Secchi di sangue e siero macchie come uno strumento utile per la conservazione dei campioni valutare biomarcatori del cancro

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nella ricerca traslazionale, come la possibilità di studiare i biomarcatori in pazienti provenienti da paesi in via di sviluppo. Il vantaggio principale di questa tecnica è la possibilità di conservare campioni di sangue e siero per almeno due settimane senza congelamento e di fornire materiale di alta qualità per analisi a valle come qPCR ed ELISA. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla diagnosi di malattie come il cancro e le malattie infettive.

Questo metodo può essere applicato anche in ambito diagnostico o di ricerca come lo studio delle malattie prenatali o l'analisi delle patologie infettive come l'HIV. Abbiamo avuto l'idea di questo metodo quando abbiamo iniziato a confrontare i biomarcatori tra una serie di casi caucasici e una africana per i quali non erano disponibili campioni congelati. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto le fasi di spotting del sangue sono difficili da imparare.

In questa procedura, tre millilitri di un campione di sangue vengono raccolti in una provetta da tre millilitri con 5,4 milligrammi di EDTA. Scrivere il numero di codice del paziente nell'angolo in basso a destra della carta risparmio. Risospendere con cura il sangue con una pipetta da cinque millilitri.

Quindi, pipettare e trasferire una macchia di sangue sulla carta salvatore. Utilizzando una nuova punta per ogni aliquota di sangue, ripetere la spotting per ottenere un totale di tre-cinque macchie di sangue. Lasciare asciugare le macchie di sangue essiccato, o DBS, per una notte a temperatura ambiente con il coperchio della carta salvatore aperto in posizione orizzontale su una superficie aperta e non assorbente ed evitando la luce solare diretta.

Il giorno seguente, conservare la carta a temperatura ambiente in un sacchetto di plastica con essiccante fino al momento dell'uso. Il DNA verrà estratto da tre macchie di sangue essiccato dalla carta risparmio. Inizia tagliando ciascuna delle DBS dalla carta e separandole dalla carta.

Tagliare il DBS separato in piccoli pezzi di circa un millimetro di diametro. Metti i piccoli pezzi di una DBS in una provetta da centrifuga da 1,5 millilitri. Per digerire i campioni, aggiungere alla provetta 180 microlitri di tampone di lisi, uno da un kit di estrazione del DNA disponibile in commercio, quindi aggiungere 20 microlitri di proteinasi K.Mix mediante vortex.

Posizionare la provetta in una termo-incubatrice e incubare agitando a 56 gradi Celsius per 60 minuti. Al termine dell'incubazione, centrifugare brevemente la provetta per rimuovere le gocce dal coperchio. Iniziare il lavaggio aggiungendo 200 microlitri di tampone di lisi due e agitare per 10 secondi.

Mettere la provetta in un termo-mixer e incubare a 70 gradi Celsius per 10 minuti. Posizionare la colonna di elusione in una nuova provetta di raccolta da due millilitri e scartare quella vecchia. Aggiungere 500 microlitri di tampone di lavaggio e centrifugare a 6000 volte la gravità per un minuto.

Posizionare la colonna in una nuova provetta di raccolta da due millilitri e scartare quella vecchia. Aggiungere 500 microlitri di tampone di lavaggio due e centrifugare a 6000 volte la gravità per un minuto. Posizionare la colonna in una nuova provetta di raccolta da due millilitri e scartare quella vecchia.

Centrifugare a 20.000 volte la gravità per tre minuti per asciugare la membrana. Per eluire il DNA, posizionare la colonna in una nuova provetta da centrifuga da 1,5 millilitri e gettare la provetta di raccolta. Mettere 50 microlitri di acqua distillata al centro della membrana e incubare a temperatura ambiente per 10 minuti.

Centrifugare la provetta a 20.000 volte la gravità per un minuto. Raccogliere l'eluire e riposizionarlo al centro della membrana. Centrifugare nuovamente la provetta a 20.000 volte la gravità per un minuto.

Scartare la membrana. Dopo aver misurato la concentrazione di DNA con uno spettrofotometro, conservare il DNA a meno 20 gradi Celsius fino all'uso. Per questa procedura, sette millilitri di campione di sangue periferico vengono prima raccolti in una provetta da sette millilitri senza EDTA.

Lasciare coagulare il campione di sangue a temperatura ambiente per 30 minuti. Scrivere il numero di codice del paziente nell'angolo in basso a destra della carta risparmio. Centrifugare il campione di sangue a 1100 volte la gravità a temperatura ambiente per 15 minuti.

Rimuovere il surnatante dal tubo e trasferirlo in un nuovo tubo da 15 millilitri. Risospendere con cura il sangue con una pipetta da cinque millilitri. Pipettare e trasferire una macchia di siero sulla carta salvatore.

Ripeti lo spotting per avere un totale di tre o cinque macchie di sangue. Lasciare asciugare le macchie di sierosi essiccate per una notte a temperatura ambiente con il coperchio della carta salvatore aperto. Il giorno seguente, conservare la carta a temperatura ambiente in un sacchetto di plastica con essiccante fino al momento dell'uso.

Se la conservazione dura più di 14 giorni, conservare a meno 20 gradi Celsius. Prepararsi per il test ELISA scongelando il DSS per ogni campione, se necessario. Per eluire la proteina dal DSS, tagliare un DSS in piccoli pezzi di circa un millimetro di diametro e mettere i pezzi in un tubo da 1,5 millilitri.

Quindi, aggiungi quattro microlitri di PBS. Agitare i campioni a bassa velocità a quattro gradi Celsius durante la notte. Il giorno successivo, utilizzare un'appropriata diluizione della proteina eluita come campione di siero per l'analisi delle proteine secrete o dei fattori di crescita utilizzando un kit disponibile in commercio.

In questo protocollo, i campioni di sangue e siero sono stati conservati come punti secchi su carta da filtro a temperatura ambiente. Una scheda rappresentativa per il risparmio proteico viene mostrata prima e dopo il prelievo di sangue. Al fine di confermare che la conservazione su carta da filtro e la procedura di eluizione del sangue non interferiscono con la qualità del campione, sono stati eseguiti saggi ELISA per la proteina legante la vitamina D, o livelli di DBP, su otto campioni di siero raccolti in una provetta da due millilitri e conservati immediatamente a meno 80 gradi Celsius o raccolti come macchie di siero essiccate.

Il coefficiente di variazione, o CV, tra i campioni abbinati variava dal 2% al 24% e il CV medio era del 9,6%Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in 10, 15 minuti se eseguita correttamente. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire metodi a valle di biologia molecolare o analisi delle proteine. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica consente alla ricerca nel campo della ricerca traslazionale e dell'analisi dei biomarcatori di collaborare con istituti di tutto il mondo che non dispongono delle attrezzature di laboratorio per conservare campioni biologici in condizioni standard.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come conservare correttamente i campioni di sangue in macchie di sangue essiccato e siero. Non dimenticare che lavorare con sangue e reagenti chimici può essere estremamente pericoloso e precauzioni come indossare guanti e camice da laboratorio dovrebbero essere sempre prese durante l'esecuzione di questa procedura.