Name: 2维直接随机光学重建显微成像中间丝和微管 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-06T13:30:00.000+00:00
Duration: 14 min 23 s
Description: 学习使用二维双色dSTORM技术对固定细胞中的微管和中间丝进行超分辨成像的方法。该技术以U373细胞为模型，可解析传统荧光显微镜无法观察到的细胞骨架网络精细结构。

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我们感谢Mickael Lelek、Orestis Faklaris和Nicolas Bourg富有成效的讨论，感谢Andrey Aristov和Elena Rensen在超分辨率技术方面的帮助，以及Shailaja Seetharaman对稿件的仔细审阅。我们衷心感谢巴斯德研究所（法国巴黎）UtechS光子生物成像平台（Imagopole）Citech，以及由法国国家科研署（ANR-10-INSB-04；“未来投资”计划）和法兰西岛大区（“重点领域—Malinf”计划）资助的法国生物成像基础设施网络，为我们提供Elyra显微镜的使用支持。本研究得到了抗癌联盟（Ligue Contre le Cancer）和法国国家科研署（ANR-16-CE13-0019）的资助。

1. 盖玻片准备（第1天，30分钟）
<ol>
	<li>将18 mm nº1.5H（170 µm ± 5 µm）玻璃盖玻片放置在塑料架上。</li>
	<li>将支架放入盛有丙酮的100 mL烧杯中，浸泡5分钟。</li>
	<li>将支架转移至盛有无水乙醇的100 mL烧杯中，浸泡5分钟。</li>
	<li>将支架转移至另一个盛有无水乙醇的100 mL烧杯中，并将烧杯置于超声波清洗仪（见材料表）中，室温下运行。按下&#34;开启&#34;按钮，持续超声10分钟。</li>
	<li>将支架置于超净工作台内，让盖玻片自然晾干，或用过滤后的气流吹干。</li>
	<li>将装有盖玻片的支架放入等离子清洗仪中。启动真空泵，关闭舱门，抽真空3分钟，然后开启等离子清洗1分钟。清洗后应立即使用盖玻片，切勿储存。</li>
</ol>
2. 细胞铺板（第1天，20分钟）
<ol>
	<li>在含有10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素和1%非必需氨基酸的最低必需培养基（MEM）中，于直径10 cm的塑料培养皿中培养胶质细胞系U373。</li>
	<li>在超净工作台中将洁净的玻璃盖玻片放入12孔板中，每孔加入1 mL预热的细胞培养基。</li>
	<li>从细胞培养箱（37 °C，5% CO2）中取出含有细胞的培养皿。</li>
	<li>吸除培养基，加入10 mL磷酸盐缓冲液（PBS）。</li>
	<li>吸除PBS，每皿加入1 mL 0.05%胰蛋白酶-EDTA溶液。</li>
	<li>将培养皿重新放回培养箱中孵育2–3分钟。</li>
	<li>向培养皿中加入10 mL在37 °C预热的温热培养基，重悬细胞。</li>
	<li>在含盖玻片的12孔板中，每孔接种约100,000个细胞（约150 µL细胞悬液）。</li>
	<li>静置至少6小时（或过夜），以允许细胞充分铺展。</li>
</ol>
3. 细胞固定（第2天，2小时）
<ol>
	<li>配制细胞骨架缓冲液，含 80 mM PIPES、7 mM MgCl2、1 mM EGTA、150 mM NaCl，并将 pH 调至 6.9。</li>
	<li>用 PBS 洗涤细胞一次。</li>
	<li>吸除 PBS，每孔轻轻加入 1 mL 预热至 37 °C 的抽提/固定液（含 0.25% 戊二醛、0.3% Triton X-100 的细胞骨架缓冲液）。</li>
	<li>室温孵育 60 秒。</li>
	<li>吸除溶液，每孔轻轻加入 1 mL 预热并新鲜配制的 4% PFA（多聚甲醛）溶液（用细胞骨架缓冲液稀释）。 
	注意：操作时需佩戴手套，并在通风橱内进行。</li>
	<li>将 12 孔板放回 37 °C 培养箱中孵育 10 分钟。</li>
	<li>吸除 PFA 溶液，每孔加入 3 mL PBS。 
	注意：操作时需在通风橱内佩戴手套，并将回收的 PFA 置于专用回收容器中。</li>
	<li>用 PBS 洗涤两次。</li>
	<li>吸除 PBS，加入新鲜配制的 10 mM NaBH4 溶液（用 PBS 稀释），以淬灭戊二醛引起的自发荧光。</li>
	<li>室温孵育 7 分钟。</li>
	<li>将回收的 NaBH4 溶液置于专用回收容器中。</li>
	<li>用 PBS 洗涤三次，每次 5 分钟。</li>
	<li>吸除 PBS，加入封闭液（含 5% BSA 的 PBS 溶液）。</li>
	<li>室温孵育 1 小时（或 4 °C 过夜）。 
	注意：细胞骨架缓冲液可在室温下保存数月。PFA、NaBH4 和戊二醛需特别小心处理（使用通风橱、手套及专用回收容器）。添加和移除溶液时应轻柔操作，以保持细胞完整性。切勿让细胞干燥。</li>
</ol>
4. 免疫染色（第2天，5小时）
<ol>
	<li>使用抗波形蛋白（anti-vimentin）和抗微管蛋白（anti-tubulin）抗体，按1:500比例在封闭液中配制一抗溶液。</li>
	<li>在石蜡膜层上滴加100 µL稀释后的一抗溶液，将带有细胞的盖玻片细胞面朝下放置于液滴上。</li>
	<li>室温下孵育细胞与一抗2小时。将盖玻片放回含PBS的12孔板中，在摇床上用PBS室温洗涤3次，每次5分钟。</li>
	<li>在此期间，使用抗小鼠Alexa647和抗大鼠Alexa555二抗，按1:1,000比例在封闭液中配制二抗溶液。室温避光孵育细胞1小时，操作方式同步骤4.2，注意避光。</li>
	<li>将盖玻片放回含PBS的12孔板中，在摇床上用PBS室温洗涤3次，每次5分钟。吸除PBS，加入0.5 mL PBS混合1 µL 0.1 µm四色荧光微球（tetraspeck beads）。</li>
	<li>将孔板置于摇床上震荡30分钟，用PBS冲洗。吸除PBS后，加入含4%多聚甲醛（PFA）的PBS溶液，室温固定细胞5分钟。再用PBS洗涤3次。 
	注意：固定后的细胞可在4°C的PBS中保存数周。免疫荧光染色应于使用前最后时刻进行。</li>
</ol>
5. 样品制备（第3天，5分钟）
<ol>
	<li>将MEA（半胱胺，1 M，pH 8.3）、葡萄糖氧化酶（100倍浓缩液，50 mg/mL）和过氧化氢酶（500倍浓缩液，20 mg/mL）分装后置于冰篮中。</li>
	<li>配制50 mL Tris-NaCl缓冲液（50 mM Tris，10 mM NaCl，pH = 8），并加入10%葡萄糖（100 mg/mL）。</li>
	<li>成像前立即配制1.2 mL成像缓冲液，其中含10 mM MEA、0.5 mg/mL（75 U/mL）葡萄糖氧化酶、40 µg/mL过氧化氢酶（80 - 200 U/mL），溶于含10%葡萄糖的Tris-NaCl缓冲液中。</li>
	<li>将含有标记细胞的盖玻片安装在磁性样品托上（例如Chamlide腔室），加入成像缓冲液完全充满腔室。盖上盖板，并确保成像缓冲液与盖板之间无气泡。</li>
	<li>用无水乙醇清洁样品底部，并检查是否泄漏。如有必要，使用密封脂妥善密封样品托。 
	注意：提前配制1 M MEA母液（用HCl调节pH至8.3）、50 mg/mL葡萄糖氧化酶母液和20 mg/mL过氧化氢酶母液，分装后分别于-20°C保存，MEA可保存一个月，葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶可保存一年。分装液避免反复冻融。Tris-NaCl缓冲液可预先配制，室温保存数月。葡萄糖需在实验当天添加（步骤5.3）。</li>
</ol>
6. 图像采集（第3天，每细胞约1小时）
<ol>
	<li>打开显微镜。启动采集软件并点击 启动系统。</li>
	<li>选择 采集 选项卡。在设置管理器工具组中展开 成像设置 工具。选择采集模式为 激光宽场（wide field）。选择 100X NA 1.46 物镜。选择 TIRF u-HP 模式，该模式使用准直器缩小照明视野，将激光能量集中到更小的区域。使用 optovar 1.6x 镜头，以获得 100 nm 的像素尺寸。</li>
	<li>选择 时间序列 工具，设置时间序列为 50 000 帧，帧间间隔为 0.0 毫秒。在采集参数工具组中展开 通道 工具，并选择 &#34;显示全部&#34;。</li>
	<li>设置 Alexa647 通道：勾选 642 和 405 激光线用于激发，并确认开启。在 成像设置 中选择 &#34;655 LP&#34; 发射滤光片。将通道重命名为 &#34;647&#34;。</li>
	<li>在 通道 工具中点击“+”添加另一条光路，并在 成像设置 工具中选择模式 &#34;每帧切换通道&#34;。勾选 561、488 和 405 激光线，并确认开启。选择 &#34;BP 570-650+LP750&#34; 发射滤光片，并使用 optovar 1.6x 镜头。确认已选择 TIRF-uHP 模式。将该通道重命名为 &#34;555&#34;。</li>
	<li>选择 采集模式 工具，将帧尺寸设置为 200 × 200 像素。选择 聚焦设备与策略 工具，若配备聚焦锁定系统，则将聚焦锁定设置为每 1 000 帧一次。</li>
	<li>在物镜上滴加镜油，并放置样品。选择 定位 选项卡，打开荧光灯快门。通过目镜寻找待成像细胞并调焦，使用操纵杆将其置于视野中央。</li>
	<li>选择 采集 选项卡返回采集模式。选择 &#34;647&#34; 通道，将 642 激光功率设为 0.2%，405 激光功率设为 0，曝光时间设为 50 毫秒，增益设为 50。选择 连续 采集模式以在屏幕上观察细胞。调整焦距。确保视野中至少有一个 Tetraspeck 微球，必要时提高对比度以便观察。使用自动缩放模式显示图像。点击 拍摄 获取一张波形蛋白网络的宽场落射荧光图像并保存。为检查 TIRF 照明效果，点击 TIRF，必要时调整照明角度和/或准直器，以获得均匀的照明视野，并保存图像。 
	注意：在开始原始数据采集前，确保 TIRF 和落射荧光图像质量良好。若纤维标记不连续或不均匀，将导致 dSTORM 图像质量下降。</li>
	<li>取消勾选 &#34;647&#34; 通道，选择并勾选 &#34;555&#34; 通道。获取微管网络的落射荧光图像并保存。同时获取并保存 TIRF 图像。</li>
	<li>取消勾选 &#34;555&#34; 通道，选择并勾选 &#34;647&#34; 通道，然后点击 连续。将增益设为 0，曝光时间设为 10 毫秒。将 642 nm 激光功率设为 100%，以将大部分 Alexa647 染料泵入暗态（约 2 kW/cm2）。当荧光分子开始闪烁时，将曝光时间调整为 15 毫秒，增益调整为 300。选择 TIRF 照明模式。使用 范围指示器 模式（不启用自动缩放）检查单分子信号是否使相机饱和（红色表示饱和）。若出现饱和，降低增益直至饱和消失。Tetraspeck 微球在采集初期可能持续饱和。点击 停止 结束对细胞的连续观察。</li>
	<li>展开 在线处理 工具，并勾选 在线处理 PALM，以便在采集过程中实时查看 STORM 图像。使用以下参数：峰值掩模大小设为 9（直径 9 像素），峰值信噪比设为 6。这些参数将决定哪些分子被纳入处理（亮度足够且不重叠）。在 PAL-Statistics 工具中，选择图表类型为 直方图，直方图数据源为 定位精度。点击 开始采集。</li>
	<li>采集过程中，必要时重新对焦（若无聚焦锁定装置）。调整参数（曝光时间、激光功率），并根据需要开启 405 nm 激光线（起始功率为 0.001%），以维持中等荧光分子密度，且单分子间最小距离为 1 µm（&#62; 9 个 100 nm 像素，即峰值掩模大小）（图 1A-B）。若分子密度过高，可改用 HILO（高倾斜层状光片）照明模式替代 TIRF，此模式将使激光功率增加 20%。确保重建图像下方的定位精度直方图峰值集中在 10 nm 或更低。 
	注意：通常分子数量随时间减少，需相应缓慢增加 405 nm 激光功率。目标是尽可能降低定位精度（超分辨图像下方显示的直方图），使峰值低于 10 nm（图 1C）。若视野中亮斑过多，可适当提高 PALM 图像的对比度。</li>
	<li>当定位数量超过 106 时（通常在采集约 40 000 帧后），点击 停止 结束视频采集。将激光功率恢复至 642 nm 为 0.2%，405 nm 为 0。以 .czi 格式保存 STORM 采集的原始数据。在通道工具中取消勾选 &#34;647&#34; 通道，选择并勾选 &#34;555&#34; 通道。</li>
	<li>将曝光时间设为 25 毫秒，增益设为 0。点击 连续 按钮，将 488 和 561 激光均设为 100%，以将 Alexa555 染料泵入暗态（每束约 2 kW/cm2）。当荧光分子开始闪烁时，将增益设为 250，使用 HILO 照明模式，并通过范围指示器模式确认单分子信号未使相机饱和。若发生饱和，应降低增益。点击 停止。将 488 激光功率降至 50%。</li>
	<li>点击 开始采集。采集过程中，逐步提高增益，始终接近饱和极限。逐步增加 405 nm 激光功率，以维持视野中单分子的中等密度（参见步骤 6.18）。当 405 激光功率超过 15% 时，将 488 激光功率降至 20–30%。随后在逐步提高 405 激光的同时逐渐降低 488 激光，以尽可能加快分子闪烁频率。488 激光与最大强度的 561 激光共同作用可同时提高荧光分子的“开启”和“关闭”速率，而 405 激光仅提高“开启”速率。</li>
	<li>当定位数量超过 500 000（约 20 000 帧后）或不再有分子闪烁时，停止采集。以 .czi 格式保存 STORM 采集的原始数据。 
	注意：始终从较长波长开始采集，以避免其他荧光染料的漂白或意外激活。由于 Chamlide 培养腔未密封，可定期更换成像缓冲液，例如用于测试不同缓冲条件。仅当 561 激光功率受限（如使用 100 mW 激光器）时，才需要使用 488 激光线来耗尽 Alexa555 染料。</li>
</ol>
7. 图像重建（5 分钟）
<ol>
	<li>在 PAL-Drift 工具中，使用最大段大小为 8 的自动分段模型（Model-based）校正类型。连续多次点击 Apply，直至漂移被校正。该基于模型的校正方法采用基于互相关分析的算法来校正漂移。</li>
	<li>使用 PAL-Filter 工具，通过仅选择定位最精确的分子来改善 STORM 图像的外观。例如，将 Localization precision 限制为 30 nm，点扩散函数（PSF）限制在 120–180 nm 范围内。</li>
	<li>在 PAL-render 工具中使用 5 或 10 nm 的像素分辨率，选择高斯显示模式，扩展因子为 1 PSF。选择“Render auto dynamic range HR”并设置为 95% 值，选择“Render auto dynamic range SWF”并设置为 90% 值。选择“Render best quality”以获得最佳成像质量。</li>
	<li>在 Processing 选项卡的 PALM 菜单中（后处理模式），选择 PALM convert。点击 Select，然后点击 Apply。以 LSM 格式（而非 .czi 格式，这一点非常重要）保存生成的图像。 
	注意： 图像重建可在采集完成后立即进行，也可后续使用采集软件的图像处理模式完成。在离线后处理模式下，可使用不同的参数值（如峰掩模大小、峰强度与噪声比）重新分析图像堆栈。始终选择 &#34;discard overlapping molecules&#34;，而不选择 &#34;average before localization&#34;。</li>
</ol>
8. STORM 图像定位精度的估算（10 分钟）
<ol>
	<li>打开STORM原始数据，使用图像处理选项卡。选择PALM方法，然后再次选择PALM。点击选择。</li>
	<li>点击应用以开始重建，使用9的峰值掩膜大小和6的峰值强度与噪声比（或根据图像选择的其他参数）。</li>
	<li>选择矩形图形工具，在玻璃表面单个分子周围的原始图像上绘制一个矩形。通常此处会存在少量单分子。</li>
	<li>再次点击应用，仅对矩形区域内存在的分子进行分析。</li>
	<li>在PAL-Statistics工具中，选择绘图类型：直方图，直方图源：X位置或Y位置，以可视化位置直方图。</li>
	<li>保存图像左侧下方的定位列表表格。</li>
	<li>使用数据分析软件，生成X和Y位置的直方图（图1D）。</li>
	<li>用高斯函数拟合分布，记录σX和σY值。定位精度σSMLM由(σX*σY)^0.5估算。</li>
	<li>尽可能多地重复步骤8.3–8.8，并对σSMLM取平均值。</li>
</ol>
9. 通道校准（5 分钟）
<ol>
	<li>使用 Fiji (Image J) 软件打开每种颜色的 STORM 图像。</li>
	<li>选择魔棒工具以测量每个四色荧光微球的位置。</li>
	<li>计算每个微球的 X 和 Y 方向偏移量，并对它们取平均值。</li>
	<li>使用 &#34;平移&#34; 命令，根据计算出的 X 和 Y 偏移量对第二幅图像进行平移。</li>
	<li>使用合并通道命令将两幅图像合并。</li>
</ol>

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作者声明不存在竞争性财务利益。

实验方案中的关键步骤
本文介绍一种可最大限度减少胶质细胞微管和中间丝dSTORM成像中伪影的实验方案。样本制备和成像的每一步均可能产生伪影，包括固定、封闭、免疫标记、采集过程中的漂移以及非最佳闪烁条件23。以下是其中最关键的步骤。
清洁盖玻片是限制荧光染料在表面非特异性结合的重要步骤，从而降低dSTORM图像中的背景噪声。
我们建议使用戊二醛和吐温的混合液进行提取和固定（步骤3），随后用PFA（多聚甲醛）进行固定（步骤n°3）。该固定方案改编自Chazeau等人的研究12：我们将提取/固定步骤的孵育时间缩短至60秒（步骤3.4），从细胞骨架缓冲液中去除了葡萄糖，并省略了额外的通透步骤。该方法的优点在于可清除自由移动的细胞骨架亚基，从而实现背景更低的超分辨率成像12。总体而言，固定步骤至关重要，因为...

胞质中间丝（IF）是由特定细胞类型的IF蛋白亚群组成的直径为10 nm的同源或异源多聚体。IF参与多种细胞功能，如细胞运动、增殖和应激反应。超过90种人类疾病直接由IF蛋白的突变引起，这凸显了其关键作用；例如，IF成分的变化伴随肿瘤的生长与扩散1,2,3。越来越多的证据表明，三种细胞骨架系统协同作用，调控细胞极化、分裂和迁移等细胞功能2,3。由于空间结构与功能之间存在紧密耦合，深入了解IF与其他纤维之间的结构组织关系，以及更全面地理解细胞骨架间的相互作用至关重要。本文提供了一种进行超分辨率双色dSTORM（直接随机光学重建显微镜技术）4的实验方案，并介绍如何利用该技术在二维（2D）培养的固定细胞中研究IF与微管之间的相互作用。
过去十年中，多种超分辨率技术相继被开发出来，这些发现也成为了2014年诺贝尔化学奖的获奖基础5在所有这些技术中，基于单分子定位的方法（如PALM）尤为突出6 （光激活定位显微镜）使用光可切换荧光蛋白，STORM7 使用成对的荧光染料或dSTORM4 使用传统荧光染料。所有这些方法均基于同一原理，即（i）将大部分荧光报告分子切换至一种 &#34;关闭&#34; 状态&#34; （非荧光态），（ii）随机激活其中一部分分子进入荧光态，以纳米级精度确定其空间位置，以及（iii）重复该过程，以尽可能多地激活不同子集的荧光分子。最终图像通过整合所有被激活分子的定位信息重建而成，可实现约20–40 nm的横向分辨率。目前已有多种商用光学系统可供生物学家常规开展PALM/STORM实验。本研究采用其中一种系统来探究微管与中间纤维的结构关联。在所有基于单分子定位的方法中，选择了双色dSTORM技术，因其特别适用于观察极薄的层状区域（&#60;1 µm）的贴壁细胞，并且只需极少的时间和资金投入即可显著提高图像分辨率。事实上，dSTORM 是一种非常便捷且多功能的技术，可与常规用于细胞染色和免疫荧光的有机染料兼容。
虽然使用荧光染料Alexa647获取单色dSTORM图像相对简单8，但双色dSTORM需要优化实验条件，以确保两种染料在选定的缓冲液中均能正常闪烁，尤其是在激光功率有限的情况下。目前已有大量优秀文献详细介绍了dSTORM多色成像的方法9,10,11,12,13，这些文献深入阐述了可能产生伪影和图像分辨率下降的原因，并提供了相应的解决方案。本文描述了为在胶质细胞中利用双色dSTORM成像致密的细胞质中间纤维网络和微管结构，所需的最佳实验条件，包括细胞固定、免疫染色、样品制备、图像采集和图像重建。简而言之，我们对Chazeau等12所述的提取/固定方法进行了针对胶质细胞的优化，并增加了后固定步骤，同时优化了抗体浓度，采用Dempsey等9描述的含10 mM MEA的STORM缓冲液，该缓冲液被证实最适合本实验设置和样品类型。
胶质细胞主要表达三种类型的中间丝蛋白：波形蛋白（vimentin）、巢蛋白（nestin）和GFAP（胶质酸性纤维蛋白，glial acidic fibrillary protein）。已有研究表明，这三种蛋白可在星形胶质细胞中共同聚合14。我们先前利用超分辨率结构照明显微镜（SR SIM）发现，这三种中间丝蛋白可存在于同一条单一的中间丝纤维中，并且在胶质细胞中具有相似的分布模式和动态行为15。由于这三种中间丝蛋白之间具有相似性，因此使用波形蛋白的染色作为整个中间丝网络的报告标志。通过dSTORM技术，我们成功解析了中间丝沿微管形成束状结构的方式，而这是传统衍射受限显微技术无法实现的15。这些观察结果有助于理解波形蛋白中间丝如何作为模板引导微管组装，并调控其生长方向，从而在细胞迁移过程中维持极性轴的稳定16。超分辨率成像为两种细胞骨架子系统之间的相互作用提供了关键信息，并揭示了空间关联与局部功能之间的联系，这种联系可能具有细胞类型特异性17。总体而言，双色dSTORM技术可用于研究细胞骨架组分之间或其它类型细胞器之间的相互作用，前提是免疫染色在密度和特异性方面达到理想条件。该技术将有助于更深入地表征星形胶质细胞活化（astrogliosis）以及胶质母细胞瘤中观察到的细胞骨架变化——胶质母细胞瘤是中枢神经系统中最常见且恶性程度最高的肿瘤，其特征之一是中间丝蛋白的表达发生改变18,19,20,21。

<table><tbody><tr><td>最低必需培养基（MEM）</td><td>Gibco</td><td>41090-028</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>非必需氨基酸</td><td>Gibco</td><td>1140-050</td><td>细胞培养 1/100e</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>细胞培养 1/100e</td></tr><tr><td>F&amp;oelig;tal Bovine Serum</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td>细胞培养 1/10e</td></tr><tr><td>0.05% 胰蛋白酶-EDTA（1X）</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>PBS 10x</td><td>fischer scientific</td><td>11540486</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>盖玻片 18 mm n&amp;deg;1.5H</td><td>Marienfield/Dominic dutsher</td><td>900556</td><td>盖玻片</td></tr><tr><td>多聚甲醛（PFA）溶液</td><td>Sigma</td><td>F8775</td><td>细胞固定</td></tr><tr><td>戊二醛</td><td>Sigma</td><td>G5882</td><td>细胞固定</td></tr><tr><td>吐温 X-100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td>非离子型表面活性剂，用于细胞固定</td></tr><tr><td>硼氢化钠（NaBH4）</td><td>Sigma</td><td>452904-25ML</td><td>细胞固定</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td>样本封闭，PBS 中 3%</td></tr><tr><td>小鼠来源的单克隆抗波形蛋白（V9）抗体</td><td>Sigma</td><td>V6630</td><td>一抗</td></tr><tr><td>大鼠抗α微管蛋白抗体</td><td>Biorad</td><td>MCA77G</td><td>一抗</td></tr><tr><td>驴抗大鼠 IgG（H+L）二抗，Alexa Fluor 555</td><td>Fisher scientific</td><td>10635923</td><td>二抗</td></tr><tr><td>驴抗小鼠 IgG（H+L）二抗，Alexa Fluor 647</td><td>Fisher scientific</td><td>10226162</td><td>二抗</td></tr><tr><td>TetraSpeck 微球，0.1 &amp;micro;m，荧光蓝色/绿色/橙色/深红色</td><td>Fisher scientific</td><td>T7279</td><td>荧光微珠</td></tr><tr><td>Chamlide 磁性腔室</td><td>Live Cell Instrument</td><td>CM-B18-1</td><td>磁性样品架，最大体积 1.2 mL</td></tr><tr><td>半胱胺（MEA）</td><td>Sigma</td><td>30070</td><td>用于闪烁缓冲液</td></tr><tr><td>来自黑曲霉的葡萄糖氧化酶</td><td>Sigma</td><td>G0543</td><td>用于闪烁缓冲液</td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>sigma</td><td></td><td>用于闪烁缓冲液</td></tr><tr><td>来自牛肝的过氧化氢酶</td><td>Sigma</td><td>C9322</td><td>用于闪烁缓冲液</td></tr><tr><td>Tris（三羟甲基氨基甲烷）</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td>用于闪烁缓冲液</td></tr><tr><td>Wash-N-Dry 盖玻片架</td><td>Sigma</td><td>Z688568</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Sigma</td><td>P7793-1EA</td><td>石蜡膜</td></tr><tr><td>超声波清洗机</td><td>Fisher scientific</td><td>15-335-6</td><td></td></tr><tr><td>等离子清洗机</td><td>Harrick plasma</td><td>PDC-32G-2</td><td></td></tr></tbody></table>

利用二维直接随机光学重建显微镜成像中间丝和微管

Imaging Intermediate Filaments and Microtubules with 2-dimensional Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy

细胞骨架由肌动蛋白微丝、微管和中间丝（IF）组成，在调控细胞形态、极性和运动性方面发挥关键作用。肌动蛋白和微管网络的结构已被广泛研究，而中间丝网络的结构尚未被充分表征。中间丝的平均直径为10 nm，形成贯穿细胞质的网状结构。它们通过分子马达和细胞骨架连接蛋白与肌动蛋白和微管在物理上相互关联。这种紧密的关联是调控三种细胞骨架网络协调运作的核心机制，而这种协调对于大多数细胞功能至关重要。因此，单独观察中间丝以及将其与其他每一种细胞骨架网络共同可视化显得尤为关键。然而，在大多数细胞类型中，尤其是胶质细胞中，中间丝网络极为致密，这使得利用常规荧光显微镜（横向分辨率约250 nm）难以实现清晰分辨。直接随机光学重建显微技术（dSTORM）可将横向分辨率提高一个数量级。本文中，我们证明dSTORM的横向分辨率足以解析中间丝网络的致密结构，特别是围绕微管的中间丝束结构。这种紧密关联可能参与了这两种网络的协调调控，并可能解释波形蛋白中间丝如何作为模板稳定微管结构，以及如何影响依赖微管的囊泡运输。更广泛而言，我们展示了利用双色dSTORM技术同时观察两种细胞骨架组分，可为它们之间的相互作用提供新的见解。

用于呈现下述代表性结果的显微镜配备了50 mW 405 nm以及100 mW 488、561和642 nm的固态激光器、EMCCD 512x512相机、alpha Plan Apo 100X/1.46物镜，以及带通570-650 / 长通655发射滤光片。
图1A 展示了在原始图像采集过程中应采用的分子密度和信噪比示例。高质量图像要求相邻分子之间的距离至少约为 ~1 µm。在良好的闪烁条件下，荧光染料应仅在一个帧中出现。实现良好闪烁需要优化成像缓冲液条件（pH、还原剂、除氧系统）以及激光功率，这些因素会影响荧光染料的亮态与暗态转换速率，从而影响占空比（即荧光染料处于亮态的时间比例）9,11。图1B 则相反，展示了一幅分...

本方法学的总体目标是从样品制备到图像采集与重建，提供最佳实验条件，以在固定细胞中实现微管和中间丝的二维双色dSTORM成像。

细胞骨架由肌动蛋白微丝、微管和中间纤维（IF）组成，在调控细胞形态中发挥关键作用，……

本方法的总体目标是从样品制备到图像采集与重建的各个环节，建立最优的实验条件，以实现对固定细胞中微管和中间丝进行二维双色D-STORM成像。该方法有助于表征致密且复杂的细胞骨架网络（如中间丝与微管）之间的物理相互作用。该技术的主要优势在于，能够观察到传统荧光显微镜无法分辨的细胞结构。本方法的可视化演示至关重要，因为样品制备的控制以及robe-linking数据的获取对于限制人为假象的产生至关重要。按照文本方案培养U373细胞后，首先使用PBS洗涤细胞一次以进行固定。随后，移除PBS，并向每孔加入一毫升预热的提取固定液。将细胞在室温下孵育60秒。然后移除溶液，并每孔加入1毫升用细胞骨架缓冲液新鲜配制并预热的4%PFA。将12孔板放回37摄氏度的培养箱中孵育10分钟。然后去除PFA，每孔加入三毫升PBS。用PBS洗涤细胞两次。随后去除PBS，并加入新配制的、用PBS稀释的10毫摩尔的硼氢化钠，以淬灭戊二醛产生的自发荧光。将细胞在室温下孵育七分钟，并将回收的硼氢化钠转移至指定容器中。使用 PBS 每次五分钟，清洗孔板三次。随后吸除 PBS，并加入含 5% BSA 的 PBS 溶液作为封闭液。根据文本方案完成样本的免疫染色及缓冲液溶液的配制后，将含有标记细胞的盖玻片安装在磁性样品架上。加入成像缓冲液，完全填充样品腔。盖上盖片，并确保成像缓冲液与盖片之间无气泡存在。使用无水乙醇清洁样品底部，并检查是否存在泄漏。如有必要，使用润滑脂妥善密封样品 holder。进行成像时，打开显微镜及图像采集软件。根据文本方案设置采集参数，使用100倍NA 1.46物镜、1.6倍OptiVar镜片和TIRF UHP模式。创建647通道以成像用Alexa Fluor 647标记的波形蛋白丝。选择405 nm和642 nm激光线以及LP 655发射滤光片。然后，创建一个555通道以成像标记了Alexa Fluor 555的微管。选择561、488和405纳米激光线用于激发荧光染料，并使用BP 570至650发射滤光片。接着，在物镜上滴加镜油，并将样品置于物镜上。然后，选择“定位”选项卡并打开荧光灯的快门。找到焦平面，通过目镜观察待成像的细胞。接着使用操纵杆将细胞移至视野中央。单击采集选项卡，返回采集模式。然后选择647通道，将642激光功率设置为0.2%，将405激光功率设置为其最小值。将曝光时间设置为50毫秒，增益设置为50。然后选择连续采集模式以在屏幕上观察细胞。确保视野中至少有一个荧光微球。使用自动缩放模式显示图像，并调节焦距。接下来，通过点击“snap”拍摄并保存一张波形蛋白网络的宽场落射荧光图像。为检查全内反射荧光（TIRF）照明情况，点击“TIRF”，按“continuous”键，调整采集参数以获得均匀的照明视野，然后按“snap”拍摄并保存图像。选中555通道，取消选中647通道，并选择555通道。拍摄微管网络的落射荧光图像并保存。然后采集TIRF图像并保存。现在，检查647通道，取消选中555通道，并选择647通道。将增益设为零，曝光时间设为10毫秒。然后按下连续采集。将642纳米激光功率设为100%，以使大部分Alexa 647染料进入暗态。一旦荧光染料开始闪烁，将曝光时间增加至15毫秒，增益调至300。使用范围指示模式检查单分子信号是否导致相机饱和（以红色显示为标志）。若出现饱和现象，应降低增益直至饱和消失。在采集开始时，微珠将保持饱和状态。按下停止以终止对细胞的观察。展开在线处理工具，点击在线处理PALM，以在采集过程中可视化STORM图像。峰值掩模大小设置为九，峰值强度与噪声比设置为六。现在，按下“开始采集”。在采集过程中，如有必要，重新对细胞进行聚焦。调整曝光时间，并最终开启405纳米激光线，起始功率为0.001%，以保持荧光分子的中等密度，且单个分子之间的最小距离为一微米。确保重建图像下方直方图中的定位精度峰值居中在10纳米或更低。当定位数量超过一百万时，按下停止按钮以结束成像。使用 CZI 格式保存 STORM 采集的原始数据。然后在通道工具中，勾选 555 通道，取消勾选 647 通道，并选择 555 通道。接着，按下连续采集按钮。将曝光时间设置为30毫秒，增益设置为零。然后将488和561激光器均设为100%，以将Alexa 555染料泵入暗态。使用HILO照明模式。当荧光染料耗尽后，按下停止按钮。将增益设为 250，并将 488 激光降低至 50%。使用范围指示器检查单个分子是否使相机饱和。如果出现饱和情况，则降低增益。现在，按下开始采集。在采集过程中，逐步增加增益直至达到饱和极限。逐步增加405纳米激光功率以激活分子，并使视野中的分子密度达到中等水平。当405纳米激光功率约为15%时，将488纳米激光功率降低至30%。随后，在逐步降低488纳米激光功率的同时提高405纳米激光功率，以保持分子闪烁尽可能快速且密度适中。488纳米激光线与561纳米激发激光以最大强度联用时，可同时提高荧光分子的开启和关闭速率，而405纳米激光线仅提高其开启速率。当定位数量达到500,000个或以上，或不再有分子闪烁时，停止数据采集。然后以 CZI 格式保存 STORM 采集的原始数据。为了使用 PAL-Drift 工具进行图像重建，请选择基于模型的校正类型，并设置自动分段的最大尺寸为八。连续多次点击“应用”，直至漂移被校正。这种基于模型的校正方法采用基于互相关分析的算法来校正漂移。使用 PAL 滤波工具，通过仅选择定位最精确的分子来优化 STORM 图像的外观。例如，将定位精度限制在 30 纳米以内，点扩散函数（PSF）限制在 120 至 180 纳米之间。使用 PAL-Render 工具，采用 5 或 10 纳米的像素分辨率，并根据文本方案设置参数。选择“渲染自动高动态范围（HR）”，设定值为 95%，并选择“渲染自动 SWF 动态范围”，设定值为 90%。然后选择“最佳质量渲染”。在处理选项卡的 PALM 菜单中，选择 PALM 转换。按下选择，然后应用。最后，将生成的图像保存为 LSM 格式，而非 CZI 格式。该图展示了一个典型的D-STORM成像结果，其中波形蛋白丝通过Alexa 647进行免疫标记。与标准宽场显微镜所获得的图像相比，分辨率的提升清晰可见。本图中所示的荧光强度分布曲线表明，超分辨率显微成像能够分辨出波形蛋白束的精细结构。D-STORM 的分辨率足以用于计数束中存在纤维的数量。图中显示的是波形蛋白和微管网络的双色 D-STORM 成像典型示例，二者分别用 Alexa 647 和 Alexa 555 进行免疫标记。高质量的波形蛋白图像每平方微米应至少有 5,000 个定位点，微管图像每平方微米应至少有 2,500 个定位点。一旦掌握，若操作得当，该技术可在三天内完成。在进行此实验时，重要的是要根据待成像的蛋白质调整固定和参数化方法。例如，仅使用戊二醛进行固定对中间丝的成像效果较差，但最适合微管的固定。务必记住使用新制备的样品和溶液，尤其是MEA，其pH值需要仔细调节。该技术发展之后，为细胞生物学领域的研究人员探索纳米级细胞结构的形态开辟了道路。观看本视频后，您应能充分掌握如何进行样品制备、图像采集，以及中间纤维和微管的二维双色D-STORM图像的重建。请注意，操作某些溶液（特别是PFA和NABH4）时可能具有极高危险性，因此在进行本实验操作时，必须始终采取预防措施，例如佩戴手套、在通风橱内操作，并使用专用废弃物容器。

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科研

JoVE Journal

Biology

生物学

2维直接随机光学重建显微成像中间丝和微管

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动态相互作用三维结构分析的关联显微技术

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