Del radionuclide-fluorescenza Reporter Gene Imaging per monitorare la progressione del tumore nei modelli del roditore del tumore

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di monitorare la crescita tumorale e le metastasi nei roditori vivi tramite imaging. Un reporter di fusione a fluorescenza con radionuclidi consente il rilevamento non invasivo in vivo mediante tomografia a emissione di positroni, con il fluoroforo che aiuta la conferma ex vivo dei risultati. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave ogni volta che le cellule devono essere tracciate in animali vivi per un periodo di tempo prolungato.

Può contribuire alla comprensione delle metastasi a distanza e dell'impatto dei trattamenti sulla progressione del tumore. La tecnica descritta è il tracciamento delle cellule tumorali mediante imaging in vivo altamente sensibile e non invasivo con un tracciante PET prodotto mediante sintesi automatizzata. Offre una significativa riduzione dell'uso di animali rispetto alla metodologia convenzionale.

Le persone che non conoscono questo metodo possono sentirsi sopraffatte dalla sua complessità. In particolare, la sintesi automatizzata del radiotracciante PET semplifica notevolmente questo processo. Riteniamo che la dimostrazione visiva di questo metodo dimostri queste visioni dei passaggi critici associati all'imaging.

Le implicazioni di questa tecnica si estendono ai test preclinici di nuove terapie che possono anche essere monitorate insieme alle cellule tumorali. Questo metodo può fornire informazioni sulla biologia del cancro e sullo sviluppo di trattamenti. Ogni volta che la localizzazione, il trasferimento, l'espansione e il monitoraggio a lungo termine di una certa popolazione sono di interesse.

Per iniziare, utilizzare plasmidi genici reporter, generare particelle di lentivirus, trasdurre le cellule e caratterizzarle. Quindi analizzare la funzione del gene reporter mediante l'assorbimento del radiotracciante nelle linee cellulari che esprimono NISFP. Semina le cellule purificate e il terreno di crescita in piastre a sei pozzetti, assicurandoti che tutti i campioni siano preparati in triplice copia.

La mattina successiva lavare le cellule con terreno di crescita libero da siero e incubare le piastre con 50 kg di becquerel di tetrafluoroborato F18 a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Quindi raccogliere il surnatante e trasferire 100 microlitri in una provetta di raccolta pre-etichettata. Scartare il surnatante rimanente, quindi lavare le cellule con un millilitro di PVS ghiacciato contenente calcio e magnesio a livelli fisiologici.

Raccogliere la soluzione di lavaggio e trasferire 100 microlitri di soluzione di lavaggio in una provetta di raccolta pre-etichettata. Quindi ripetere il processo di lavaggio ancora una volta. Aggiungere 500 microlitri di PVS contenente sia tripsina che EDTA per sollevare le cellule.

Incubare i campioni a 37 gradi Celsius fino a quando le cellule non si staccano, utilizzando un microscopio per verificare il distacco. Quindi trasferire la sospensione cellulare in una provetta di raccolta etichettata. Quindi, centrifugare i campioni di cellule a 250 G per quattro minuti a quattro gradi Celsius.

Utilizza un contatore gamma automatizzato per contare i campioni di ciascuno dei quattro tipi di campione e ottenere la percentuale di captazione utilizzando l'equazione uno. Per iniziare la sintesi del tetrafluoroborato F18, impostare la piattaforma di sintesi radio automatizzata in una cappa chimica appropriata e assicurarsi che il file XML corretto sia caricato sul computer di controllo. Mentre il sintetizzatore è in funzione, il tetrafuoroborato F18 verrà prodotto e quindi purificato su una cartuccia a scambio anionico.

La cartuccia a scambio anionico verrà risciacquata con acqua e quindi asciugata con azoto gassoso. Il prodotto finale viene alluso dalla cartuccia a scambio anionico con un millilitro di cloruro di sodio allo 0,9% e trasferito in una fiala di raccolta in vetro attraverso la linea di uscita. Per iniziare l'imaging, anestetizzare e preparare i topi secondo il protocollo scritto.

Quindi utilizzare soluzione fisiologica sterile allo 0,9% per diluire la soluzione di tetrafluoroborato F18 a 5 megabecquerel per 50 microlitri. Utilizzare una siringa con ago ipodermico per aspirare 100 microlitri della soluzione di tetrafluoroborato F18. Misurare la radioattività nella siringa e registrare il valore e l'ora della misurazione.

Somministrare 50 microlitri della soluzione di tetrafluoroborato F18 nella coda preriscaldata per via endovenosa. Quindi misurare la radioattività rimanente nella siringa e registrare il valore e l'ora della misurazione. L'iniezione del radiotracciante nella vena caudale è fondamentale.

Lo eseguiamo in anestesia animale per ridurre al minimo il rischio di iniezione errata e fuoriuscita di radiotracciante. L'animale rimane sotto anestesia fino all'inizio dell'acquisizione dell'immagine PET. Esattamente 45 minuti dopo l'iniezione del radiotracciante.

Quindi, imposta un timer per il conto alla rovescia da 45 minuti e assicurati che il mouse sia posizionato sul tavolo in posizione sternale. Installare gli strumenti di monitoraggio chirurgico appropriati e assicurarsi che gli strumenti funzionino correttamente prima di andare avanti. Quindi, impostare i perametri per l'imaging TC e l'acquisizione delle immagini PET.

Quando il timer del conto alla rovescia segna 15 minuti, inizia l'acquisizione dell'immagine CT e quando il timer segna zero minuti, inizia l'acquisizione dell'immagine PET. Per prima cosa misurare la radioattività dell'intero topo soppresso e registrare il valore e l'ora della misurazione. Quindi sezionare i topi e raccogliere i tessuti necessari.

Misurare la radioattività della carcassa rimanente con e senza la coda. Registrare questi valori e annotare i tempi di misurazione. Successivamente, pesare singolarmente tutti i tessuti prelevati e scattare fotografie degli organi cancerosi alla luce del giorno e alla luce della fluorescenza.

Quindi, incorporare i tessuti nell'OCT per l'istologia a valle. Misurare la radioattività di tutti i tessuti prelevati, registrare il valore e annotare il tempo di misurazione. Infine, presentare i dati come valori di assorbimento standard o SUV come descritto nell'equazione due.

In questo esperimento, l'imaging genico del registratore di florescenza di radionuclidi è stato utilizzato per monitorare la progressione del tumore in un modello di tumore di roditore. La microscopia a fluorescenza confocale ha dimostrato un'accurata localizzazione della membrana plasmatica delle NISFP. La funzione e la specificità del NISFP sono state quantificate utilizzando l'assorbimento del radiotracciante da parte del NIS.

Non sono state osservate differenze significative tra linee cellulari che esprimono 4T1NISGFP e 4T1NISRFP con livelli di espressione di NIS simili. È importante sottolineare che il blocco del preclorato ha dimostrato in tutte le linee cellulari che l'assorbimento del radiotracciante ottenuto è dovuto all'espressione specifica di NISFP. L'imaging PET di tutto il corpo di animali portatori di tumore ha rivelato informazioni sulla progressione del tumore e sulla diffusione metastatica.

L'esempio mostrato qui mostra estese metastasi lunghe con diversi noduli distinti nel polmone. I valori percentuali della dose iniettata e i volumi occupati di metastasi individuali nei polmoni variavano. Tuttavia, i valori della dose iniettata percentuale normalizzata per il volume erano all'interno di un intervallo simile.

La proteina fluorescente nel gene reporter a doppia modalità ha permesso l'identificazione del tessuto canceroso sotto la luce di florescenza durante la dissezione animale. La successiva biodistribuzione ex vivo del radiotracciante ha rivelato organi con un elevato assorbimento di radiotraccianti e quindi tessuti che esprimono NIS. Mentre la tiroide e le ghiandole salivari, così come lo stomaco, esprimono intrinsecamente NIS, tutti gli altri segnali positivi sono indicativi di tessuti cancerosi come il tumore e le metastasi.

Il reporter a fluorescenza con radionuclidi consente inoltre l'identificazione delle cellule tumorali nelle sezioni di tessuto a valle. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo del cancro per visualizzare il processo di metastasi spontanea e per testare come i farmaci lo influenzano. Durante il tentativo di questa procedura, è importante pianificare attentamente tutti i passaggi in anticipo.

Devono essere stabilite linee cellulari, devono essere allestiti modelli di tumore animale e tutti i reagenti e le apparecchiature per l'imaging devono essere disponibili il giorno richiesto. Consigliamo piccoli esperimenti pilota per iniziare. Una volta padroneggiata, la produzione di radiotraccianti e l'imaging animale in vivo possono essere eseguiti con sei animali in una giornata lavorativa di otto ore, se eseguiti correttamente.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come approcciare un gene reporter offerto dal tracciamento cellulare in vivo utilizzando il radionuclide reporter NIS combinato con la proteina fluorescente. Dovresti anche essere in grado di caratterizzare linee cellulari che esprimono reporter NISFP per produrre il radiotracciante PET richiesto per l'imaging in vivo e per eseguire esperimenti in vivo ed ex vivo mediante distribuzione. Dopo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come la fluorocitometria per rispondere a ulteriori domande.

Ad esempio, il modo in cui il profilo delle cellule immunitarie di un tumore e le sue metastasi si relazionano tra loro o cambiano nel tempo. Non dimenticare di assicurarti che le linee cellulari che produci siano prive di microplasmidi, poiché è stato segnalato che questi ultimi influenzano i risultati. È importante non dimenticare che lavorare con i radioisotopi può essere estremamente pericoloso e la protezione per se stessi e per gli altri deve essere sempre prioritaria durante l'esecuzione di questa procedura.