Un saggio di Burrowing/Tunneling per rilevazione di ipossia nelle larve di Drosophila melanogaster

L'obiettivo generale di questo test è identificare le larve di drosophila che soffrono di ipossia tissutale nonostante siano a livelli di ossigeno normali. Nella drosofila ci sono molte mutazioni che producono una crescita lenta, scarsa, delle larve e la lentezza di alcune larve. Questo test identifica all'interno di quella classe di larve, quelle che soffrono di ipossia tissutale.

In definitiva, questo test aiuterà a identificare più mutazioni che producono carenza di ossigeno nei tessuti attraverso vari processi fisiologici. L'idea di questo test è nata dall'osservazione che le larve con vie aeree o trachea danneggiate mostravano due strani comportamenti. Questi comportamenti anomali sono l'incapacità di scavare nel cibo durante la prima vita delle larve e l'incapacità di scavare un tunnel in un substrato più morbido durante la fase di vagabondaggio.

Impostare gli incroci genetici di controllo e sperimentali in piatti per la deposizione delle uova come descritto nel protocollo di testo. Tieni le mosche al buio per almeno due giorni prima di iniziare la raccolta delle uova a tempo. Per la raccolta delle uova a tempo, trasferire gli adulti su nuovi piatti di agar d'uva decorati con una fresca spalmatura di pasta di lievito all'inizio della giornata e lasciare che gli adulti depongano le uova sui piatti per quattro ore.

Dopo quattro ore, trasferire gli adulti su piastre di agar d'uva fresca. Quindi, incubare le piastre di raccolta di quattro ore per una notte a 25 gradi Celsius. Entro il pomeriggio successivo, la maggior parte delle larve si sarà schiusa.

Pianifica di averne almeno 50 per ogni gruppo sperimentale. Per una singola esecuzione del saggio, preparare almeno cinque piastre di saggio per gruppo sperimentale. Aggiungere 16 grammi di agar agar e 700 millilitri di acqua deionizzata riscaldando.

Preparare un Nipagen da 17,5 millilitri in etanolo al 95%. Riscaldare la soluzione di agar fino a quando non è quasi completamente sciolta. Quindi aggiungere la soluzione di Nipagen alla soluzione di agar e scaldare fino a quando l'agar non si dissolve completamente.

Raffreddare brevemente la soluzione di agar, quindi caricare piastre da 10 centimetri con 15 millilitri di soluzione di agar. Una volta che l'agar si è gelificato, metti i coperchi sui piatti e lasciali asciugare a temperatura ambiente per alcune ore o durante la notte. L'agar stagionato deve essere sodo al tatto e resistere allo sbriciolamento quando i pezzi vengono tagliati da esso.

Una volta che l'agar si è indurito, utilizzare una tavola di sughero da 1,5 centimetri per praticare un foro centrale nel gel di agar in ogni piastra. Quindi riempire accuratamente i buchi con pasta di lievito fresco. Per trasferire le larve sulla piastra di analisi, è necessario creare uno strumento semplice.

Piega una curva nella punta di una microspatola di plastica e immergi la punta nella pasta di lievito per renderla adesiva alle larve. Ora raccogli le larve del primo stadio individualmente e posizionale sulla piastra di agar vicino al cumulo di cibo. Per ogni gruppo sperimentale, preparare almeno cinque piastre, ciascuna con 10 larve.

Per garantire la riproducibilità tra le repliche dei saggi, è fondamentale che solo 10 larve siano posizionate su ciascuna piastra di analisi. Assicurati di controllare attentamente la piastra del saggio per determinare che una, e solo una, larva viene trasferita ogni volta che consegni una larva con la punta della microspatola. Una volta caricato un piatto, etichettalo, coprilo, quindi posizionalo al buio con il coperchio rivolto verso l'alto a temperatura ambiente.

Esamina ogni piastra ogni giorno fino a quando tutte le larve sono morte o impupate. Di seguito sono riportati alcuni esempi di piastre per un ceppo di tipo selvatico dal secondo all'ottavo giorno del saggio. Il secondo giorno, le larve vengono sepolte nel cibo e non si verifica alcun tunneling.

Il tunneling inizia il terzo giorno e raggiunge un massimo tra il quinto e l'ottavo giorno, quando le larve smettono di vagare e si impupano nei loro tunnel. Trasferisci con cura le pupe con un ago da pesca piegato su un piatto d'uva e, se lo desideri, conta quante pupe racchiudono. Prendi nota della formazione delle pupe e valuta le pupe per anomalie.

Per visualizzare i tunnel all'interno della piastra di analisi, rimuovere e scartare con cura tutto il cibo a base di lievito dal pozzetto centrale di ciascuna piastra. Quindi inondare delicatamente ogni piastra con acqua di rubinetto e utilizzare un pennello morbido per rimuovere accuratamente eventuali detriti che sono stati tracciati sulla superficie dell'agar. Alcuni pezzi di agar possono sbriciolarsi dove il tunneling è più intenso.

Questo può essere corretto in seguito. Continuare a sostituire l'acqua più volte e spazzolare delicatamente i detriti fino a quando la piastra non è completamente pulita. Quindi risciacquare il piatto con acqua deionizzata, coprirlo e lasciarlo asciugare a temperatura ambiente per una notte.

È importante utilizzare un flusso d'acqua delicato e pennellate delicate per pulire le piastre di agar in modo da non rompere o danneggiare parti del gel di agar. Il giorno successivo, prepara un'immagine tiff file della lastra utilizzando uno sfondo nero per mostrare i tunnel come linee bianche luminose. I sistemi di documentazione su gel funzionano bene per questa fase.

Quindi, quantificare il tunneling nell'immagine utilizzando l'immagine J con lo strumento Ovale, definire il gel di agar fino al bordo di plastica della piastra di Petri escluso. Quindi applicare una soglia automatica per produrre un'immagine inversa della lastra in modo che i tunnel appaiano come linee nere. Per correggere le aree scure che non contengono tunnel, utilizzare il Selettore colore e gli strumenti Pennello per sbiancare tali aree.

Successivamente, nel menu a discesa Analizza, selezionare Imposta scala e fare clic per rimuovere la scala. Quindi vai alla finestra Imposta misure in Analizza e seleziona Area e Limita alla soglia. Ora premere il tasto Ctrl con il tasto M per ottenere una misurazione dell'area nera nell'immagine nell'unità di pixel che rappresenta l'area tunnellizzata.

Per quantificare il tunneling perso a causa dell'erosione dell'agar attorno al foro centrale, deselezionare Limita alla soglia. Usa lo strumento Bacchetta per definire il foro centrale e premi Ctrl più M per misurarne il valore in pixel. Sottrai da questo valore il valore in pixel di un foro di 1,5 centimetri di diametro.

Aggiungere la differenza al valore dei pixel ottenuto in precedenza per ottenere il valore totale dei pixel di tunneling. Per le piastre in cui l'agar mancante si estende oltre l'anello centrale di tunneling, è necessario un ulteriore passaggio per evitare che la quantificazione includa aree al di fuori della regione centrale. Utilizzare gli strumenti Selettore colore e Pennello per aggiungere una barra nera, come mostrato, per limitare l'area quantificata.

Il test descritto è stato utilizzato per studiare la potenziale ipossia nelle larve con funzione compromessa del gene non gonfiabile nelle trache. Il gene è stato soppresso RNAi tramite Gal4 UAS. Sono state utilizzate due linee Gal4.

Gal4 senza fiato, che si esprime attraverso tutto lo sviluppo nell'intero sistema tracheale. O cut(ue)Gal4, che si esprime fortemente in una piccola sezione tracheale durante la vita larvale. Le larve di controllo contenevano una delle linee Gal4, ma nessun RNAi non gonfiabile.

Le larve con cut(ue)Gal4 che guidava l'RNAi non gonfiabile erano indistinguibili dai controlli durante lo sviluppo sia in termini di crescita che di comportamento. Tuttavia, la forte soppressione dell'RNAi non gonfiabile durante la traca con blt-Gal4 ha provocato il fallimento della tana nella fase di alimentazione e ha prodotto un alto tasso di mortalità. Queste larve hanno anche mostrato una completa assenza di tunneling durante la fase di vagabondaggio.

Inoltre, le larve sperimentali Gal4 senza respiro erano più piccole, più sottili e più lente dei controlli e sono rimaste come larve molto tempo dopo che tutti gli altri gruppi si sono impupati. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come testare le larve di drosophila per l'ipossia tissutale monitorando la misura in cui si insinuano nei loro cumuli di cibo o scavano un tunnel in un substrato morbido. Una completa assenza di tunnellizzazione è un forte indicatore di ipossia tissutale.