Name: Secchi di sangue e siero macchie come uno strumento utile per la conservazione dei campioni valutare biomarcatori del cancro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: Impara a conservare campioni di sangue e siero su carta filtro per analisi di biomarcatori tumorali senza congelamento. Questo metodo facilita la ricerca traslazionale in contesti con risorse limitate.

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Vorremmo ringraziare Gráinne Tierney per assistenza editoriale.

Sangue periferico e del siero sono stati raccolti e memorizzati da donatori sani e pazienti che hanno dato il consenso informato scritto a partecipare allo studio. Il protocollo di studio è stato approvato dal comitato etico locale in conformità con gli standard etici stabiliti nella dichiarazione di Helsinki 1964.
1. sangue deposito in DBS
<ol><li>
Raccolta campioni ematici
	<ol>
<li>Raccogliere 3 mL di sangue venoso periferico in un tubo da 3 mL con 5,4 mg di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA). Nota: Conservare sangue periferico come DBS appena possibile ed entro 8 h.</li>
		<li>Scrivere il numero di codice paziente sull'angolo inferiore destro della scheda Screen saver.</li>
		<li>Risospendere accuratamente il sangue con una pipetta da 5 mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Sangue di spotting sulla DBS
	<ol>
<li>Pipetta e trasferire una macchia di sangue (50 µ l) sulla scheda Screen saver (Tabella materiali) con una punta di 50-200 µ l.</li>
		<li>Ripetere il punto 1.2.1. avere un totale di 3 – 5 macchie di sangue. Eliminare la vecchia punta e prenderne uno nuovo per ogni sangue aliquota.</li>
		<li>Lasciare la DBS per asciugare durante la notte a temperatura ambiente in posizione orizzontale su una superficie non assorbente aperta, evitando la luce diretta del sole. Lasciare il coperchio della scheda Screen saver aperto per facilitare l'asciugatura di sangue. Nota: Qualsiasi particolato in aria o polvere durante la fase di asciugatura non influisce sulle applicazioni a valle.</li>
		<li>Conservare la carta a temperatura ambiente in un sacchetto di plastica con essiccante fino all'utilizzo.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. DNA estrazione a partire da DBS secondo il Datasheet di Kit di estrazione del DNA (sezione per le macchie di sangue essiccato)
<ol><li>
Preparazione del campione
	<ol>
<li>Utilizzare 3 macchie di sangue essiccato dalla scheda. Tagliare ciascuna delle macchie di sangue essiccato dalla scheda e separarli dalla scheda con le pinzette. Tagliare le macchie di sangue essiccato separati in piccoli pezzi (diametro di circa 1 mm).</li>
		<li>Posto i pezzi piccoli in una provetta da centrifuga da 1,5 mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Digestione del campione
	<ol>
<li>Aggiungere 180 µ l di tampone di lisi 1 fornito nel kit (Tabella materiali) al tubo. Aggiungere 20 µ l di proteinasi K. Non mescolare il buffer di lisi 1 con proteinasi k prima di pipettaggio nella provetta da 1,5 mL con sangue macchiato carta. Mescolare nel Vortex.</li>
		<li>Collocare la provetta in un thermoincubator e incubare a 56 ° C per 60 min. Se il thermoincubator non è dotato di un agitatore, vortexare il campione ogni 10 – 15 min per almeno 10 s, avendo cura di non far diminuire la temperatura del campione. Centrifugare brevemente le provette per rimuovere le gocce dal coperchio.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Ciclo di lavaggio
	<ol>
<li>Aggiungere 200 µ l di tampone di lisi 2 (Tabella materiali) e vortex per 10 s.</li>
		<li>Posizionare i tubi nel thermomixer o riscaldata incubatore orbitale e incubare a 70 ° C per 10 min. Se il thermoincubator non è dotato di un agitatore vortex i campioni una volta per almeno 10 s, avendo cura di non far diminuire la temperatura dei campioni.</li>
		<li>Ripetere il punto 2.3.1. Il 400 µ l di lisato di trasferimento dalla provetta da 1,5 mL a colonna di eluizione (Tabella materiali). Centrifugare la colonna a 6.000 x g per 1 min.</li>
		<li>Collocare la colonna di eluizione in un nuovo tubo di raccolta da 2 mL e scartare quella vecchia.</li>
		<li>Aggiungere 500 µ l di tampone di lavaggio 1 (Tabella materiali) e centrifugare a 6.000 x g per 1 min.</li>
		<li>Collocare la colonna in un nuovo tubo di raccolta da 2 mL e scartare quella vecchia.</li>
		<li>Aggiungere 500 µ l di tampone di lavaggio 2 (Tabella materiali) e centrifugare a 6.000 x g per 1 min.</li>
		<li>Collocare la colonna in un nuovo tubo di raccolta da 2 mL e scartare quella vecchia.</li>
		<li>Centrifugare a 20.000 x g per 3 minuti ad asciugare la membrana.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Passo di eluizione
	<ol>
<li>Posizionare la colonna in una nuova provetta da centrifuga da 1,5 mL e scartare il tubo di raccolta.</li>
		<li>Mettere 50 µ l di acqua distillata sul centro della membrana. Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente.</li>
		<li>Centrifugare la provetta a 20.000 x g per 1 min. raccogliere l'eluato e collocarlo nuovamente il centro della membrana.</li>
		<li>Centrifugare la provetta a 20.000 x g per 1 min. scartare la membrana.</li>
		<li>Misurare la concentrazione di DNA usando uno spettrofotometro.</li>
		<li>Archivio DNA a-20 ° C fino all'utilizzo. Nota: Il DNA Estratto da DBS consente di eseguire diverse analisi quali la valutazione di SNP mediante Real Time PCR o DNA Sanger sequenziamento.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. siero deposito per DSS
<ol><li>
Raccolta campioni ematici
	<ol>
<li>Raccogliere 7 mL di sangue venoso periferico in una provetta 7 mL senza EDTA. Lasciare il campione di sangue a coagulare per 30 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Scrivere il numero di codice paziente sull'angolo inferiore destro della scheda Screen saver.</li>
		<li>Centrifugare il campione di sangue a 980 x g per 15 min a temperatura ambiente. Nota: Conservare il siero come DSS appena possibile ed entro 8 h.</li>
		<li>Con attenzione rimuovere il supernatante dal tubo e trasferirlo in una nuova provetta da 15 mL. Risospendere accuratamente il sangue con una pipetta da 5 mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Siero spotting nel DSS
	<ol>
<li>Pipetta e trasferire uno spot del siero (50 µ l) sulla scheda Screen saver. Ripetere questo passaggio per avere un totale di 3 – 5 macchie di sangue. Nota: Essere molto attenti a dispensare esattamente 50 µ l di siero in ogni spot. Siero non dovrebbe andare di là dalla linea tratteggiata della carta.</li>
		<li>Lasciare il DSS per asciugare durante la notte a temperatura ambiente. Lasciare il coperchio della scheda Screen saver aperto per facilitare l'asciugatura di sangue.</li>
		<li>Conservare la carta a temperatura ambiente in un sacchetto di plastica con essiccante fino all'utilizzo. Se l'archiviazione è più di 14 giorni, conservare la carta a-20 ° C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. analisi di ELISA a partire da DSS
<ol><li>
Eluire la proteina da DSS.
	<ol>
<li>Se necessario, scongelare un DSS per ciascun campione. DSS tagliate a piccoli pezzi (circa 1 mm di diametro). Mettere i pezzi in una provetta da 1,5 mL con 400 µ l di PBS.</li>
		<li>Agitare i campioni durante la notte a 4 ° C. Nota: Agitare loro a bassa intensità. PBS non dovrebbe bagnare il coperchio del tubo durante l'agitazione.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Utilizzare l'eluato di proteina come un campione di siero per analisi dei fattori di crescita/proteine secrete secondo le istruzioni del kit ELISA, dopo appropriate diluizioni. Nota: Questa procedura funziona bene per DBP rilevamento9. Per altri saggi ELISA, può essere necessario un passaggio di ottimizzazione.</li>
</ol>

<ol><li>Bertagnolio, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+drug+resistance+surveillance+using+dried+whole+blood+spots%5BTitle%5D)+AND+%22Antivir+Ther%22%5BJournal%5D)">HIV-1 drug resistance surveillance using dried whole blood spots.</a> Antivir Ther. 12 (1), 107-113 (2007).</li>
<li>Mei, J. V., Alexander, J. R., Adam, B. W., Hannon, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+filter+paper+for+the+collection+and+analysis+of+human+whole+blood+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nutr%22%5BJournal%5D)">Use of filter paper for the collection and analysis of human whole blood specimens.</a> J Nutr. 131 (5), 1631S-1636S (2001).</li>
<li>Garrido, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subtype+variability%2C+virological+response+and+drug+resistance+assessed+on+dried+blood+spots+collected+from+HIV+patients+on+antiretroviral+therapy+in+Angola%5BTitle%5D)+AND+%22J+Antimicrob+Chemoth%22%5BJournal%5D)">Subtype variability, virological response and drug resistance assessed on dried blood spots collected from HIV patients on antiretroviral therapy in Angola.</a> J Antimicrob Chemoth. 61 (3), 694-698 (2008).</li>
<li>Steegen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feasibility+of+detecting+human+immunodeficiency+virus+type+1+drug+resistance+in+DNA+extracted+from+whole+blood+or+dried+blood+spots%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Feasibility of detecting human immunodeficiency virus type 1 drug resistance in DNA extracted from whole blood or dried blood spots.</a> J Clin Microbiol. 45 (10), 3342-3351 (2007).</li>
<li>Costenaro, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+load+detection+using+dried+blood+spots+in+a+cohort+of+HIV-1-infected+children+in+Uganda%3A+correlations+with+clinical+and+immunological+criteria+for+treatment+failure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Viral load detection using dried blood spots in a cohort of HIV-1-infected children in Uganda: correlations with clinical and immunological criteria for treatment failure.</a> J Clin Microbiol. 52 (7), 2665-2667 (2014).</li>
<li>Gong, Z. H., Tian, G. L., Huang, Q. W., Wang, Y. M., Xu, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+glutathione+and+glutathione+disulfide+in+the+blood+of+glucose-6-phosphate+dehydrogenase-deficient+newborns%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Pediatr%22%5BJournal%5D)">Reduced glutathione and glutathione disulfide in the blood of glucose-6-phosphate dehydrogenase-deficient newborns.</a> BMC Pediatr. 20 (17), 172(2017).</li>
<li>Lukacs, Z., Barr, M., Hamilton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Best+practice+in+the+measurement+and+interpretation+of+lysosomal+acid+lipase+in+dried+blood+spots+using+the+inhibitor+Lalistat+2%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chim+Acta%22%5BJournal%5D)">Best practice in the measurement and interpretation of lysosomal acid lipase in dried blood spots using the inhibitor Lalistat 2.</a> Clin Chim Acta. 471, 201-205 (2017).</li>
<li>Skogstrand, P. T., Bent, N. P., Schendel, D. E., Sørensen, L. C., Hougaard, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+measurement+of+25+inflammatory+markers+and+neurotrophins+in+neonatal+dried+blood+spots+by+immunoassay+with+xMAP+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Simultaneous measurement of 25 inflammatory markers and neurotrophins in neonatal dried blood spots by immunoassay with xMAP technology.</a> Clin Chem. 51 (10), 1854-1866 (2005).</li>
<li>Amadori, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitamin+D+receptor+polymorphisms+or+serum+levels+as+key+drivers+of+breast+cancer+development%3F+The+question+of+the+vitamin+D+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Vitamin D receptor polymorphisms or serum levels as key drivers of breast cancer development? The question of the vitamin D pathway.</a> Oncotarget. 8 (8), 13142-13156 (2017).</li>
<li>Gupta, B. P., Jayasuryan, N., Jameel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+detection+of+hepatitis+B+virus+from+dried+blood+spots+by+polymerase+chain+reaction+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Direct detection of hepatitis B virus from dried blood spots by polymerase chain reaction amplification.</a> J Clin Microbiol. 30 (8), 1913-1916 (1992).</li>
<li>Colson, K. E., Potter, A., Conde-Glez, C., Hernandez, B., RíosZertuche, D., Zúñiga-Brenes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+commercial+ELISA+for+the+detection+of+measles-specific+immunoglobulin+G+%28IgG%29+in+dried+blood+spots+collected+from+children+living+in+low-resource+settings%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Virol%22%5BJournal%5D)">Use of a commercial ELISA for the detection of measles-specific immunoglobulin G (IgG) in dried blood spots collected from children living in low-resource settings.</a> J Med Virol. 87 (9), 1491-1499 (2015).</li>
<li>Drabe, C. H., Blauenfeldt, T., Ruhwald, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ELISA-based+assay+for+IP-10+detection+from+filter+paper+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">ELISA-based assay for IP-10 detection from filter paper samples.</a> Methods Mol Biol. 1172, 27-37 (2014).</li>
<li>St Julien, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+quality+genome-wide+genotyping+from+archived+dried+blood+spots+without+DNA+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">High quality genome-wide genotyping from archived dried blood spots without DNA amplification.</a> PLoS One. 8 (5), e64710(2013).</li>
<li>Shaner, R. L., Schulze, N. D., Seymour, C., Hamelin, E. I., Thomas, J. D., Johnson, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+fentanyl+analogs+in+dried+blood+spots+by+flow-through+desorption+coupled+to+online+solid+phase+extraction+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitation of fentanyl analogs in dried blood spots by flow-through desorption coupled to online solid phase extraction tandem mass spectrometry.</a> Anal Methods. 9, 3876-3883 (2017).</li>
</ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse a divulgare.

Questo protocollo indaga il potenziale per la conservazione di sangue e siero su carta da filtro quando i laboratori non hanno il personale o le infrastrutture necessarie per la corretta gestione dei campioni di sangue. In particolare, sangue intero o siero raccolti in provette standard o da puntura del dito possa essere memorizzato utilizzando questo metodo, e non c'è nessun bisogno di congelarli a-20 ° C o da-80 ° C immediatamente dopo la raccolta del sangue. DBS/DSS può rimanere a temperatura ambiente fino a 14 giorni...

L'obiettivo principale della ricerca in biomarcatori del cancro è l'identificazione di nuovi parametri biologici che possono essere utilizzati per la diagnosi, per predire la prognosi paziente e per determinare se un paziente risponderà ad un trattamento specifico. Questa area di ricerca è fondamentale per la scoperta delle terapie antitumorali innovativi e svolge un ruolo chiave nel trattamento su misura.
Procedure effettuate durante ogni passaggio del biomarcatore individuazione e la convalida devono essere affidabile e riproducibile. Un elemento fondamentale per il successo della ricerca traslazionale è la corretta conservazione dei campioni biologici quali sangue e siero. Questo è il primo passo verso l'ottenimento di materiale biologico di alta qualità che può essere utilizzato per eseguire esperimenti di biologia molecolare o analisi proteina.
Studi multicentrici sono spesso necessarie per reclutare abbastanza pazienti per ottenere dati affidabili. Non tutti gli istituti sono in grado di conservare i campioni a-80 ° C o di inviare campioni di altri centri internazionali in ghiaccio secco. L'uso di carta da filtro per la raccolta del sangue è un metodo semplice per la memorizzazione di sangue e siero e non richiede il blocco immediato di campioni1,2. Una goccia di sangue o di siero possa essere individuata sulla carta, lasciato ad asciugare durante la notte e poi conservati per fino a 14 giorni a temperatura ambiente1,2. In questo modo i ricercatori tempo per inviare i campioni ad altri laboratori. L'uso di sangue secco macchie (DBS) e macchie secche del siero (DSS) così potrebbero semplificare la collaborazione tra istituti di paesi in via di sviluppo.
Data la sua facilità d'uso, DBS campionamento è ampiamente utilizzato in diversi tipi di analisi per analisi sierologiche o genetiche a valle. Ad esempio, in passato, DBS erano utilizzati frequentemente per l'HIV di screening in paesi in via di sviluppo1,2,3,4,5. Un altro vantaggio di questo metodo di deposito è che possono essere raccolti campioni di sangue dal dito-punture, permettendo così il suo uso per test 6,7,8di screening neonatale. Facile manipolazione e trasporto sono ulteriori vantaggi di DBS, specialmente per campioni raccolti in siti remoti dove non c'è nessuna attrezzatura di laboratorio. In una pubblicazione precedente, abbiamo utilizzato DBS e DSS a prova di vitamina D e vitamina D proteina (DBP) in una serie di pazienti caucasici e africano9. I nostri colleghi africani non erano in grado di ottenere ghiaccio secco. Per confrontare i marcatori biologici per comprendere le differenze nella via di vitamina D fra le due popolazioni etniche, abbiamo ulteriormente migliorato la procedura utilizzando abbinati i campioni conservati in condizioni standard e su carta da filtro. Dopo l'ottimizzazione della procedura DBS/DSS, siamo stati in grado di analizzare il DBP e la vitamina D nel siero del paziente in due coorti. Inoltre abbiamo valutato una serie di polimorfismi a singolo nucleotide (SNPs) dopo estrazione del DNA da sangue intero per i caucasici e da DBS per gli africani9. Il presente protocollo permette i campioni di sangue di alta qualità per essere conservato a temperatura ambiente senza influenzare diversi tipi di analisi a valle che vanno dalla biologia molecolare a dosaggi ELISA. È consigliabile per l'uso gestire materiali biologici in studi multicentrici o per i centri che non dispongono di strutture per le condizioni di conservazione standard. Il seguente protocollo rappresenta il culmine di queste procedure ottimizzate.

<table><tbody><tr><td>Carte salva proteine Whatman 903 Scheda salva proteine, 100/pk&lrm;</td><td>Sigma</td><td>Z761575</td><td>Utile per conservare campioni a temperatura ambiente per analisi a valle</td></tr><tr><td>Pipette sierologiche Falcon, 5 mL</td><td>Cellule staminali</td><td>#38003</td><td></td></tr><tr><td>50-200 & micro; Punte a L</td><td>Star-Lab</td><td>S1120-8810</td><td></td></tr><tr><td>Provetta da centrifuga da 1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>4036-3204</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp DNA microkit</td><td>Qiagen</td><td>56304</td><td>Questo è un kit di estrazione del DNA progettato per isolare piccole quantità di DNA&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Buffer ATL (incluso nel microkit QIAamp DNA)</td><td>Qiagen</td><td></td><td>Questo è riportato come Lysis Buffer 1 nel testo</td></tr><tr><td>Buffer AL (incluso nel QIAamp DNA microkit)</td><td>Qiagen</td><td></td><td>Questo è riportato come Lysis Buffer 2 nel testo</td></tr><tr><td>QIAamp mini eluire colonna</td><td>Qiagen</td><td></td><td>Questo è riportato come colonna nel testo</td></tr><tr><td>AW1&nbsp; (incluso nel microkit QIAamp DNA)</td><td>Qiagen</td><td></td><td>Questo è riportato come Wash Buffer 1 NEL TESTO</td></tr><tr><td>AW2&nbsp; (incluso nel microkit QIAamp DNA)</td><td>Qiagen</td><td></td><td>Questo è riportato come Wash Buffer 2 nel testo</td></tr><tr><td>Human Vitamin D BP Quantikine ELISA Kit</td><td>R& Sistemi D</td><td>DVDBP0</td><td></td></tr></tbody></table>

secchi di sangue e siero macchie come uno strumento utile per la conservazione dei campioni valutare biomarcatori del cancro

Dried Blood and Serum Spots As A Useful Tool for Sample Storage to Evaluate Cancer Biomarkers

Qualità del campione di sangue è fondamentale per garantire l'accurata analisi a valle, quali ELISA o PCR in tempo reale. Corretta conservazione dei materiali biologici è il punto di partenza per ottenere risultati riproducibili e affidabili. Tutti i campioni devono essere trattati allo stesso modo da prelievo di sangue per deposito. In base alle analisi da eseguire, sangue intero e campioni di siero dovrebbero essere conservati a-20 ° C o da-80 ° C fino all'utilizzo. Campioni di siero di anima dovrebbero anche essere aliquotati per evitare più di congelamento-scongelamento. Un'altra questione importante è le condizioni del campione durante la spedizione da un laboratorio a altro. Se il ghiaccio secco non è disponibile o la spedizione richiede più di pochi giorni, sono necessari approcci alternativi. Un'opzione consiste nell'utilizzare la carta da filtro per la raccolta del sangue. Qui, vi proponiamo un metodo per sangue e raccolta del campione di siero che si avvale di secca macchie di sangue (DBS) e asciugato macchie del siero (DSS). Abbiamo sviluppato la procedura per estrarre il DNA da DBS per la valutazione a valle di alcuni polimorfismi a singolo nucleotide (SNPs) con real time PCR. Abbiamo inoltre ottimizzato saggio ELISA a partire da proteine eluite da DSS. Questo metodo può essere utilizzato con altri saggi ELISA o procedure di valutazione di proteine.

Abbiamo approfittato delle procedure DBS e DSS per memorizzare sangue e siero a temperatura ambiente senza compromettere la qualità del materiale biologico. Figura 1 Mostra un esempio del risparmiatore carta proteina senza sangue e dopo la raccolta del sangue. Al fine di confermare che l'archiviazione su carta da filtro e la procedura per eluire il sangue non interferiscono con la qualità del campione, abbiamo effettuato un confronto con metodi di archiviazio...

Questo protocollo descrive un metodo semplice e utile per memorizzare sangue periferico e del siero/plasma per analisi a valle, quali single nucleotide polymorphism (SNP) valutazione e analisi di ELISA.

Secchi di sangue e siero macchie come uno strumento utile per la conservazione dei campioni valutare biomarcatori del cancro

Blood sample quality is crucial to ensure accurate downstream analyses such as real-time PCR or ELISA. Correct storage of biological materials is the ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nella ricerca traslazionale, come la possibilità di studiare i biomarcatori in pazienti provenienti da paesi in via di sviluppo. Il vantaggio principale di questa tecnica è la possibilità di conservare campioni di sangue e siero per almeno due settimane senza congelamento e di fornire materiale di alta qualità per analisi a valle come qPCR ed ELISA. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla diagnosi di malattie come il cancro e le malattie infettive.Questo metodo può essere applicato anche in ambito diagnostico o di ricerca come lo studio delle malattie prenatali o l'analisi delle patologie infettive come l'HIV. Abbiamo avuto l'idea di questo metodo quando abbiamo iniziato a confrontare i biomarcatori tra una serie di casi caucasici e una africana per i quali non erano disponibili campioni congelati. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto le fasi di spotting del sangue sono difficili da imparare.In questa procedura, tre millilitri di un campione di sangue vengono raccolti in una provetta da tre millilitri con 5,4 milligrammi di EDTA. Scrivere il numero di codice del paziente nell'angolo in basso a destra della carta risparmio. Risospendere con cura il sangue con una pipetta da cinque millilitri.Quindi, pipettare e trasferire una macchia di sangue sulla carta salvatore. Utilizzando una nuova punta per ogni aliquota di sangue, ripetere la spotting per ottenere un totale di tre-cinque macchie di sangue. Lasciare asciugare le macchie di sangue essiccato, o DBS, per una notte a temperatura ambiente con il coperchio della carta salvatore aperto in posizione orizzontale su una superficie aperta e non assorbente ed evitando la luce solare diretta.Il giorno seguente, conservare la carta a temperatura ambiente in un sacchetto di plastica con essiccante fino al momento dell'uso. Il DNA verrà estratto da tre macchie di sangue essiccato dalla carta risparmio. Inizia tagliando ciascuna delle DBS dalla carta e separandole dalla carta.Tagliare il DBS separato in piccoli pezzi di circa un millimetro di diametro. Metti i piccoli pezzi di una DBS in una provetta da centrifuga da 1,5 millilitri. Per digerire i campioni, aggiungere alla provetta 180 microlitri di tampone di lisi, uno da un kit di estrazione del DNA disponibile in commercio, quindi aggiungere 20 microlitri di proteinasi K.Mix mediante vortex.Posizionare la provetta in una termo-incubatrice e incubare agitando a 56 gradi Celsius per 60 minuti. Al termine dell'incubazione, centrifugare brevemente la provetta per rimuovere le gocce dal coperchio. Iniziare il lavaggio aggiungendo 200 microlitri di tampone di lisi due e agitare per 10 secondi.Mettere la provetta in un termo-mixer e incubare a 70 gradi Celsius per 10 minuti. Posizionare la colonna di elusione in una nuova provetta di raccolta da due millilitri e scartare quella vecchia. Aggiungere 500 microlitri di tampone di lavaggio e centrifugare a 6000 volte la gravità per un minuto.Posizionare la colonna in una nuova provetta di raccolta da due millilitri e scartare quella vecchia. Aggiungere 500 microlitri di tampone di lavaggio due e centrifugare a 6000 volte la gravità per un minuto. Posizionare la colonna in una nuova provetta di raccolta da due millilitri e scartare quella vecchia.Centrifugare a 20.000 volte la gravità per tre minuti per asciugare la membrana. Per eluire il DNA, posizionare la colonna in una nuova provetta da centrifuga da 1,5 millilitri e gettare la provetta di raccolta. Mettere 50 microlitri di acqua distillata al centro della membrana e incubare a temperatura ambiente per 10 minuti.Centrifugare la provetta a 20.000 volte la gravità per un minuto. Raccogliere l'eluire e riposizionarlo al centro della membrana. Centrifugare nuovamente la provetta a 20.000 volte la gravità per un minuto.Scartare la membrana. Dopo aver misurato la concentrazione di DNA con uno spettrofotometro, conservare il DNA a meno 20 gradi Celsius fino all'uso. Per questa procedura, sette millilitri di campione di sangue periferico vengono prima raccolti in una provetta da sette millilitri senza EDTA.Lasciare coagulare il campione di sangue a temperatura ambiente per 30 minuti. Scrivere il numero di codice del paziente nell'angolo in basso a destra della carta risparmio. Centrifugare il campione di sangue a 1100 volte la gravità a temperatura ambiente per 15 minuti.Rimuovere il surnatante dal tubo e trasferirlo in un nuovo tubo da 15 millilitri. Risospendere con cura il sangue con una pipetta da cinque millilitri. Pipettare e trasferire una macchia di siero sulla carta salvatore.Ripeti lo spotting per avere un totale di tre o cinque macchie di sangue. Lasciare asciugare le macchie di sierosi essiccate per una notte a temperatura ambiente con il coperchio della carta salvatore aperto. Il giorno seguente, conservare la carta a temperatura ambiente in un sacchetto di plastica con essiccante fino al momento dell'uso.Se la conservazione dura più di 14 giorni, conservare a meno 20 gradi Celsius. Prepararsi per il test ELISA scongelando il DSS per ogni campione, se necessario. Per eluire la proteina dal DSS, tagliare un DSS in piccoli pezzi di circa un millimetro di diametro e mettere i pezzi in un tubo da 1,5 millilitri.Quindi, aggiungi quattro microlitri di PBS. Agitare i campioni a bassa velocità a quattro gradi Celsius durante la notte. Il giorno successivo, utilizzare un'appropriata diluizione della proteina eluita come campione di siero per l'analisi delle proteine secrete o dei fattori di crescita utilizzando un kit disponibile in commercio.In questo protocollo, i campioni di sangue e siero sono stati conservati come punti secchi su carta da filtro a temperatura ambiente. Una scheda rappresentativa per il risparmio proteico viene mostrata prima e dopo il prelievo di sangue. Al fine di confermare che la conservazione su carta da filtro e la procedura di eluizione del sangue non interferiscono con la qualità del campione, sono stati eseguiti saggi ELISA per la proteina legante la vitamina D, o livelli di DBP, su otto campioni di siero raccolti in una provetta da due millilitri e conservati immediatamente a meno 80 gradi Celsius o raccolti come macchie di siero essiccate.Il coefficiente di variazione, o CV, tra i campioni abbinati variava dal 2% al 24% e il CV medio era del 9,6%Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in 10, 15 minuti se eseguita correttamente. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire metodi a valle di biologia molecolare o analisi delle proteine. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica consente alla ricerca nel campo della ricerca traslazionale e dell'analisi dei biomarcatori di collaborare con istituti di tutto il mondo che non dispongono delle attrezzature di laboratorio per conservare campioni biologici in condizioni standard.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come conservare correttamente i campioni di sangue in macchie di sangue essiccato e siero. Non dimenticare che lavorare con sangue e reagenti chimici può essere estremamente pericoloso e precauzioni come indossare guanti e camice da laboratorio dovrebbero essere sempre prese durante l'esecuzione di questa procedura.

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I biomarcatori sono indicatori biologici direttamente-misurate di malattia o di salute. Della popolazione e delle scienze sociali, biomarcatori devono essere facile da ottenere, i trasporti, e analizzare. Secchi di sangue Spot (DBS) collezione risponde a questa esigenza, possono essere raccolti in campo con alti tassi di risposta e analizzato per una serie di biomarcatori.

Sangue secco Spot Raccolta di salute biomarcatori per massimizzare la partecipazione negli studi di popolazione

Qui descriviamo un test di cromatografia liquida ad alte prestazioni-spettrometria di massa tandem (HPLC-MS/MS) per quantificare l'immunosoppressore tacrolimus in macchie di sangue essiccato utilizzando una semplice fase manuale di precipitazione delle proteine ed estrazione online della colonna.

Quantificazione del immunosoppressore Tacrolimus su macchie di sangue secco Uso LC-MS / MS

La preparazione e il trattamento delle macchie di sangue essiccato (DBS) per la loro analisi finale sono ancora poco standardizzati per la maggior parte delle applicazioni diagnostiche. Per ovviare a questa lacuna, un protocollo completo di passo-passo è suggerito e successivamente valutato per quanto riguarda la sua efficacia per la rilevazione di markers di infezioni virali.

Macchie di sangue essiccato - preparazione ed elaborazione per l'uso in test immunologici e tecniche molecolari

I tumori cutanei vengono spesso scartati dopo la chirurgia microscopica di Mohs. Qui viene descritto un protocollo che consente al personale di supporto clinico di elaborare e memorizzare in modo efficace campioni tumorali cutanei ( ad esempio, carcinoma delle cellule squamose, carcinoma delle cellule basali e melanoma) per applicazioni di laboratorio a valle senza interferire con le operazioni cliniche.

Istituzione di un Bioreposito di base clinico

Qui presentiamo un protocollo per rilevare le mutazioni somatiche tumorali nel DNA circolante presente nei fluidi biologici dei pazienti (biofluidi). Il nostro metodo basato sulla reazione a catena della polimerasi digitale delle goccioline (dPCR) consente la quantificazione della frequenza allelica della mutazione tumorale (MAF), facilitando un complemento minimamente invasivo alla diagnosi e al monitoraggio temporale della risposta tumorale.

Rilevamento e monitoraggio del DNA circolante associato al tumore nei biofluidi dei pazienti

Le biobanche sono risorse cruciali per la ricerca biomedica e l'unità Biobank for Translational and Digital Medicine presso l'Istituto europeo di oncologia è un modello in questo campo. Qui forniamo una descrizione dettagliata delle procedure operative standard delle biobanche per la gestione di diversi tipi di campioni biologici umani.

Biobanca per la medicina traslazionale: procedure operative standard per una gestione ottimale dei campioni

La biopsia liquida ha rivoluzionato il nostro approccio agli studi traslazionali oncologici, con la raccolta, la qualità e lo stoccaggio dei campioni come passaggi cruciali per la sua applicazione clinica di successo. Qui descriviamo un protocollo standardizzato e convalidato per applicazioni di DNA senza circolazione a valle che può essere applicato nella maggior parte dei laboratori di ricerca traslazionale.

Un protocollo preanalitico standardizzato per biopsia liquida per applicazioni di DNA libero da circolazione a valle

Questo documento descrive l'applicazione di apparecchiature automatizzate per separare e raccogliere in modo semplice ed efficiente sostanze, come il DNA privo di cellule e le cellule tumorali circolanti, dal sangue intero.

Separazione automatica e raccolta di sostanze correlate al cancro da campioni clinici

Viene presentato un protocollo per la determinazione di biomarcatori a bassa abbondanza da campioni di siero essiccati esemplificati con il peptide di rilascio della progastrina biomarcatore (ProGRP). Le sfere magnetiche rivestite di anticorpi sono utilizzate per la pulizia selettiva e l'arricchimento di un peptide ProGRP proteotipico. Il peptide catturato viene successivamente analizzato mediante cromatografia liquida-spettrometria di massa tandem.

Microcampionamento nell'analisi mirata delle proteine basate sulla spettrometria di massa di proteine a bassa abbondanza

Questo protocollo descrive un metodo per facilitare la raccolta di campioni da campioni di prostatectomia radicale. L'obiettivo è quello di mappare, caratterizzare e sezionare con micro-macro campioni di tessuto dai campioni in base a criteri anatomopatologici prima di conservarli in una biobanca.

Miglioramento dell'affidabilità della biobanca dei tumori alla prostata con una migliore tecnica di campionamento e caratterizzazione istologica

Questo protocollo standardizza l'analisi SDS-PAGE per il profiling personalizzato della corona proteica su nanoparticelle, consentendo una rilevazione riproducibile, scalabile e a basso costo di firme specifiche per il cancro. Progettato per la diagnosi precoce dell'adenocarcinoma del pancreas duttale, offre un'alternativa pratica e ALLINEATA a REASSURED rispetto ai complessi metodi proteomici sia in ambito di ricerca che clinico.

Flusso di lavoro standardizzato SDS-PAGE per la profilazione personalizzata della corona proteica nella diagnosi precoce del cancro

Impara a conservare campioni di sangue e siero su carta filtro per analisi di biomarcatori tumorali senza congelamento. Questo metodo facilita la ricerca traslazionale in contesti con risorse limitate.

Secchi di sangue e siero macchie come uno strumento utile per la conservazione dei campioni valutare biomarcatori del cancro

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