Name: Del radionuclide-fluorescenza Reporter Gene Imaging per monitorare la progressione del tumore nei modelli del roditore del tumore (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 4 s
Description: Scopri l'imaging con reporter genico radionuclide-fluorescenza per monitorare la progressione tumorale nei modelli di roditori. Questa tecnica PET non invasiva riduce l'uso di animali e consente il tracciamento in tempo reale delle cellule cancerose.

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La ricerca è stata sostenuta dal King College di Londra e UCL completa cancro Imaging centro, finanziato da Cancer Research UK ed EPSRC in associazione con la MRC e DoH (Inghilterra); il National Institute for Health Research (NIHR) centro di ricerca biomedica sede di Guy e St. Thomas' s NHS Foundation Trust e College Londra del re; il centro di eccellenza in ingegneria medica finanziato dalla Wellcome Trust ed EPSRC sotto concessione numero WT 088641/Z/09/Z; un Cancer Research UK multidisciplinare progetto Award GOF e PJB grant Health Partners di un re a GOF. Gli scanner nanoPET/CT e nanoSPECT/CT sono stati acquistati e mantenuti da una sovvenzione attrezzature il Wellcome Trust. Le opinioni espresse sono quelle degli autori e non necessariamente quelle di NHS, la NIHR o il DoH.

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Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.

Il primo passo per eseguire il rendering cancro cellule rintracciabili nel vivo di questo metodo richiede ingegneria ad esprimere il reporter di fusione di NIS-FP. La scelta della proteina fluorescente al reporter di fusione è critica come oligomerizing proteine fluorescenti può condurre a reporter artificiale clustering, quindi influire negativamente sulla sua funzione. Abbiamo avuto successo con proteine fluorescenti monomeriche provate come mEGFP (con la mutazione monomerizing A206K36,37), mTagRFP o mCherry. NIS può essere di umani o origine del mouse (hNIS o msNIS) a seconda dello scopo dell'esperimento e il modello di cancro. L'efficienza di trasduzione varia generalmente tra linee cellulari tumorali differenti. Tuttavia, linee cellulari del cancro generato successivamente sono purificati mediante FACS in questo protocollo, riducendo così la necessità per l'ottimizzazione delle condizioni di trasduzione. Trasduzione con elevata molteplicità di infezione non è sempre consigliabile come più costrutto integrazione nel genoma è suscettibile di provocare non solo nella più alta espressione di costrutto, ma anche nella modifica di genoma più indesiderati/non regolamentata. Pertanto, è importante lasciare che policlonale di cellule trasdotte crescere alla stabilità dell'espressione (monitorata da citometria a flusso) ed evitare l'ordinamento i cloni più brillanti solo da FACS. Rende anche validazione funzionale delle caratteristiche di non-reporter cruciale prima che queste cellule dovrebbero essere utilizzate per gli esperimenti in vivo . Un'alternativa sviluppata di recente di consegna del gene virale è gene editing tecnologia38, che offre controllo più specifico sui siti di integrazione virale. Analisi dell'espressione mediante citometria a flusso e immunoblotting è importante. Citometria a flusso permette l'acquisizione dei dati basati sulla popolazione singola cella, ad esempio, per esaminare se c'è qualsiasi deriva nei livelli di espressione di reporter nel corso del tempo. Si basa sulla frazione FP solo, a meno che le cellule sono anche colorate con un anticorpo diretto contro NIS superficiale o totale. Citometria a flusso non informa sull'integrità del reporter di fusione. Al contrario, immunoblotting report sull'integrità del reporter fusione. Il peso molecolare di NIS e la FP deve essere aggiunto per determinare il peso molecolare previsto della selezionate NIS-FP confocale fluorescenza microscopia ha dimostrata fusione reporter colocalizzazione con l'agglutinina germe di grano marcatore di membrana plasmatica in tutto appena fatto di linee cellulari. Questa era la posizione cellulare prevista per la maggior parte della proteina e indicato una via libera pietra miliare per la successiva validazione funzionale. Se minimal/no NIS-FP è stato trovato sulla membrana plasmatica (ad es. solo in compartimenti cellulari interne), questo indicherebbe un problema biologico delle cellule con il reporter di fusione in questa linea cellulare, o una potenziale mutazione del reporter fusione che interessano la traffico intracellulare. È interessante nota che non abbiamo osservato un tal caso in una qualsiasi delle cellule tumorali abbiamo testato finora, che comprendeva: A375P, A375M2, SK-Mel28, WM983A/B (melanoma umano); MCF-7, MDA-MB-231, MDA-MB-436 (cancro al seno umano); NCI-H1975 (cancro polmonare umano); SK-Hep1 (cancro del fegato umano); 4T1, 4T1.2, 66cl 4, 67NR, FARN168 (cancro al seno infiammatorio murino); B16F0, B16F3, B16F10 (melanoma murino); MTLn3 (adenocarcinoma del seno del ratto).
Funzione di NIS dovrà essere misurati usando analisi di assorbimento con substrati radioattivi di NIS. A causa della SPECT radiotraccitore 99mTcO4– essere prodotta dal generatore e quindi ampiamente disponibile negli ospedali senza bisogno di alcuna sintesi radiotraccitore, oltre ad avere una più conveniente più lunga emivita (6,01 h per 99 m TC rispetto ai 110 min per 18F), abbiamo usato questo substrato di NIS per routine validazione funzionale di nuove linee di cellule esprimenti NIS-FP. Pre-blocco delle cellule che esprimono NIS con il perclorato di sodio co-substrato NIS ha provocato riduzione/abolishment previsto dell'assorbimento del radiotraccitore, dimostrando la specificità della captazione del radiofarmaco. Questo test di specificità di NIS è un passo critico convalida. Se un esperimento di specificità di NIS non comporterebbe l'assorbimento ridotto radiotraccitore paragonabile alle rispettive cellule parentali, o si è verificato un errore tecnico durante l'esperimento, o la captazione del radiofarmaco non era dovuto a NIS. È anche possibile che sodio perclorato pre-blocco riduce l'assorbimento del radiotraccitore in una linea cellulare parentale; Questo sarebbe identificare linee cellulari con espressione endogena di NIS funzionale (ad es. stimolata della tiroide cellule6).
Un vantaggio cruciale di questo protocollo di imaging è che informazioni sono raccolti in 3D e nel corso del tempo. Questo consente il confronto di immagini dall'animale stesso nel tempo, fornendo dati appaiati e superando così i problemi causati da variabilità. Questo contrasta con metodi di valutazione relative metastasi più non-imaging che si basano su sacrificare animali diversi intervalli di tempo diversi. In Figura 3B è evidente diffusione di come metastatico ed escrescenza progredito nel tempo in un singolo animale. I segnali rilevati da formazione immagine di PET/CT sono fondamentalmente causati dall'espressione di NIS. Questo include tutti i segnali da esogenicamente NIS-esprimendo le cellule tumorali, così come tutti gli organi in modo endogeno che esprimono NIS. Endogeno NIS tipici segnali sono trovati nella tiroide e ghiandole salivari, stomaco e, a livelli bassi in alcune parti delle ghiandole mammarie e lacrimale. Oltre a espressione endogena di NIS, NIS radiotraccitore [18F] BF4– anche è escreta attraverso i reni, quindi spiegare l'assorbimento del radiotraccitore in vesciche piene di urina. L'assorbimento del rene non è più rilevabile al punto imaging tempo raccomandato in questo protocollo (45 min post radiotraccitore iniezione6). Se i segnali da vesciche piene di urina dovrebbero portare a problemi di segnale--fondo, la vescica può essere svuotata meccanicamente sotto anestesia prima di formazione immagine. D'importanza, i segnali endogeni possono variare tra ceppi di animali. Si osserva inoltre che l'espressione endogena di NIS nelle ghiandole mammarie può essere superiore sotto allattamento condizioni10. Nel caso presentato e nei casi di quelle linee di cellule metastatico con successo caratterizzati prima (cfr. elenco sopra), non abbiamo trovato espressione endogena di NIS per interferire significativamente con rilevamento di metastasi. È degno di nota, che [18F] BF4– rimane più disponibile per l'assorbimento nei tessuti tumorali rispetto a ioduro, perché ioduro è metabolizzato in ormoni tiroidei6. Questo fenomeno potrebbe anche contribuire a quantità maggiori di radioiodio nel flusso sanguigno rispetto [18F] BF4- 6. Per diverse applicazioni (cellula tumorale in altri cancri o non-cancro cellula monitoraggio delle applicazioni di monitoraggio), questo potrebbe essere diverso, e si raccomanda pertanto di valutare se l'espressione endogena di NIS rischia di causare problemi di segnale--fondo attraverso esperimenti preliminari. Un aspetto importante nell'imaging preclinico è l'attività molare del radiotraccitore. Il metodo qui descritto utilizza ~1.5 GBq 18F– come materiale iniziale14 e ha dimostrato di produrre molare attività significativamente sopra il metodo di sostituzione precedentemente segnalati12. [18F] BF4– prodotta a molare attività ≤ 1 GBq/µmol12 può causare il minor assorbimento nei tessuti che esprimono NIS. Questo è di particolare importanza quando la quantità iniettata di radioattività per chilogrammo è alta, cioè quando sono piccoli animali come topi imaged39; è meno importante nell'essere umano l'impostazione40. Alta attività molare sono quindi imperativo per l'imaging PET preclinici di alta qualità. Molare attività ottenuti con il boro trifluoruro aggiunta metodo14, che è mostrata nella sua forma automatizzata in questo protocollo, superare questo problema. Inoltre, vale la pena nota che il protocollo presentato per la sintesi di4– BF [18F] non è conforme alle pratiche di buona fabbricazione (GMP) e quindi idonei ad essere utilizzati nei test clinici umani in questa forma. Un protocollo GMP (tramite il metodo di sostituzione 18F a medicinali BF4–) è disponibile altrove40.
Formazione immagine di PET/CT permette la visualizzazione della captazione del radiofarmaco, che è indicativo dell'assorbimento di NIS-mediata radiotraccitore derivanti dalle cellule tumorali che esprime NIS-FP. Ancora più importante, i segnali di PET associati possono essere quantificati. È necessario applicare procedure di soglia affidabili per garantire una differenziazione coerenza e imparziale dei segnali rilevanti da qualsiasi contesto potenziale. Come lo sfondo varia in diverse località in vivo, è importante considerare segmentazione e soglia di locali/regionali. Un tale metodo è stato sviluppato da e prende il nome di Otsu34, e la sua attuazione 3D è impiegato per il rendering 3D del tumore primario e metastasi in questo protocollo. In genere, l'immagine vista dall'osservatore visivamente corrisponde al meglio i valori di dose (% ID) quantificati % iniettato. Per quanto riguarda la quantificazione basata su immagine, è anche importante normalizzare i valori di radioattività misurata dei diversi tessuti ai loro volumi. Ci sono due modi principalmente usati esprimere i risultati normalizzati, (i) % ID per volume (ad es. %ID/mL) e valore (ii) standard di assorbimento (SUV35). Differiscono in quanto %ID/mL prende in considerazione il volume individuale solo, mentre il SUV è una misura che è relativo la radioattività media attraverso l'intero animale. È anche importante notare che imaging NIS rende il volume del tumore dal vivo (LTV) accessibile, perché le cellule morti/morendo non sintetizzare ATP non è più possibile importare radiotraccitore10. Questo spiega la grande area di basso segnale all'interno del tumore primario (tumore "a forma di ciambella") che indica aree di morte/necrosi del tumore delle cellule. La cosa importante, LTV era una misura molto più affidabile del carico del tumore rispetto al volume del tumore grezzo accessibile tramite le misure di pinza (che non prende in redditività conto e valuta solo le regioni del tumore superficiale).
Dei principali vantaggi di questa strategia di doppia modalità rilevamento è evidente quando la raccolta di tessuti dopo l'abbattimento degli animali. Guidato da immagini in vivo e assistito da cellule tumorali fluorescente durante la dissezione animale, piccole e profonde organi/metastasi anche può essere raccolto in modo affidabile. Metodologia di conservazione/sezionamento di tessuto congelato consente l'imaging di fluorescenza diretta di GFP senza l'esigenza di colorazione con un anticorpo anti-GFP, ma a scapito della conservazione del tessuto strutturale ridotta rispetto alla formalina-fisso metodologia di paraffina (FFPE). Quest'ultimo criticamente richiede anche anti-FP colorazione, perché il metodo FFPE è incompatibile con la conservazione intatta delle proteine fluorescenti (a causa di fissazione/disidratazione/rehydration). Mentre il segnale di fluorescenza è indicativo della presenza di cellule del tumore, è importante garantire che questa classificazione è confermata tramite le misure di radioattività ex vivo dei tessuti raccolti ('biodistribuzione'). Ex vivo misure di radioattività sono più sensibili di rilevamento visivo della fluorescenza, quindi può consentire l'identificazione del cancro cellula-dipendente di segnali che altrimenti rimarrebbero inosservati. Nel caso di un terminale sessione di imaging, è fondamentale notare con precisione la quantità iniettata radiotraccitore, nonché i tempi di misure di radioattività del radiotraccitore, iniezione animale, animale abbattimento e calibrato contatore a scintillazione misure di tessuti raccolti. Questo è fondamentale per garantire la correzione per il decadimento del radiotraccitore e quindi attivare analisi affidabile biodistribuzione.
Consente di imaging PET/CT ripetuto 3D non invasivo quantificazione della progressione del tumore, compresa la valutazione della diffusione metastatica a livello di tutto il corpo. Questa caratteristica è un vantaggio significativo rispetto ai metodi convenzionali, che spesso si basano su larghe coorti di animali che si sono sacrificati per la valutazione della progressione del tumore a diversi intervalli di tempo. I vantaggi di questo approccio basato su formazione immagine sono: (i) altamente sensibile non invasiva 3D in vivo quantificazione, (ii) una riduzione significativa del numero di animali dalla possibilità di ripetizione di imaging, (iii) l'acquisizione di dati appaiati longitudinali da successive sessioni di miglioramento delle statistiche escludendo variabilità, che a sua volta ulteriormente riduce il numero di animali, di imaging (iv) produzione di [18F] BF4– automatizzata alle attività specifiche ad alto e (v) il intrinseco opzione per ex vivo conferma nei tessuti mediante metodologie di fluorescenza quali microscopia o cytometry.
In vivo delle cellule di rilevamento sono un settore in crescita. Esso è stato alimentato da recenti progressi nella tecnologia, che ha provocato la risoluzione potenziata, limiti di rilevabilità e capacità di multiplex (tramite imaging multi-modale) di imaging. In questo protocollo, applichiamo questo concetto per monitorare la progressione del tumore, tra cui la metastasi delle cellule di cancro spontaneo in 3D da formazione immagine di ripetizione. Le applicazioni includono studi volti a svelare i meccanismi della metastasi delle cellule di cancro spontaneo. Ad esempio, le cellule del tumore tracciabili potrebbero essere utilizzate per studiare l'impatto delle componenti differenti delle cellule immuni (come presente/funzionale in ceppi animali di differenti livelli di immunocompromisation) il processo metastatico. Allo stesso modo, l'impatto dei singoli geni, nel ceppo animale o la linea cellulare di cancro, potrebbe essere studiato. Inoltre, il protocollo presentato potrebbe essere utilizzato per valutare/convalidare l'efficacia di farmaci specifici o concetti terapeutici sulla progressione del tumore. D'importanza, questa coppia di gene: radiotraccitore reporter per l'imaging PET (NIS: [18F] BF4–) potrebbe essere utilizzato anche per applicazioni di rilevamento differenti delle cellule. Ad esempio, diverse terapie cellulari attualmente stanno emergendo come promettenti approcci terapeutici. Questo include cellulare terapeutica per cancro trattamento41 ma anche trapianto42 e impostazioni44 43,di medicina rigenerativa. Corpo intero in vivo delle cellule di rilevamento sta diventando sempre più importante per lo sviluppo e la traduzione clinica della terapia cellulare, ad esempio, per valutare la sicurezza e per il monitoraggio della terapia.

Malattia metastatica è la causa per la maggior parte delle morti legate al cancro 1. Malgrado ricerche approfondite in processi metastatici, affidabile monitoraggio della metastasi del cancro in sistemi modello animale è difficile da raggiungere. I recenti progressi nelle tecnologie di imaging del corpo intero e approcci di imaging multimodali hanno permesso non invasiva in vivo delle cellule rilevamento2,3,4,5. Quest'ultimo può essere utilizzato come uno strumento per monitorare la presenza, la distribuzione, la quantità e la attuabilità delle cellule, in modo non invasivo e ripetutamente in un animale o un essere umano.
Lo scopo del metodo descritto qui è rintracciare longitudinalmente e in modo non invasivo le cellule tumorali in 3D in modelli di tumore roditore vivente. Utilizzando questo metodo, i ricercatori saranno in grado di quantificare con precisione la progressione del tumore, tra cui la diffusione metastatica in 3D. Rispetto alle tecniche tradizionali non basati su formazione immagine, questo metodo offre l'acquisizione di dati quantitativi con in gran parte ridotto numero di animali. Un'altra caratteristica di questo metodo è che permette di correlazione dell'imaging in vivo con analisi semplificata a valle ex vivo delle cellule rilevate nei tessuti raccolti dall'istologia o citometria a3,6.
La spiegazione razionale per lo sviluppo di questo metodo era quello di fornire uno strumento in vivo per il monitoraggio e la quantificazione del processo intero metastatico nei modelli del roditore del tumore. D'importanza, è stato progettato per ridurre al minimo l'uso di animali mentre allo stesso tempo riducendo la variabilità. Imaging non-invasivo a tutto il corpo longitudinale è perfettamente adatto per informare sulla conseguenza metastatica, per cui per sé è difficile prevedere con precisione il tempo e la posizione della sua comparsa. Imaging 3D corpo intero è stata quindi al centro dello sviluppo del metodo. Per chiudere il divario di scala tra il corpo intero in vivo imaging e potenziale a valle ex vivo conferma istologica, una multi-scala imaging approccio basato su un reporter dual mode del radionuclide-fluorescenza è stata adottato3, 6.
Tomografia a emissione di positroni (PET) è la più sensibile 3D corpo intero tecnologia di imaging attualmente disponibile che offre eccellente profondità penetrazione e la quantificazione assoluta7 con una risoluzione di < 1 mm8,9. Attualmente, preclinico cellula di rilevamento a livello di corpo intero di formazione immagine del radionuclide può rilevare in modo affidabile cellule alle densità di ~ 1.000 cellule per volume di 1 milione cellule3,6 con risoluzioni nella regione sub-millimetrica. A differenza di microscopia intravital, non riesce a rilevare cellule tumorali diffusione singola, ma non richiede interventi chirurgici (es. camere di finestra), non è limitato ad un piccolo campo di vista e non dalla dispersione e penetrazione del tessuto basso. Imaging di bioluminescenza fornisce un'alternativa economica, ma è associata con dispersione e problemi di assorbimento della luce, nonché la penetrazione di scarsa profondità e di conseguenza fortemente limitato nella quantificazione2. Formazione immagine whole-body di fluorescenza è stata utilizzata per l'acquisizione di immagini 3D, ma è molto meno sensibile rispetto a tecnologie bioluminescenza o radionuclidi2. Ciò nonostante, fluorescenza offre la possibilità di eseguire ex vivo l'analisi del tessuto a valle di cytometry o microscopia. Quest'ultimo chiude lo scala-gap tra macroscopica formazione immagine whole-body (risoluzione mm) e fluorescenza dei tessuti al microscopio analisi (µm risoluzione)3. Di conseguenza, le modalità del radionuclide e fluorescenza completano a vicenda, che vanno dal livello del corpo intero alla scala (sub-) cellulare.
Formazione immagine di gene reporter è ideale per cella prolungato monitoraggio come richiesto nella ricerca di metastasi. In questa applicazione è superiore alla cella diretto etichettatura come è (i) non interessato da diluizione di etichetta e così non è limitato nel tempo di monitoraggio e (ii) meglio riflette i numeri di cellule vive. Di conseguenza, tutto il corpo cellulare di monitoraggio è particolarmente utile per applicazioni in cui tracciabili cellule proliferano o espandono in vivo, per esempio nel cancro ricerca3,6, per la rilevazione della formazione di teratoma nel tronco ricerca di cella, o per la quantificazione di immune delle cellule espansione5.
Vari geni reporter del radionuclide-based sono disponibili2. Questi includono gli enzimi come la chinasi della timidina di HSV11 del virus di simplex di erpete (HSV1 -tk), trasportatori quali lo symporter dello ioduro di sodio (NIS) o il trasportatore della noradrenalina (NET), così come i recettori di superficie quali la dopamina D2 receptor ( D2R). NIS è una proteina trans-membrana glicosilata media attivamente la captazione di iodio, per esempio nelle cellule follicolari nella ghiandola tiroide per la successiva sintesi di ormoni tiroidei10. Questo processo è guidato da symport di Na+ e si basa sul gradiente cellulare di sodio, che viene mantenuto dal Na+/k+-ATPasi11. Di conseguenza, NIS rispecchia meglio la vita cellulare numeri rispetto altri reporter come captazione dello ioduro/radiotraccitore è collegato a un attivo Na+/k+ gradiente piuttosto che la semplice presenza del trasportatore. Tradizionalmente, è stato utilizzato radioiodio per l'imaging di NIS. Per il rilevamento delle cellule, alternative radiotraccianti NIS che non sono metabolicamente intrappolate nella tiroide sono stati segnalati essere superiore6. Questo recentemente sviluppato PET radiotraccitore [18F] tetrafluoroborate ([18F] BF4–)12,13 Mostra una farmacocinetica superiore rispetto al radioiodio6 pur essendo disponibile alle attività specifiche ad alto14 senza la necessità di strutture complesse radiochimica. [18F] BF4– possono essere sintetizzati tramite due modi diversi. Il primo metodo si basa sullo scambio di isotopo non radioattivo 19F a BF4– con radioattivo 18F12. Il secondo metodo è attraverso l'aggiunta di 18F a trifluoruro di boro non radioattivo14. Quest'ultimo metodo è stato segnalato per produrre maggiore attività specifiche14 ed è il metodo di scelta per l'imaging preclinico.
NIS è altamente espresso nei tessuti della tiroide. Essa si esprime anche nelle ghiandole mammarie salivare, lacrimale e durante l'allattamento, così come lo stomaco, ma a livelli inferiori rispetto alla ghiandola tiroide10. Quindi, la formazione immagine eccellente contrasto in altre regioni del corpo può essere raggiunto utilizzando NIS. È anche altamente omologo tra umani, ratto e topo10. Inoltre, ci sono rapporti di tossicità su espressione ectopica di NIS in cellule non-thyroidal. D'importanza, NIS non inoltre è stato associato con le risposte immunitarie ospite, in esseri umani né nei roditori. NIS è stato usato come un gene reporter per misurare promotore attività15,16,17 e gene espressione18,19,20,21,22 ,23 in molti contesti diversi. Esso è stato utilizzato anche per l'imaging non invasivo del gene terapia vettori24,25e per tenere traccia di cellule cardiache4, ematopoietico26, infiammazione5e studi neurali27. Recentemente, NIS è stato utilizzato anche come un gene reporter per metastasi di cancro in vivo3,6.
In sintesi, i principali vantaggi di questo metodo rispetto alle tecniche precedenti sono: (i) altamente sensibile non invasiva 3D in vivo localizzazione e quantificazione di metastatico diffuso, (ii) automatizzata produzione di [18F] BF4– alta attività molare, (iii) una riduzione significativa di animali necessari mediante imaging longitudinale, (iv) l'acquisizione di dati appaiati da successive sessioni di formazione immagine con conseguente miglioramento dei dati statistici, che a sua volta ulteriormente riduce l'uso di animali e (v) l'opzione intrinseco per conferma ex vivo di cellule tumorali nei tessuti da microscopia cytometry o fluorescenza.

<table><tbody><tr><td>Passaggio 1) Ingegnerizzazione e caratterizzazione di cellule tumorali per esprimere il reporter di fusione radionuclide-fluorescnece NIS-FP.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2'-(4-etossifenil)-5-(4-metil-1-piperazinil)-2,5'-Bi-1H-benzimidazolo</td><td>Thermo Scientific</td><td>H3570</td><td>Nome banale: Hoechst 33342; Numero CAS: 23491-52-3; Hoechst 33342, Tricloridrato, Triidrato - 10 mg/mL Soluzione in Acqua.</td></tr><tr><td>Linea cellulare per carcinoma mammario murino 4T1</td><td>ATCC</td><td>CRl-2539</td><td>per i dettagli consultare il sito web ATCC</td></tr><tr><td>Contatore automatico di cellule, ad es. CASYCounter</td><td>Roche Diagnostics GmbH</td><td>5651697001</td><td>CASY Model TT Cell Counter and Analyzer CASYclean</td></tr><tr><td>Reagente di pulizia</td><td>Sedna Scientific</td><td>2501036</td><td></td></tr><tr><td>CASYton Diluente isotonico</td><td>Sedna Scientific</td><td>2501037</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio a fluorescenza confocale, es. Leica TCS SP5</td><td>Leica, Wetzlar, Germania</td><td></td><td>Dotato di Plan-Neofluor 25&times; 0,5NA e Plan-Apochromat 63&volte; Obiettivi UV a olio 1.4NA e laser a diodi (405 nm), ioni di argon (458, 477, 488, 496, 514 nm) e HeNe (543 e 633 nm); Per l'acquisizione e l'analisi delle immagini è stato utilizzato un software Leica LAS AF Lite 4.0.11706 (Leica Microsystems CMS GmbH) per l'acquisizione e</td></tr><tr><td>l'analisi dei vetrini coprioggetti n. 1,5 spessore</td><td>VWR International</td><td>631-0150</td><td></td></tr><tr><td>Dabco</td><td>Sigma</td><td>290734</td><td>Stock 125 mg/mL</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma</td><td>D5546</td><td>Supplement con il 10% (v/v) di FBS e L-glutammina (2 mM) per costituire il terreno di crescita ottimale per le cellule MDA-MB-231.</td></tr><tr><td>Selezionatore FACS, ad es. BD FACSAria III&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Dotato di un software BD FACS DIVA, un sistema a 6 laser (laser a 375/405/488/561/633 nm) - cellule selezionate con un 100 &mu; Ugello m con pressione di flusso inferiore a 20 psi, estensione della finestra di 2,0 &MU; m, Filtro a densità neutra 2.0 e tensione di piastra 3 kV</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>Sigma</td><td>F9665</td><td>Calore inattivato a 56 gradi; C per 30 minuti</td></tr><tr><td>Contatore gamma automatizzato, ad es. 1282 Compugamma</td><td>LKB Wallac Laboratory</td><td></td><td>99mTc-pertecnetato finestra di energia 110-155 keV&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Finestra di energia 18F 175-220 keV</td></tr><tr><td>Hoechst 33342 soluzione</td><td>Life Technologies</td><td>H1399</td><td>1-3 &micro; g/mL; Al suo posto è possibile utilizzare DAPI (di vari fornitori).</td></tr><tr><td>Soluzione di L-glutammina</td><td>Sigma</td><td>G7513</td><td>200 mM concentrata, filtrata sterile</td></tr><tr><td>Polietilenemina lineare (PEI)</td><td>Polyscience</td><td>23966-2</td><td>Lineare, 25 kDa; reagente di trasfezione per linea cellulare 293T.</td></tr><tr><td>MDA-MB-231 cellule di carcinoma mammario umano</td><td>ATCC</td><td>HTB-26</td><td>per i dettagli vedere il sito web ATCC</td></tr><tr><td>Mowiol 4-88</td><td>Sigma</td><td>81381</td><td></td></tr><tr><td>pLNT SFFV NIS-mEGFP</td><td>richiesta dal nostro laboratorio</td><td>n/a</td><td>Per i dettagli (generazione e mappe) vedere Informazioni supplementari</td></tr><tr><td>pLNT SFFV NIS-mCherry</td><td>richiesta dal nostro laboratorio</td><td>n/a</td><td>Per i dettagli (generazione e mappe) vedere le informazioni supplementari</td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>#12259</td><td>plasmidi che codifica per l'involucro VSV-G</td></tr><tr><td>pRRE</td><td>Addgene</td><td>#12251</td><td>plasmide di imballaggio</td></tr><tr><td>pRSV-Rev</td><td>Addgene</td><td>#12253</td><td>plasmide di imballaggio</td></tr><tr><td>Soluzione di paraformaldeide 4 % (p/v) in PBS</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-281692</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-streptomicina</td><td>Sigma</td><td>P43330</td><td>Contenente penicillina (10.000 unità/mL) e streptomicina (10 mg/mL),</td></tr><tr><td>soluzione salina tamponata con fosfato filtrato sterile (PBS)</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td>pH 7.4, filtrato sterile e senza cloruro di calcio e cloruro di magnesio</td></tr><tr><td>Poli(alcol vinilico - acetato di vinile)</td><td>Polysciences</td><td>17951</td><td>Nome banale: Mowiol 4-88; Numero CAS: 9002-89-5</td></tr><tr><td>Puromicina dicloridrato</td><td>Sigma</td><td>P8833</td><td>Da Streptomyces alboniger, ricostituito in acqua sterile&nbsp;</td></tr><tr><td>Centrifuga da banco, ad es. Rotina 380 R Centrigfuge da banco</td><td>Hettich Lab Technology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Sigma</td><td>R0883</td><td>Integratore con il 10% (v/v) di FBS e L-glutammina (2mM) per costituire il terreno di crescita ottimale per le cellule 4T1.</td></tr><tr><td>SFCA Filtro per siringa 0,45 &mu; m</td><td>Siringhe per corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 mL</td><td>BD Emerald</td><td></td><td>Siringhe monouso non sterili Microscopio</td></tr> a <tr><td>fluorescenza per colture tissutali, ad es. EVOS-FL&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td></td><td>Cell Imaging System dotato di un obiettivo 10> (PlanFL PH2, 10&times;/0.25, &infin;/1.2) e di una telecamera a colori</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA solution 10X&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>59418C</td> <td>(0,5 % (p/v) tripsina, 0,2 % (p/v) EDTA) gamma irradiato mediante processo SER-TAIN e senza rosso fenolo.</td></tr><tr><td>Germe di Grano Agglutinina Alexa Fluor 633 Coniugato&nbsp;</td><td>Tecnologie per la vita&nbsp;</td><td>W21404</td><td>Usato a 1:1000 (2 &micro; g/mL) per l'immunofluorescenza cellulare</td></tr><tr><td>Fase 2) Istituzione di modelli tumorali in vivo.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Calibro digitale</td><td>World Precision Instruments</td><td>501601</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano 1000 mg/g</td><td>Isocare</td><td></td><td>Per inalazione</td></tr><tr><td>Torcia a fluorescenza, ad es. Torcia a fluorescenza NightSea DFP-1</td><td>Scienze della microscopia elettronica</td><td>SFA-LFS-RBS/GR</td><td>Dotato di filtri di emissione GFP e RFP e occhiali filtranti NightSea (DFP-1)</td></tr><tr><td>Siringhe 0,3 mL U-100 insulina</td><td>Terumo</td><td></td><td>29G &volte; 1/2'' - 0,33 &volte; 12 mm</td></tr><tr><td>Materiali/attrezzature standard per la tecnica asettica e la manutenzione</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>degli animaliPassaggio 3) Produzione di [18F]BF4- utilizzando una piattaforma di sintesi radiotracciante automatizzata.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15-crown-5</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>188832</td><td>CAS 33100-27-5</td></tr><tr><td>Acetonitrile (anidro)</td><td>Acros Organics</td><td>326811000</td><td></td></tr><tr><td>trifluoruro di boro dietil etere</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>216607</td><td>BF3. OEt2, purificato mediante ridistillazione, &ge; 46,5 % BF3. Piattaforma CAS 109-63-7</td></tr><tr><td>Automated Radiotracer Synthesis (ARS), ad es. cassette monouso FASTLab</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>per piattaforma ARS, ad es. cassette FASTLab GE</td><td>Healthcare</td><td></td><td>FASTlab Developer pack</td></tr><tr><td>Polygram Alox N/UV254 lastre di poliestere</td><td>Macherey-Nagel</td><td>802021</td><td>RadioTLC, 40& </td></tr><tr><td>Cartuccia a scambio anionico forte da 80 mm, ad es. Sep-Pak Accell Plus QMA Plus Light</td><td>Waters</td><td>WAT023525</td><td>Condition con 1M NaCl (10 mL) e H2O (10 mL)</td></tr><tr><td>Cartuccia neutra di allumina, ad es. Sep-Pak Alumina N Plus</td><td>Light Waters</td><td>WAT023561</td><td>Condition con H2O (10 mL), acetone (10 mL) e aria (20 mL)</td></tr><tr><td>Acqua per preparazioni iniettabili USP</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Azoto filtro</td><td>Millipore</td><td>SE2M049I05</td><td>Sterile 0,2 &; micro; m FG Millex 13 mm</td></tr><tr><td>Step 4) In vivo imaging di cellule che esprimono NIS-FP mediante nanoPET/CT.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane 1000 mg/g</td><td>Isocare</td><td></td><td>Per inalazione</td></tr><tr><td>Strumento di imaging multimodale PET/CT preclinico, ad es. nanoScan PET/CT</td><td>Mediso Medical Imaging System, Budapest, Ungheria</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Torcia a fluorescenza, ad es. Torcia a fluorescenza NightSea DFP-1</td><td>Microscopia elettronica Scienze</td><td>SFA-LFS-RBS/GR</td><td>Dotato di filtri di emissione GFP e RFP e occhiali filtranti NightSea (DFP-1)</td></tr><tr><td>Camera di induzione per anestesia per roditori</td><td>Vet-Tech</td><td>AN010R</td><td>Con valvole a tre vie (x2), connettore per tubo di ingresso, tubo in PVC per ingresso gas (2 m) e tubo di evacuazione da 22 mm (2 m)</td></tr><tr><td>Sistema di anestesia per roditori</td><td>Vet-Tech</td><td>AN001B</td><td>Include maschera facciale per animali di dimensioni adeguate per l'animale di interesse e vaporizzatore di isolflurano</td></tr><tr><td>Soluzione fisiologica sterile</td><td>Thermo Scientific Oxoid</td><td>BO0334B</td><td></td></tr><tr><td>Siringhe 0,3 mL U-100 insulina</td><td>Terumo</td><td></td><td>29G &volte; 1/2'' - 0,33 &volte; 12 mm, per iniezione endovenosa di radiotracciante</td></tr><tr><td>Scavenger veterinario</td><td>Vet-Tech</td><td>AN200</td><td>Meccanismo di pesatura del filtro VetScav - 240 V con compensazione automatica della temperatura e sistema LED</td></tr><tr><td>5) In vivo analisi dei dati.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tera-Tomo Algoritmo iterativo 3D completo basato su Monte Carlo</td><td>Mediso Medical Imaging System, Budapest, Ungheria</td><td></td><td></td></tr><tr><td>VivoQuant Software</td><td>Invicro LLC., Boston, USA</td><td></td><td></td></tr><<tr><td>strong>6) Ex vivo analisi</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2- Metilbutano&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>59070-1L-D</td><td>Pre-raffreddato su azoto liquido per congelare i tessuti inclusi in OCT Albumina</td></tr><tr><td>sierica bovina (BSA)</td><td>Sigma</td><td>85040C</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini coprioggetti 22& 50 mm</td><td>VWR International</td> SMITMCQ211022X50 Cryostat, <td></td> ad es. Cryostat MNT SLEE Medical Macchina per l'inclusione <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>di istologia modulare in due pezzi dotata di un modulo di inclusione, un vano di stoccaggio dei tessuti e una piastra fredda</td>Cy5 AffiniPure Goat anti-Rabbit IgG (H+L)Jackson/Stratech 111-175-144 Utilizzato a 1:500 (2 &;<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> g/mL)</td></tr><tr><td>Dabco</td><td>Sigma</td><td>290734</td><td>Stock 125 mg/mL</td></tr><tr><td>Lame per microtomo, ad es. Feather S35&nbsp;</td>Microscopio a fluorescenza <td>CellPath</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(a campo largo o confocale), ad es. Microscopio a fluorescenza invertita Nikon Eclipse Ti-E</td><td>Nikon</td><td></td><td>dotato di 10&times;, 20&times; (aria) e idealmente 40&volte; obiettivi (olio) e laser/filtri o cubi filtranti, rispettivamente, adatti per il contatore gamma automatizzato Hoechst 33342, GFP e Cy5</td></tr><tr><td>, ad es. 1282 Compugamma</td><td>LKB Wallac Laboratory</td><td></td><td>99mTc-pertecnetato finestra di energia 110-155 keV, 18F finestra di energia 175-220 keV</td></tr><tr><td>Hoechst 33342 soluzione</td><td>Life Technologies</td><td>H1399</td><td></td></tr><tr><td>Adattatore a fluorescenza per microscopio da dissezione, ad es. Adattatore NightSea Microscopia</td><td>elettronica Scienze</td><td>SFA-LFS-RBS/GR</td><td>Dotato di filtri di emissione GFP e RFP</td></tr><tr><td>Composto O.C.T.</td><td>VWR international</td><td>361603E</td><td></td></tr><tr><td>Penna a cera, ad es. PAP-PEN</td><td>Dako UK Ltd</td><td></td><td>Penna a cera per disegnare intorno alla sezione di tessuto per ridurre i volumi di soluzione di colorazione/lavaggio necessari Soluzione</td></tr><tr><td>di paraformaldeide 4 % (p/v) in PBS</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-281692</td><td></td></tr><tr><td>Coniglio anti-CD31</td><td>Abcam</td><td>ab28364</td><td>Anti-topo policlonale utilizzato 1:50 (20 &; g/mL) per l'immunofluorescenza dei tessuti</td></tr><tr><td>Vetrini per microscopio, ad es. vetrini Superfrost</td><td>VWR, Lutterworth, Regno Unito</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con tris (TBS)</td> <td>disponibili presso vari fornitori.</td><td></td><td>Soluzione salina tamponata con Tris; 150 mM di NaCl, 25 mM di Tris/HCl a pH 7,4</td></tr></tbody></table>

del radionuclide-fluorescenza reporter gene imaging per monitorare la progressione del tumore nei modelli del roditore del tumore

Radionuclide-fluorescence Reporter Gene Imaging to Track Tumor Progression in Rodent Tumor Models

La metastasi è responsabile della maggior parte dei decessi per cancro. Malgrado ricerche approfondite, la comprensione meccanicistica dei complessi processi che regolano la metastasi rimane incompleta. Modelli in vivo sono di primaria importanza per la ricerca di metastasi, ma necessitano di perfezionamenti. Rilevamento delle metastasi spontanea da non invasiva in vivo imaging è ora possibile, ma rimane impegnativo in quanto richiede osservazione da lungo tempo e alta sensibilità. Descriviamo un longitudinale combinato del radionuclide e fluorescenza corpo intero in vivo imaging approccio per il tracciamento di progressione del tumore e metastasi spontanea. Questa metodologia di gene reporter impiega lo symporter dello ioduro di sodio (NIS) fuso ad una proteina fluorescente (FP). Le cellule tumorali sono progettate per NIS-FP espressione seguita da selezione basata sulla fluorescenza-attivato delle cellule l'ordinamento. Corrispondenti modelli di tumore sono stabiliti nei topi. NIS-FP che esprimono le cellule tumorali sono monitorati in modo non invasivo in vivo a livello di corpo intero di tomografia a emissione di positroni (PET) usando il NIS radiotraccitore [18F] BF4–. PET è attualmente il più sensibile in vivo imaging tecnologia disponibile a questa scala e consente la quantificazione affidabile ed assoluta. Metodi attuali si basano su larghe coorti di animali che si sono sacrificati per la valutazione di metastasi a diversi intervalli di tempo, o si affidano a malapena quantificabili imaging 2D. I vantaggi del metodo descritto sono: (i) altamente sensibile non invasiva in vivo imaging PET 3D e quantificazione, (ii) produzione automatizzata di PET tracer, (iii) una riduzione significativa del numero di animali necessario dovuto ripetere opzioni di imaging, (iv). l'acquisizione di dati appaiati da successive sessioni di formazione immagine fornire meglio i dati statistici e (v) l'opzione intrinseco per conferma ex vivo di cellule tumorali nei tessuti di microscopia di fluorescenza o cytometry. In questo protocollo, descriviamo tutti i passaggi necessari per routine NIS-FP-accordata non invasiva in vivo cancro cella rilevamento mediante PET/CT ed ex vivo conferma di risultati in vivo . Questo protocollo ha applicazioni oltre la ricerca sul cancro, ogni volta che la localizzazione in vivo , l'espansione e monitoraggio da lungo tempo di una popolazione delle cellule è di interesse.

Descriviamo un protocollo per il rilevamento di preclinici in vivo della metastasi del cancro. Si basa su un reporter del radionuclide-fluorescenza combinando lo symporter dello ioduro di sodio, rilevato da non-invasiva [18F] tetrafluoroborate-PET e una proteina fluorescente per semplificata ex vivo conferma. Il metodo è applicabile per preclinici in vivo delle cellule di rilevamento di là di biologia del tumore.

Del radionuclide-fluorescenza Reporter Gene Imaging per monitorare la progressione del tumore nei modelli del roditore del tumore

Metastasis is responsible for most cancer deaths. Despite extensive research, the mechanistic understanding of the complex processes governing metastasis ...

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di monitorare la crescita tumorale e le metastasi nei roditori vivi tramite imaging. Un reporter di fusione a fluorescenza con radionuclidi consente il rilevamento non invasivo in vivo mediante tomografia a emissione di positroni, con il fluoroforo che aiuta la conferma ex vivo dei risultati. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave ogni volta che le cellule devono essere tracciate in animali vivi per un periodo di tempo prolungato.Può contribuire alla comprensione delle metastasi a distanza e dell'impatto dei trattamenti sulla progressione del tumore. La tecnica descritta è il tracciamento delle cellule tumorali mediante imaging in vivo altamente sensibile e non invasivo con un tracciante PET prodotto mediante sintesi automatizzata. Offre una significativa riduzione dell'uso di animali rispetto alla metodologia convenzionale.Le persone che non conoscono questo metodo possono sentirsi sopraffatte dalla sua complessità. In particolare, la sintesi automatizzata del radiotracciante PET semplifica notevolmente questo processo. Riteniamo che la dimostrazione visiva di questo metodo dimostri queste visioni dei passaggi critici associati all'imaging.Le implicazioni di questa tecnica si estendono ai test preclinici di nuove terapie che possono anche essere monitorate insieme alle cellule tumorali. Questo metodo può fornire informazioni sulla biologia del cancro e sullo sviluppo di trattamenti. Ogni volta che la localizzazione, il trasferimento, l'espansione e il monitoraggio a lungo termine di una certa popolazione sono di interesse.Per iniziare, utilizzare plasmidi genici reporter, generare particelle di lentivirus, trasdurre le cellule e caratterizzarle. Quindi analizzare la funzione del gene reporter mediante l'assorbimento del radiotracciante nelle linee cellulari che esprimono NISFP. Semina le cellule purificate e il terreno di crescita in piastre a sei pozzetti, assicurandoti che tutti i campioni siano preparati in triplice copia.La mattina successiva lavare le cellule con terreno di crescita libero da siero e incubare le piastre con 50 kg di becquerel di tetrafluoroborato F18 a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Quindi raccogliere il surnatante e trasferire 100 microlitri in una provetta di raccolta pre-etichettata. Scartare il surnatante rimanente, quindi lavare le cellule con un millilitro di PVS ghiacciato contenente calcio e magnesio a livelli fisiologici.Raccogliere la soluzione di lavaggio e trasferire 100 microlitri di soluzione di lavaggio in una provetta di raccolta pre-etichettata. Quindi ripetere il processo di lavaggio ancora una volta. Aggiungere 500 microlitri di PVS contenente sia tripsina che EDTA per sollevare le cellule.Incubare i campioni a 37 gradi Celsius fino a quando le cellule non si staccano, utilizzando un microscopio per verificare il distacco. Quindi trasferire la sospensione cellulare in una provetta di raccolta etichettata. Quindi, centrifugare i campioni di cellule a 250 G per quattro minuti a quattro gradi Celsius.Utilizza un contatore gamma automatizzato per contare i campioni di ciascuno dei quattro tipi di campione e ottenere la percentuale di captazione utilizzando l'equazione uno. Per iniziare la sintesi del tetrafluoroborato F18, impostare la piattaforma di sintesi radio automatizzata in una cappa chimica appropriata e assicurarsi che il file XML corretto sia caricato sul computer di controllo. Mentre il sintetizzatore è in funzione, il tetrafuoroborato F18 verrà prodotto e quindi purificato su una cartuccia a scambio anionico.La cartuccia a scambio anionico verrà risciacquata con acqua e quindi asciugata con azoto gassoso. Il prodotto finale viene alluso dalla cartuccia a scambio anionico con un millilitro di cloruro di sodio allo 0,9% e trasferito in una fiala di raccolta in vetro attraverso la linea di uscita. Per iniziare l'imaging, anestetizzare e preparare i topi secondo il protocollo scritto.Quindi utilizzare soluzione fisiologica sterile allo 0,9% per diluire la soluzione di tetrafluoroborato F18 a 5 megabecquerel per 50 microlitri. Utilizzare una siringa con ago ipodermico per aspirare 100 microlitri della soluzione di tetrafluoroborato F18. Misurare la radioattività nella siringa e registrare il valore e l'ora della misurazione.Somministrare 50 microlitri della soluzione di tetrafluoroborato F18 nella coda preriscaldata per via endovenosa. Quindi misurare la radioattività rimanente nella siringa e registrare il valore e l'ora della misurazione. L'iniezione del radiotracciante nella vena caudale è fondamentale.Lo eseguiamo in anestesia animale per ridurre al minimo il rischio di iniezione errata e fuoriuscita di radiotracciante. L'animale rimane sotto anestesia fino all'inizio dell'acquisizione dell'immagine PET. Esattamente 45 minuti dopo l'iniezione del radiotracciante.Quindi, imposta un timer per il conto alla rovescia da 45 minuti e assicurati che il mouse sia posizionato sul tavolo in posizione sternale. Installare gli strumenti di monitoraggio chirurgico appropriati e assicurarsi che gli strumenti funzionino correttamente prima di andare avanti. Quindi, impostare i perametri per l'imaging TC e l'acquisizione delle immagini PET.Quando il timer del conto alla rovescia segna 15 minuti, inizia l'acquisizione dell'immagine CT e quando il timer segna zero minuti, inizia l'acquisizione dell'immagine PET. Per prima cosa misurare la radioattività dell'intero topo soppresso e registrare il valore e l'ora della misurazione. Quindi sezionare i topi e raccogliere i tessuti necessari.Misurare la radioattività della carcassa rimanente con e senza la coda. Registrare questi valori e annotare i tempi di misurazione. Successivamente, pesare singolarmente tutti i tessuti prelevati e scattare fotografie degli organi cancerosi alla luce del giorno e alla luce della fluorescenza.Quindi, incorporare i tessuti nell'OCT per l'istologia a valle. Misurare la radioattività di tutti i tessuti prelevati, registrare il valore e annotare il tempo di misurazione. Infine, presentare i dati come valori di assorbimento standard o SUV come descritto nell'equazione due.In questo esperimento, l'imaging genico del registratore di florescenza di radionuclidi è stato utilizzato per monitorare la progressione del tumore in un modello di tumore di roditore. La microscopia a fluorescenza confocale ha dimostrato un'accurata localizzazione della membrana plasmatica delle NISFP. La funzione e la specificità del NISFP sono state quantificate utilizzando l'assorbimento del radiotracciante da parte del NIS.Non sono state osservate differenze significative tra linee cellulari che esprimono 4T1NISGFP e 4T1NISRFP con livelli di espressione di NIS simili. È importante sottolineare che il blocco del preclorato ha dimostrato in tutte le linee cellulari che l'assorbimento del radiotracciante ottenuto è dovuto all'espressione specifica di NISFP. L'imaging PET di tutto il corpo di animali portatori di tumore ha rivelato informazioni sulla progressione del tumore e sulla diffusione metastatica.L'esempio mostrato qui mostra estese metastasi lunghe con diversi noduli distinti nel polmone. I valori percentuali della dose iniettata e i volumi occupati di metastasi individuali nei polmoni variavano. Tuttavia, i valori della dose iniettata percentuale normalizzata per il volume erano all'interno di un intervallo simile.La proteina fluorescente nel gene reporter a doppia modalità ha permesso l'identificazione del tessuto canceroso sotto la luce di florescenza durante la dissezione animale. La successiva biodistribuzione ex vivo del radiotracciante ha rivelato organi con un elevato assorbimento di radiotraccianti e quindi tessuti che esprimono NIS. Mentre la tiroide e le ghiandole salivari, così come lo stomaco, esprimono intrinsecamente NIS, tutti gli altri segnali positivi sono indicativi di tessuti cancerosi come il tumore e le metastasi.Il reporter a fluorescenza con radionuclidi consente inoltre l'identificazione delle cellule tumorali nelle sezioni di tessuto a valle. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo del cancro per visualizzare il processo di metastasi spontanea e per testare come i farmaci lo influenzano. Durante il tentativo di questa procedura, è importante pianificare attentamente tutti i passaggi in anticipo.Devono essere stabilite linee cellulari, devono essere allestiti modelli di tumore animale e tutti i reagenti e le apparecchiature per l'imaging devono essere disponibili il giorno richiesto. Consigliamo piccoli esperimenti pilota per iniziare. Una volta padroneggiata, la produzione di radiotraccianti e l'imaging animale in vivo possono essere eseguiti con sei animali in una giornata lavorativa di otto ore, se eseguiti correttamente.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come approcciare un gene reporter offerto dal tracciamento cellulare in vivo utilizzando il radionuclide reporter NIS combinato con la proteina fluorescente. Dovresti anche essere in grado di caratterizzare linee cellulari che esprimono reporter NISFP per produrre il radiotracciante PET richiesto per l'imaging in vivo e per eseguire esperimenti in vivo ed ex vivo mediante distribuzione. Dopo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come la fluorocitometria per rispondere a ulteriori domande.Ad esempio, il modo in cui il profilo delle cellule immunitarie di un tumore e le sue metastasi si relazionano tra loro o cambiano nel tempo. Non dimenticare di assicurarti che le linee cellulari che produci siano prive di microplasmidi, poiché è stato segnalato che questi ultimi influenzano i risultati. È importante non dimenticare che lavorare con i radioisotopi può essere estremamente pericoloso e la protezione per se stessi e per gli altri deve essere sempre prioritaria durante l'esecuzione di questa procedura.

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Tomografia Computerizzata guidata nel dominio del tempo Tomography Diffuse fluorescenza in animali di piccola taglia per la localizzazione dei biomarcatori tumorali

Questo video dimostra il protocollo per l'impianto ortotopico di cellule tumorali pancreatiche fluorescenti verdi che esprimono proteine nel pancreas del topo. Il modello murino ortotopico aiuta a studiare l'efficacia di nuove terapie su tumori primari e metastatici.

Modello murino ortotopico fluorescente: impianto di cellule tumorali che esprimono GFP nel topo per valutare la progressione del tumore in vivo

Fonte:Marina Arantes Radicchi1, Victor Carlos Mello1,Victória Paz Machado1, Márcia Cristina Oliveira da Rocha1, Jaqueline Vaz de Oliveira1, Luana Cristina Camargo1,2, Luís Alexandre Muehlmann1, Ricardo Bentes Azevedo1, Sônia Nair Bao1, João Paulo Figueiró Longo11Istituto di Scienze Biologiche, Università di Brasilia, 2Dipartimento di Processi Psicologici di Base, Istituto di Psicologia, Università di BrasiliaQuesto video mostra la procedura per monitorare la progressione del tumore in vivo...

Imaging bioluminescente della progressione del tumore al seno in un modello murino femmina

In questo video, descriviamo la tomografia molecolare a fluorescenza o FMT per l'imaging in vivo di xenotrapianti di glioblastoma marcati con proteine fluorescenti in modelli murini. La tecnica è utile per chiarire gli effetti delle terapie antitumorali a livello molecolare.

Tomografia molecolare a fluorescenza: una tecnica di imaging per l'imaging in vivo di xenotrapianti di glioblastoma con marcatura proteica fluorescente in un modello murino

Descriviamo un multi-angolo di rotazione imaging ottico del sistema (Maroi) in vivo quantificazione di un marcatore fluorescente consegnato da saposin C (SAPC)-dioleoylphosphatidylserine (DOPS) nanovesicles. Impiegando modelli murini di cancro e artrite, si dimostra come l'analisi della curva Maroi segnale può essere utilizzato per la mappatura precisa e caratterizzazione biologica dei processi patologici.

In Vivo Imaging ottico dei tumori cerebrali e artrite Uso fluorescente SAPC-DOPS nanovesicles

Qui viene presentata una procedura per impiantare cellule tumorali pancreatiche che esprimono proteine fluorescenti verdi (PANC-1 GFP) ortotopicamente nel pancreas di topi Balb-c Ola Hsd-Fox1nu per valutare la progressione del tumore e le metastasi.

Fluorescente ortotopico modello murino di cancro al pancreas

Descriviamo un metodo per l'etichettatura stabile di xenotrapianti derivati da pazienti (PDX) con particelle lentivirali che esprimono proteina fluorescente verde e reporter di luciferasi. Questo metodo consente di monitorare la crescita dei PDX nel sito primario, nonché di rilevare metastasi spontanee e sperimentali utilizzando sistemi di imaging in vivo.

Etichettatura di cancro al seno xenotrapianti derivati ​​da pazienti con tracciabili Reporter per crescita tumorale e metastasi Studi

Orthotopic iniezione intracranico delle cellule del tumore è stato utilizzato nella ricerca sul cancro per studiare la biologia del tumore di cervello, la progressione, evoluzione e risposta terapeutica. Qui presentiamo la tomografia molecolare fluorescenza degli xenotrapianti del tumore, che fornisce in tempo reale videomicroscopia imaging e quantificazione di un tumore di massa in modelli preclinici di glioblastoma.

Fluorescenza tomografia molecolare per l'Imaging In Vivo di Glioblastoma xenotrapianti

Questo protocollo descrive l'istituzione di un modello murino portatore di tumori per monitorare la progressione del tumore e l'angiogenesi in tempo reale mediante la doppia bioluminescenza.

Doppia bioluminescenza Imaging della progressione tumorale e dell'angiogenesi

Qui, descriviamo un metodo di monitoraggio non invasivo che coinvolge la luciferasi e l'espressione di proteine fluorescenti verdi in varie linee cellulari di cancro al seno. Questo protocollo fornisce una tecnica per monitorare la formazione del tumore e la colonizzazione metastatica in tempo reale nei topi.

Monitoraggio della crescita del cancro al seno e della formazione di colonie metastatiche nei topi utilizzando la bioluminescenza

Il manoscritto descrive una metodologia per l'instaurazione e il monitoraggio longitudinale della crescita delle metastasi polmonari spontanee da tumori mammari iniettati ortotopicamente, suscettibili di intervento in tutte le fasi della cascata metastatica.

In vivo Imaging per misurare le metastasi polmonari spontanee di cellule tumorali mammarie iniettate ortotopicamente

Scopri l'imaging con reporter genico radionuclide-fluorescenza per monitorare la progressione tumorale nei modelli di roditori. Questa tecnica PET non invasiva riduce l'uso di animali e consente il tracciamento in tempo reale delle cellule cancerose.

Del radionuclide-fluorescenza Reporter Gene Imaging per monitorare la progressione del tumore nei modelli del roditore del tumore (Video) | JoVE Journal

Del radionuclide-fluorescenza Reporter Gene Imaging per monitorare la progressione del tumore nei modelli del roditore del tumore

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