micropipetta per aspirare accuratamente il fissativo dal bordo di ogni vetrino coprioggetti e lavare i vetrini coprioggetti con 500 microlitri di tampone permeabilizzante e bloccante. Quindi, permeabilizzare e bloccare le cellule con 250 microlitri di permeabilizzazione fresca e tampone bloccante per 10 minuti a temperatura ambiente al buio. Successivamente, rimuovere il tampone in eccesso ed etichettare le cellule con 50 microlitri dell'anticorpo primario di interesse per 30 minuti al buio a temperatura ambiente.

Al termine dell'incubazione, lavare il vetrino coprioggetti tre volte con 500 microlitri di tampone colorante per lavaggio e aggiungere 50 microlitri dell'anticorpo secondario appropriato a ciascun vetrino coprioggetti per 30 minuti a temperatura ambiente. Dopo aver lavato l'anticorpo secondario, aggiungere 10 microlitri di reagente di montaggio a un vetrino da microscopio e montare i vetrini coprioggetti sui singoli vetrini da microscopio, con la cella rivolta verso il basso. Quindi lasciare asciugare i vetrini durante la notte al buio per l'imaging del giorno successivo.

Per visualizzare le cellule con la microscopia STED, accendere prima il microscopio STED. Attivare i laser nella lampada di illuminazione per epifluorescenza e aprire il software del microscopio. Impostare i parametri per i laser a deplezione STED e caricare il primo campione sul microscopio.

Utilizzando l'oculare, mettere a fuoco manualmente il campione per selezionare una cellula con un'espressione GFP moderata. Ingrandisci la cella selezionata e seleziona la regione di interesse da riprendere. Regolare la messa a fuoco in modo che il piano XY della cella più vicina al vetrino coprioggetti sia a fuoco.

Quindi, nella scheda Acquisisci del software, selezionare l'opzione Tra fotogrammi nel pannello Scansione sequenziale per impostare l'acquisizione dell'immagine su Acquisizione sequenziale dei fotogrammi. Imposta la potenza del laser STED per ogni fluoroforo e usa la barra di scorrimento per regolare le potenze del laser in base ai fluorofori utilizzati nell'esperimento. Per aumentare la risoluzione e ridurre il segnale di fondo, aprire le impostazioni di acquisizione e utilizzare il menu a tendina per selezionare un valore maggiore di uno per aumentare la media delle linee e/o dei fotogrammi.

Controllare l'opzione di guadagno per ciascun fluoroforo e i valori specifici per il guadagno di tempo per acquisire il segnale fluorescente appropriato per STED temporizzato e aumentare la potenza del laser STED per migliorare la risoluzione. È fondamentale ottimizzare il tempo di acquisizione del campione del microscopio e dei fluorofori utilizzati per migliorare la risoluzione senza perdere troppo del segnale fluorescente. Quindi acquisire manualmente più immagini per garantire la riproducibilità e deconvolgere le immagini utilizzando un pacchetto software di deconvoluzione secondo le istruzioni del produttore.

Per le cellule di linfoma B A20, distribuite su anticorpi immunoglobuline NT immobilizzati. La microscopia STED, utilizzata in combinazione con il software di deconvoluzione, fornisce immagini a risoluzione più elevata delle strutture citoscheletriche rispetto alla sola microscopia confocale. Sebbene la deconvoluzione delle immagini confocali produca un miglioramento sostanziale della risoluzione dell'immagine, le immagini STED deconvolute forniscono informazioni strutturali più dettagliate rispetto alle immagini confocali deconvolte.

Lo STED monocolore può essere utilizzato anche per acquisire immagini tridimensionali a super-risoluzione dell'intera rete citoscheletrica delle cellule B. In queste immagini STED multicolori, la colorazione dell'anello periferico dell'actina dendritica può essere osservata in combinazione con la colorazione dei microtubuli. Quando si utilizzano cellule trasfettate con proteine di fusione fluorescenti, il raggiungimento di livelli di espressione ottimali e l'evitare artefatti dovuti alla sovraespressione sono considerazioni significative, mentre un'espressione troppo bassa della proteina di fusione fluorescente si traduce anche in immagini di scarsa qualità.

Anche un'attenta focalizzazione, per includere l'intera regione di interesse, è essenziale. Ad esempio, in questa immagine, solo alcune parti della rete di microtubuli si trovavano all'interno del piano focale più vicino al vetrino coprioggetti, impedendo un'analisi completa del campione. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in due giorni.

Un giorno per la preparazione e la colorazione del campione e un giorno per l'imaging STED. È importante ricordare di titolare la quantità di plasma da utilizzare per trasfettare le cellule in modo da ottenere un'espressione sufficiente della proteina fluorescente per il rilevamento durante l'imaging, evitando artefatti da sovraespressione. Seguendo questa procedura, l'espressione di diverse proteine di fusione fluorescenti può essere indotta per facilitare la localizzazione di altre proteine che regolano la dinamica e l'organizzazione del citoscheletro, o per visualizzare la distribuzione sub-cellulare di proteine coinvolte in altri processi cellulari.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare la microscopia STED per l'imaging delle strutture citoscheletriche e delle proteine coinvolte nella formazione delle sinapsi immunitarie. Non dimenticare che lavorare con fissativi come la glutaraldeide può essere estremamente pericoloso e che precauzioni come lavorare in una cappa chimica dovrebbero sempre essere prese quando si utilizzano questi tipi di reagenti.