Name: Romanzo fotoacustico microscopia e tomografia a coerenza ottica doppia modalità coroidoretinica Imaging in vita gli occhi dei conigli (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Scopri la microscopia fotoacustica e la tomografia a coerenza ottica per l'imaging coroidoretinico non invasivo negli occhi dei conigli. Questo metodo consente di visualizzare la saturazione di ossigeno e la distribuzione del sangue.

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Questo lavoro è stato sostenuto dal generoso sostegno del 4K12EY022299 National Eye Institute (YMP), lotta per Vista-International retinica Research Foundation FFS GIA16002 (YMP), illimitato supporto dipartimentale dalla ricerca per prevenire la cecità e il Università del Michigan, dipartimento di oftalmologia e scienze visive. Questo lavoro utilizzata il Core Center per visione ricerca finanziata dal P30 EY007003 dal National Eye Institute.

I conigli sono che un United States Department of Agriculture (USDA) coperto specie. Suo uso nella ricerca biomedica deve seguire regole severe. Tutti coniglio esperimenti sono stati eseguiti in conformità con la dichiarazione di ARVO (associazione per la ricerca in Oftalmologia e la visione) per l'uso degli animali in oftalmica e Vision Research, dopo l'approvazione del protocollo di animali di laboratorio dall'Università Comitato per l'uso e cura degli animali (UCUCA) dell'Università del Michigan (protocollo PRO00006486, PI Yannis Paulus).
1. configurazione del sistema
<ol><li>Fotoacustico microscopia (PAM)<ol>
<li>Uso un oscillatore parametrico ottico (OPO) laser pompato da un laser a stato solido pompato a diodi come la sorgente luminosa delle specifiche tecniche adeguate tratteresti Select, come ripetizione di impulso tasso 1kHz, impulso durata 3-6 ns e sintonizzabile lunghezza d'onda 405-2600 nm.</li>
		<li>Riflettere il raggio che emanano dal laser a 570 nm da due specchi (M1 e M2), quindi passarlo attraverso un attenuatore di mezza onda piatto montato su un filtro di fase di rotazione e, infine, messa a fuoco, motorizzato e collimi esso da un collimatore fascio (Figura 1). Ottimizzare la progettazione del collimatore fascio. Un esempio di configurazione del collimatore fascio comprende una lente di focalizzazione L1 (lunghezza focale 250mm), un foro stenopeico (diametro 50 µm) e un collimatore L2 (lunghezza focale 30 mm).</li>
		<li>Dividere il fascio collimato per un divisore di fascio (BS1) con un rapporto di divisione di 90/10 (riflessione/trasmissione). Registrare la parte trasmessa da un fotodiodo per monitoraggio di energia di impulso a impulso laser. Successivamente deviare la parte riflessa da uno specchio (M3) e uno specchio dicroico (DM) e raster-scan utilizzando un galvanometro bidimensionale. Il galvanometro è un componente condiviso con il dominio spettrale (SD)-sistema di OCT (descritto sotto).</li>
		<li>Consegnare il raggio acquisito attraverso un telescopio è composto da una lente di scansione (lunghezza focale 36 mm) e una lente oftalmica (OL, lunghezza focale 10 mm) e finalmente concentrarsi sul fondo dall'ottica dell'occhio coniglio.</li>
		<li>Selezionare un trasduttore ultrasonico aghiformi con specifiche tecniche corretta, ad esempio, il centro frequenza 27MHz, bidirezionale − 6 dB banda 60%. Posizionarlo a contatto con la congiuntiva fuori l'asse visivo centrale per catturare il segnale fotoacustico eccitato.</li>
		<li>Amplificare il segnale tramite un amplificatore ad ultrasuoni (ad esempio, 57 dB di guadagno), filtrare per un filtro passa-basso (ad esempio, la frequenza di taglio 32 MHz) e digitalizzarlo da un digitalizzatore ad alta velocità a una frequenza di campionamento di 200 MS/s.</li>
		<li>Posto un misuratore di potenza sopra il coniglio degli occhi e misura l'energia dell'impulso laser sulla cornea di coniglio per tenerlo sotto la sicurezza ANSI limitare 160 nJ a 570 nm38. Bloccare il fascio per evitare sovraesposizioni laser utilizzando un otturatore laser controllato da Matlab attraverso un'elettronica di sincronizzazione.</li>
		<li>Sincronizzare il laser, il galvanometro e digitalizzatore attraverso una scheda (DAQ) di acquisizione dati. Programma software per acquisizione dati e controllo di sistema in Matlab.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tomografia a coerenza ottica spectral-domain (SD-OCT)<ol>
<li>Adattare il sistema SD-OCT basato su un sistema disponibile in commercio con l'aggiunta di una lente oftalmica (OL) dopo la scansione lente (SL) e un pezzo di vetro di compensazione di dispersione (DCG) del braccio di riferimento (Figura 1). La modifica permette che il sistema OCT può immagine il segmento posteriore dell'occhio di coniglio.</li>
		<li>Utilizzare un alloggiamento tubo zoom per regolare la lunghezza del braccio di riferimento per garantire la sua partita con la lunghezza del percorso ottico del braccio del campione. Utilizzare un diaframma ad iride per controllare l'intensità della luce riflessa retrò riferimento per garantire la sua partita con intensità luminosa retro-sparsi dal fundus di coniglio per ottenere massima immagine contrasto.</li>
		<li>Impiegare una fotocamera di charge coupled device (CCD) incapsulata nella testa di scansione per la visualizzazione in tempo reale del fondo di coniglio con un'illuminazione diodo luminoso (LED come fonte di illuminazione esterna).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. sistema di allineamento
<ol><li>Inizializzare la posizione del galvanometro e allineare il sistema OCT regolando le viti del montaggio collimatore della fibra e il beamsplitter cubo. Nota: Le procedure dettagliate sono disponibili nel manuale del sistema OCT commercialmente acquisito e non saranno coperti qui. Questo passaggio è principalmente quello di garantire la corretti allineamenti di collimatore della fibra, il braccio di riferimento e la lente di scansione per ottimizzare le prestazioni del sistema OCT.</li>
	<li>Regolare la posizione x, ye z del foro stenopeico intorno la messa a fuoco della lente messa a fuoco per spazialmente filtrare il fascio laser e trasmettere al massimo l'energia del laser. Controllare l'altezza del raggio laser prima e dopo il foro stenopeico utilizzando uno strumento di misura di altezza per garantire che essi sono gli stessi.</li>
	<li>Regolare l'inclinazione, decenter e la posizione z del collimatore L2 per collimare il fascio filtrato. Garantire che il fascio ha circa le stesse dimensioni e altezza quando osservati in campo vicino e lontano dal campo.</li>
	<li>Co-assiale di combinare il fascio laser di PAM e il fascio di luce di OCT sintonizzando le inclinazioni dello specchio e il DM. Dopo questo passaggio, il PAM laser e luce di OCT dovrebbe essere completamente coincidente e scansione regioni sul fondo di coniglio sono le stesse.</li>
	<li>Regolare l'inclinazione e decenter della lente OL per allineare correttamente nel percorso ottico. Una volta fatto, il sistema di doppia modalità è pronto per l'imaging. Nota: Uno può utilizzare il metodo di auto-collimazione per ottenere questo, cioè, controllando la luce retro-riflettuto dalla superficie della lente OL per assicurarsi che va indietro lungo la stessa strada come la luce incidente.</li>
</ol>3. preparazione coniglio
<ol><li>Prendere un coniglio bianco della Nuova Zelanda dalla struttura animale e registrare informazioni individuali, come numero di animali e di peso di corpo.</li>
	<li>Montare piattaforme di coniglio, tra cui il supporto del corpo e supporto per la testa sul tavolo sotto il sistema di imaging ottico. Mettere una coperta di riscaldamento circolazione d'acqua sul supporto corpo e impostare la temperatura dell'acqua circolante a 38 ° C per aiutare a mantenere la temperatura corporea del coniglio caldo per tutta la durata dell'esperimento e della riscossione.</li>
	<li>Registrare i segni vitali pre-procedura, compreso stato nel complesso animale, membrana mucosa colore, frequenza cardiaca, frequenza respiratoria e temperatura corporea rettale. Anestetizzare il coniglio con una miscela di ketamina (40 mg/kg) e xilazina (5 mg/kg) tramite iniezione intramuscolare (IM) e registrare l'utilizzo di ketamina (tabella III sostanza controllata). Confermare il livello di anestesia controllando la frequenza cardiaca, frequenza respiratoria e stato generale.</li>
	<li>Dilatare le pupille di coniglio usando una goccia ogni di Tropicamide 1% oftalmica e fenilefrina cloridrato 2,5% oftalmico.</li>
	<li>Utilizzare uno speculum per tenere le palpebre di mezzo e applicare una goccia di lubrificante di occhio per inumidire la cornea. Instillare una goccia di attualità tetracaina 0,5% negli occhi prima la procedura di imaging. Nota: Per più procedure o procedure con eventuale disagio per l'animale, dare il coniglio un'iniezione sottocutanea di meloxicam prima dell'esperimento per garantire il comfort degli animali.</li>
</ol>4. formazione immagine SD-OCT
<ol><li>Trasferire il coniglio per la piattaforma di formazione immagine di una fotocamera di clinica del fondo e prendere 50 gradi immagini del fondo, rosso gratuita e autofluorescenza prima ottobre sessione di imaging. Questo aiuta a controllare la trasparenza ottica dell'occhio e riconoscere la morfologia di nave del fondo e luoghi d'interesse, come il nervo ottico e sistema vascolare retinico raggio midollare.</li>
	<li>Trasferimento il coniglio per la piattaforma del sistema OCT e regolare la sua postura per approssimativamente posizionare uno degli occhi sotto l'OL. Illuminare l'occhio utilizzando la luce del LED. Nota: Per facilitare la traduzione clinica della tecnica, gli occhi del coniglio non sono stabilizzati utilizzando altri metodi e la testa di coniglio è appena messo il supporto per la testa senza alcun fissaggio.</li>
	<li>Aprire il software OCT e verificare innanzitutto l'immagine della telecamera CCD del fondo. Regolare con precisione l'altezza e l'angolo di supporto per la testa se necessario per garantire la regione di interesse (ROI), come vasi coroideali e vasi retinici, sono all'interno del campo visivo (FOV) della fotocamera. Nota: Se il coniglio è sotto un livello di buona anestesia, una sessione di imaging sequenza può durare finchè 10 min senza la necessità di ri-regolare la testa di coniglio.</li>
	<li>Disegnare una linea retta per rappresentare l'OCT B-scan di interesse e avviare la scansione. Regolare la lunghezza del braccio di riferimento per visualizzare l'immagine OCT ed ottimizzare il fattore di compensazione della dispersione nel software OCT per ottenere le immagini più taglienti. Nota: Quando si regola la lunghezza del braccio di riferimento, due immagini di ottobre con mirroring verranno visualizzato uno dopo l'altro. L'immagine corretta potrebbe essere distinta in base alla conoscenza dell'anatomia del fondo.</li>
	<li>Impostare i parametri di acquisizione dati, quali il numero di pixel e medie e salvare le immagini.</li>
	<li>Osservare la frequenza respiratoria e la frequenza cardiaca del coniglio per stimare il livello di anestesia e animale comfort. Per sessioni più lunghe, una dose di un terzo di ketamina supplementare o inalato isoflurano potrebbe considerare con intubazione endotracheale, un V-gel o una maschera facciale per mantenere l'aereo dell'anestesia quando necessario.</li>
	<li>Sciacquare la cornea di coniglio con collirio ogni 2 min durante l'esperimento per prevenire la disidratazione superficie corneale e keratopathy epiteliale punctate superficiale corneale. Monitorare e registrare i segni vitali animali ogni 15 min.</li>
</ol>5. PAM imaging
<ol><li>Indossare occhiali di sicurezza laser appropriato e accendere il laser OPO.</li>
	<li>Avviare il software di controllo PAM, sintonizzare la lunghezza d'onda laser ad uno dei picchi di assorbimento di cromofori mirati (ad es., 570 nm per l'emoglobina), inizializzare la posizione del galvanometro e dell'energia laser monitor prima la cornea di coniglio per garantire che è sotto il limite di sicurezza ANSI.</li>
	<li>Montare il trasduttore ultrasonico su un palco di traslazione tridimensionale (3D) e posizionare la punta del trasduttore a contatto con la congiuntiva di coniglio che punta al fondo uterino. Utilizzare una goccia di lubrificante occhio alla coppia migliore la congiuntiva di punta e coniglio di trasduttore.</li>
	<li>Accendere la luce di illuminazione LED e visualizzare il fundus di coniglio attraverso il software Matlab.</li>
	<li>Insieme il ROI scansione (vasi retinici o vasi coroideali), tra cui il centro e la dimensione fisica. Aprire l'otturatore laser e avviare B-scansione del fascio. Da approssimativamente allineare il trasduttore, uno dovrebbe essere in grado di vedere riconosciuto fotoacustico segnale sull'oscilloscopio. In caso contrario, modificare leggermente la posizione degli occhi per una regione diversa della cornea di scansione o passare all'altro occhio e ripetere i processi di cui sopra.</li>
	<li>Osservare il fotoacustico rilevato segnale sull'oscilloscopio e regolare la posizione del trasduttore per massimizzare l'intensità del segnale lungo l'intera B-scan. Nota: A causa della limitata larghezza, trasduttore ultrasonico ha solitamente un piccolo FOV41. Questo passaggio determina la modulazione di sfondo delle immagini finali di PAM. Disallineamento porterà a immagini di PAM con sfondo eterogeneo e degradare notevolmente la qualità dell'immagine.</li>
	<li>Impostare i parametri di acquisizione dati. Questo include il numero di pixel (ad es., 256 × 256 pixel), frequenza di campionamento (ad es., 200 MS/s) e il tempo di ritardo. Avviare l'acquisizione dei dati. Il software Matlab si aprirà automaticamente il pulsante di scatto per passare il raggio laser quando ha iniziato e chiudere l'otturatore per bloccare il fascio al termine per evitare sovraesposizioni di laser. Nota: Limitata dal tasso di ripetizione di impulso (1 kHz) del laser, ci vogliono circa 1 minuto per completare l'acquisizione di dati di un'immagine con 256 × 256 pixel.</li>
	<li>Elaborare i dati grezzi e visualizzare l'immagine di PAM in due dimensioni (2D) attraverso la massima intensità di proiezione (MIP)13 o in 3D e rendering volumetrico38.</li>
	<li>Smontare il trasduttore ultrasonico, risciacquare con acqua deionizzata e rimetterlo alla custodia.</li>
	<li>Trasferire il coniglio alla fotocamera del fondo e riprendere l'esame del fundus. Questo passaggio consente di verificare se ci sono eventuali cambiamenti morfologici del fondo dopo la sessione di imaging.</li>
	<li>Sciacquare la cornea di coniglio con collirio ogni due minuti durante l'esperimento per prevenire keratopathy e disidratazione superficie corneale. Monitorare e registrare i segni vitali animali ogni 15 min. Nota: Il PAM, OCT ed il fondo sessioni di imaging prendere circa 1 h.</li>
</ol>6. post imaging
<ol><li>Dopo il riesame del fondo utilizzando la fotocamera del fondo, scollegare il V-gel, se collegato. Sciacquare l'occhio con collirio, applicare unguento oftalmico desametasone, flurbiprofen oftalmica e neomicina e polimixina B solfati e chiudere l'occhio.</li>
	<li>Trasferire il coniglio con la coperta di circolazione d'acqua in una camera di recupero. Proteggere la casella da luce e attendere fino a quando il coniglio si sveglia naturalmente. Durante questo periodo, monitorare i segni vitali animali ogni 15 min e tenere il registro e consegnare una copia al centro di animale per mantenimento dei registri.</li>
	<li>Una volta che il coniglio si sveglia ed è attivo, vigile e camminare normalmente, il trasporto torna alla struttura animale. Se è previsto un esperimento acuto, eutanasia animale con soluzione di eutanasia (ad es., Beuthanasia, 0,22 mL/kg, iniezione endovenosa nella vena marginale dell'orecchio) e smaltire la carcassa.</li>
	<li>Disattivare il software e il laser. Pulire il banco ottico.</li>
</ol>

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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Un film lacrimale integro e regolare è essenziale per immagini di alta qualità del fondo. Un film di usura irregolare e deteriorato può degradare significativamente immagine qualità42. Per preservare l'integrità del film lacrimale ed evitare corneale keratopathy punctate superficiale, è fondamentale per lubrificare la cornea utilizzando collirio molto frequentemente, ogni due minuti circa. Se ci sono eventuali preoccupazioni per quanto riguarda l'opacità dell'occhio, utilizzare una lampada a fessu...

Ultimi decenni hanno testimoniato lo sviluppo esplosivo del campo di fotoacustico biomedical imaging1,2,3,4,5,6,7 ,8. Basato sulla conversione di energia della luce in suono, l'imaging fotoacustico emergenti può visualizzare campioni biologici a scale da organelli, cellule, tessuti e organi al corpo intero di piccoli animali e può rivelare suo anatomiche, funzionali, molecolari, genetici, e informazioni metaboliche1,2,9,10,11,12. Formazione immagine fotoacustico ha trovato applicazioni uniche in svariati settori biomedicali, come cellula biologia13,14, biologia vascolare15,16, neurologia17,18 , oncologia19,20,21,22, dermatologia23, farmacologia24ed ematologia25,26. Sua applicazione in Oftalmologia, vale a dire fotoacustico oculare di imaging, ha suscitato notevole interesse da scienziati e clinici ed è attualmente sotto inchiesta attivo.
In contrasto con usato ordinariamente oculare imaging technologies27, quali angiografia della fluorescina (FA) e verde di indocianina (ICGA) (basato sul contrasto di fluorescenza), tomografia a coerenza ottica (OCT) (basato sul contrasto di dispersione ottica) e suoi derivato angiografia OCT (basata sul contrasto di movimento dei globuli rossi), oculare fotoacustico usi assorbimento ottico come il meccanismo di contrasto di imaging. Questo è diverso da tecnologie di imaging oculare convenzionali e fornisce uno strumento unico per lo studio di proprietà di assorbimento ottico dell'occhio, che solitamente sono associati con lo stato fisiopatologico del tessuto oculare28. Ad oggi, significativo lavoro eccellente è stato fatto in fotoacustico oculare imaging29,30,31,32,33,34,35, 36,37, ma questi studi concentrano sul segmento posteriore degli occhi di piccoli animali, come ratti e topi. Gli studi pionieristici ben dimostrano la fattibilità di fotoacustico imaging in Oftalmologia, ma c'è ancora una lunga strada da percorrere verso traduzione clinica della tecnologia dal dimensioni del bulbo oculare di ratti e topi sono molto più piccolo (meno di un terzo) di quello degli esseri umani. Dovuto la propagazione di onde ad ultrasuoni su una significativamente lunghe distanze, qualità di immagine e di intensità di segnale possono soffrire notevolmente quando la tecnica è utilizzata per il segmento posteriore degli occhi più grandi di imaging.
Verso questo obiettivo, abbiamo recentemente segnalato non invasivo, privo di etichetta coroidoretinica imaging in conigli vivente usando integrato fotoacustico microscopia (PAM) e spectral domain OCT (SD-OCT)38. Il sistema ha delle prestazioni eccellenti e potrebbe visualizzare la retina e la coroide degli occhi di animali più grandi basati su endogeno assorbimento e scattering contrasto del tessuto oculare. I risultati preliminari in conigli mostrano che il PAM non invadente ha potuto distinguere singoli vasi sanguigni della retina e della coroide usando una dose di esposizione del laser (~ 80 nJ) significativamente di sotto del limite di sicurezza di American National Standards Institute (ANSI) (160 nJ) a 570 Nm39; e l'OCT chiaramente potrebbe risolvere diversi strati della retina, la coroide e sclera. È la prima dimostrazione di formazione immagine del segmento posteriore di animali più grandi usando PAM e potrebbe essere un passo importante verso la traduzione clinica della tecnologia considerando che le dimensioni del bulbo oculare di conigli (18,1 mm)40 sono quasi l'80% della lunghezza assiale del esseri umani (23,9 mm).
In questo lavoro, forniamo una descrizione dettagliata del sistema di imaging doppia modalità e protocolli sperimentali utilizzati per l'imaging non invasivo, privo di etichetta coroidoretinica in conigli vivente e dimostrare le prestazioni del sistema tramite rappresentanza retinica e risultati di imaging coroidici.

<table><tbody><tr><td>Sistema di imaging a doppia modalità</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>OPO laser</td><td>Ekspla (Vilnius, Lituania)</td><td>NT-242</td><td></td></tr><tr><td>Attenuatore di fascio</td><td>Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA)</td><td>AHWP10M-600</td><td></td></tr><tr><td>Stadio di rotazione motorizzato</td><td>Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA)</td><td>PRM1/MZ8</td><td></td></tr><tr><td>Controllore</td> <td>dello stadio di rotazione motorizzatoThorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA)</td><td>TDC001</td><td></td></tr><tr><td>Lente di messa a fuoco</td><td>Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA)</td><td>AC254-250-B</td><td></td></tr><tr><td>Pinhole</td><td>Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA)</td><td>P50S</td><td></td></tr><tr><td>Lente di collimazione</td><td>Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA)</td><td>AC127-030-B</td><td></td></tr><tr><td>Fotodiodo</td><td>Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA)</td><td>PDA36A&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Otturatore laser</td><td>Vincent Associates Inc. (Toronto, Canada)</td><td>LS6S2T0</td><td></td></tr><tr><td>Driver per otturatore laser</td><td>Vincent Associates Inc. (Toronto, Canada)</td><td>VCM-D1</td><td></td></tr><tr><td>Specchio dicroico</td><td>Semrock, Inc. (Rochester, NY, USA)</td><td>Di03-R785-t3-25&times; 36</td><td></td></tr><tr><td>Lente di scansione</td><td>Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA)</td><td>OCT-LK3-BB</td><td></td></tr><tr><td>Lente oftalmica</td><td>Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA)</td><td>AC080-010-B-ML</td><td></td></tr><tr><td>Trasduttore a ultrasuoni</td><td>Optosonic Inc. (Arcadia, CA, USA)</td><td>Amplificatore personalizzato</td><td></td></tr><tr><td></td><td>L3 Narda-MITEQ (Hauppauge, NY, USA)</td><td>AU-1647</td><td></td></tr><tr><td>Filtro passa-banda</td><td>Mini-Circuiti (Brooklyn, NY, Stati Uniti)</td><td>BLP-30+</td><td></td></tr><tr><td>Digitalizzatore</td><td>DynamicSignals LLC (Lockport, IL, USA)</td><td>PX1500-4&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Elettronica di sincronizzazione</td><td>National Instruments Corporation (Austin, TX, USA)</td>Modulo OCT <td>USB-6353</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA)</td><td>Ganimede-II-HR</td><td></td></tr><tr><td>Vetro di compensazione della dispersione</td><td>Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA)</td><td>LSM03DC</td><td></td></tr><tr><td>Luce LED di illuminazione</td><td>Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA)</td><td>MCWHF2&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Misuratore di potenza</td><td>Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA)</td><td>S121C&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Interfaccia del misuratore di potenza</td><td>Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA)</td><td>PM100USB&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Strumento di misurazione dell'altezza&nbsp;</td><td>Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA)</td><td>BHM1</td><td></td></tr><tr><td>Fundus camera</td><td>Topcon Corporation (Tokyo, Giappone)&nbsp;</td><td>TRC 50EX</td><td></td></tr><tr><td>Matlab</td><td>MathWorks (Natick, MA, USA)</td><td>2017a</td><td></td></tr><tr><td>Oscilloscopio</td><td>Teledyne LeCroy (Chestnut Ridge, NY, USA)</td><td>WaveJet 354T</td><td></td></tr><tr><td>Esperimento sugli animali</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coperta a circolazione d'acqua</td><td>Stryker Corporation (Kalamazoo, MI, USA)</td><td>TP-700</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina cloridrato iniezione</td><td>Par pharmaceutical, Inc. (Woodcliff Lake, NJ, USA)</td><td>Codice NDC 42023-115-10</td><td></td></tr><tr><td>Xilazina cloridrato</td><td>VetOne (Boise, ID, USA)</td><td>Codice NDC 13985-704-10</td><td></td></tr><tr><td>Tropicamide oftalmica</td><td>Akorn Pharmaceuticals Inc. (Lake Forest, IL, USA)</td><td>Codice NDC 17478-102-12</td><td></td></tr><tr><td>Fenilefrina cloridrato oftalmico</td><td>Paragon BioTeck, Inc. (Portland, OR, USA)</td><td>Codice NDC 42702-102-15</td><td></td></tr><tr><td>Lubrificante oculare</td><td>Hub Pharmaceuticals LLC (Rancho Cucamonga, CA, USA)</td><td>Codice NDC 17238-610-15</td><td></td></tr><tr><td>Collirio</td><td>Altaire Pharmaceuticals, Inc. (Aquebogue, NY, USA)</td><td>Codice NDC 59390-175-18</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione oftalmica di tetracaina cloridrato</td><td>Bausch & Lomb, Inc. (Rochester, NY, USA)</td><td>Codice NDC 24208-920-64</td><td></td></tr><tr><td>Flurbiprofene soluzione oftalmica di sodio</td><td>Bausch & Lomb, Inc. (Rochester, NY, USA)</td><td>Codice NDC 24208-314-25</td><td></td></tr><tr><td>Neomicina e polimixina B Solfato e desametasone Unguento oftalmico</td><td>Bausch & Lomb, Inc. (Rochester, NY, USA)</td><td>Codice NDC 24208-795-35</td><td></td></tr><tr><td>Iniezione di meloxicam</td><td>Henry Schein Inc. (Queens, NY, USA)</td><td>Codice NDC 11695-6925-1</td><td></td></tr></tbody></table>

romanzo fotoacustico microscopia e tomografia a coerenza ottica doppia modalità coroidoretinica imaging in vita gli occhi dei conigli

Novel Photoacoustic Microscopy and Optical Coherence Tomography Dual-modality Chorioretinal Imaging in Living Rabbit Eyes

Fotoacustico oculare imaging è un'emergente oftalmiche tecnologia non invadente può visualizzare tessuto oculare convertendo l'energia luminosa in onde sonore, che è attualmente sotto indagine intensiva di imaging. Tuttavia, la maggior parte segnalati lavoro fino ad oggi si concentra sull'imaging del segmento posteriore degli occhi di piccoli animali, come ratti e topi, che pone sfide per la traduzione clinica umana a causa di dimensioni piccole del bulbo oculare. Questo manoscritto descrive un romanzo fotoacustico microscopia (PAM) e il sistema di doppia modalità tomografia a coerenza ottica per l'imaging di segmento posteriore degli occhi di animali più grandi, come i conigli. La configurazione del sistema, sistema di allineamento, preparazione degli animali e doppia modalità protocolli sperimentali per in vivo, non invasivo, privo di etichetta coroidoretinica imaging in conigli sono dettagliati. L'efficacia del metodo è dimostrato attraverso rappresentante risultati sperimentali, tra cui il sistema vascolare retinico e coroideale, ottenuti da PAM e OCT. Questo manoscritto fornisce una guida pratica per riprodurre i risultati di imaging in conigli e avanzando fotoacustico imaging oculare in animali più grandi.

Il sistema di doppia modalità di imaging e protocollo sperimentale sono stati testati con successo in laboratorio degli autori utilizzando quattro conigli bianchi della Nuova Zelanda. Il seguente mette in mostra alcuni risultati rappresentativi.
Figura 1 Mostra lo schema del sistema di imaging doppia modalità PAM e SD-OCT. È composto dai seguenti moduli: fotoacustico luce sorgente, attenuatore varia...

Questo manoscritto descrive l'installazione di romanzo e procedura di una microscopia fotoacustico e il sistema di doppia modalità di tomografia ottica di coerenza per l'imaging non invasivo, privo di etichetta corioretinica di animali più grandi, come i conigli operativa.

Romanzo fotoacustico microscopia e tomografia a coerenza ottica doppia modalità coroidoretinica Imaging in vita gli occhi dei conigli

Photoacoustic ocular imaging is an emerging ophthalmic imaging technology that can noninvasively visualize ocular tissue by converting light energy into ...

L'obiettivo generale di questa nuova configurazione di imaging e procedura operativa è quello di eseguire la microscopia fotoacustica e la tomografia a coerenza ottica in doppia modalità per l'imaging corioretinico non invasivo e senza marcatura degli occhi di mammiferi più grandi, come i conigli. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nell'imaging oftalmico sulla profondità dell'imaging, la risoluzione e la traduzione clinica necessarie per discernere la saturazione di ossigeno, la distribuzione del sangue e la melanina negli animali più grandi. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente la visualizzazione non invasiva del tessuto oculare per l'acquisizione di immagini a doppia modalità di microscopia fotoacustica e tomografia a coerenza ottica.Per iniziare, selezionare un oscillatore ottico parametrico laser pompato da un laser a stato solido con pompa a diodi come sorgente luminosa per il microscopio fotoacustico e utilizzare un divisore di fascio per dividere il raggio assistito da colonna con un rapporto di divisione di 19 riflessione per 10 di trasmissione. Successivamente deviare la parte riflessa dallo specchio M3 e dallo specchio dicroico e utilizzare un galvanometro bidimensionale per scansionare raster la riflessione. Erogare il raggio scansionato attraverso un telescopio composto da una lente scansionata con una lunghezza focale di 36 millimetri e una lente oftalmica con una lunghezza focale di 10 millimetri e focalizzare il raggio sul fondo oculare con l'ottica rabbit eye.Prima di iniziare la procedura di imaging, si prega di utilizzare una coperta riscaldante a circolazione d'acqua sul supporto del corpo e impostare la temperatura dell'acqua circolante a 38 gradi Celsius. Registrare i parametri vitali pre-procedura e confermare il livello appropriato di sedazione da parte della frequenza cardiaca e respiratoria del coniglio. Dilatare le pupille del coniglio con una goccia ciascuna di tropicamide 1% oftalmica e fenilefrina cloridrato 2,5%.Utilizzare un amplificatore a ultrasuoni per amplificare il segnale e filtrare il segnale con un filtro passa-basso. Posiziona un misuratore di potenza sopra l'occhio del coniglio e misura l'energia dell'impulso laser sulla cornea del coniglio per mantenerla al di sotto del limite di sicurezza dell'American National Standards Institute. Per consentire alla tomografia a coerenza ottica o al sistema OCT di visualizzare il segmento posteriore dell'occhio di coniglio, aggiungere una lente oftalmica dopo la lente di scansione.Utilizzare un tubo di alloggiamento dello zoom per regolare la lunghezza del braccio di riferimento e confermarne la corrispondenza con la lunghezza del percorso ottico del braccio del campione. Per l'imaging OCT nel dominio spettrale, posizionare il coniglio sulla piattaforma di imaging di una fundus camera clinica e ottenere immagini prive di rosso del fondo oculare a 50 gradi e immagini di autofluoroscenza. Successivamente, trasferisci l'animale sulla piattaforma del sistema OCT con un occhio sotto la lente oftalmica.Illumina l'occhio usando la luce LED e apri il software OCT. Controllare l'immagine della telecamera CCD del fondo oculare e tracciare una linea retta nel software per rappresentare la scansione OCT B di interesse. Iniziare la scansione regolando la lunghezza del braccio di riferimento per visualizzare l'immagine OCT e ottimizzare il fattore di compensazione della dispersione nel software OCT per ottenere immagini più nitide.Quindi impostare i dati, i parametri di acquisizione dati appropriati e salvare le immagini. Per l'imaging al microscopio fotoacustico, attivare il laser dell'oscillatore parametrico ottico. Avviare il software di controllo del microscopio fotoacustico e regolare la lunghezza d'onda del laser su uno dei picchi di assorbimento della forza cromatica mirata.Inizializzare la posizione del galvanometro e monitorare l'energia del laser prima della cornea del coniglio per confermare che sia inferiore al limite di sicurezza dell'American National Standard Institute. Mappare il trasduttore ultrasonico su uno stadio di traslazione tridimensionale e posizionare la punta del trasduttore a contatto con la congiuntiva del coniglio in modo che la punta sia rivolta verso il fondo oculare. Utilizzare una goccia di lubrificante per gli occhi per accoppiare meglio la punta del trasduttore nella congiuntiva del coniglio e accendere la luce di illuminazione a LED.Visualizza il fondo oculare del coniglio attraverso il software MatLab e imposta la regione di scansione di interesse, incluso il centro e le dimensioni fisiche della regione. Aprire l'otturatore laser e avviare la scansione B del raggio, osservando il segnale fotoacustico rilevato sull'oscilloscopio e infine sintonizzando la posizione del trasduttore per massimizzare l'intensità del segnale lungo l'intera scansione B, se necessario. Quindi impostare i parametri di acquisizione dati, elaborare i dati grezzi e visualizzare l'immagine del microscopio fotoacustico in due dimensioni.Al termine della sessione di imaging, trasferire il coniglio di nuovo alla telecamera del fondo oculare per esaminare il fondo oculare per eventuali cambiamenti morfologici post-imaging e sciacquare la cornea del coniglio con un lavaggio oculare. Applicare flurbiprofene oftalmico, neomicina e polimixina b solfati e desametasone unguento oftalmico sulla cornea e chiudere l'occhio. Quindi trasferire il coniglio e la coperta di circolazione dell'acqua in una camera di recupero con monitoraggio fino al completo recupero.In questa fotografia rappresentativa del fondo oculare, i vasi coroideali sono distribuiti sulla maggior parte dei fondi del coniglio, mentre i vasi retinici sono confinati all'interno del raggio midollare. Qui viene mostrata una tipica immagine di microscopia fotoacustica del sistema vascolare coroideale all'interno del fondo oculare con i vasi sanguigni coroideali delineati ad alta risoluzione laterale. In questa immagine OCT B, la retina, la coroide e la sclera sono visualizzate con un'alta risoluzione assiale con i vasi coroideali osservati sotto lo strato di epitelio pigmentato retinico.Utilizzando il sistema di imaging a doppia modalità, è possibile ottenere la proiezione 2D dell'intensità massima e il rendering volumetrico 3D dei vasi retinici mediante imaging fotoacustico. Le sezioni ortogonali dell'immagine 3D dimostrano come la microscopia fotoacustica possa essere utilizzata anche per visualizzare i singoli vasi retinici che si trovano sopra lo strato di epitelio pigmentato retinico e per confermare le diverse profondità a cui si trovano i vasi retinici e coroideali. Qui un'immagine della scansione OCT B mostra i singoli vasi retinici.E lo strato di fibre nervose che conferma i risultati dell'imaging al microscopio fotoacustico. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in circa un'ora se eseguita correttamente tramite Ricordarsi di impostare l'irradianza laser a bassi limiti di impostazione ANLI per ravvivare i lubrificanti una volta risciacquati gli occhi per evitare la disidratazione e per monitorare le condizioni del coniglio ogni 15 minuti. Dopo la procedura, è possibile eseguire l'immunoistochimica automatizzata su vetrino per rispondere a ulteriori domande sulla conferma dello sviluppo della neovascolarizzazione coroideale e per amplificare il volume della neovascolarizzazione nel coniglio.Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'oftalmologia per esplorare le malattie coroideali nei modelli di malattia portatrice di coniglio, compresi i modelli di neovascolarizzazione coroideale. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come rilevare i singoli vasi sanguigni corioretinici negli occhi di coniglio utilizzando un nuovo sistema di imaging molecolare multimodale per la diagnosi precoce della degenerazione maculare legata all'età umida. Non dimenticate questo.Lavorare con il laser a caduta di vetro e con gli animali può essere estremamente pericoloso e che precauzioni come indossare occhiali e camici da laboratorio dovrebbero essere sempre prese durante l'esecuzione di questa procedura.

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Fotoacustica oftalmologia (PAOM), un assorbimento ottico basato modalità di imaging, fornisce la valutazione complementare della retina alle tecnologie attualmente disponibili oftalmici imaging. Riportiamo l'utilizzo di PAOM integrato con-dominio spettrale tomografia a coerenza ottica (SD-OCT) per il controllo simultaneo di imaging multimodale retinica nel ratto.

Integrato oftalmoscopia fotoacustico e Spectral-dominio Optical Coherence Tomography

Fonte: Jagodzinska, J., et. al., Tomografia a coerenza ottica: imaging delle cellule gangliari retiniche del topo In Vivo. J. Vis. Exp. (2017) &lt;br /&gt; In questo video, dimostriamo l'uso della tomografia a coerenza ottica del dominio spettrale (SD-OCT) per visualizzare gli strati retinici e valutare i cambiamenti strutturali in un modello murino geneticamente modificato con neuropatia ottica.

Imaging in vivo della retina di topo mediante tomografia a coerenza ottica

Questo protocollo descrive come ad alta definizione tecniche di imaging come la tomografia ottica di coerenza di dominio spettrale e scansione laser oftalmoscopia può essere utilizzata in piccoli roditori, utilizzando un sistema di piattaforma di imaging oftalmico, per ottenere informazioni su lo spessore retinico e microglial cellula distribuzione, rispettivamente.

In Vivo Imaging dei topi Reporter Cx3cr1gfp/gfp con tomografia a coerenza ottica Spectral-domain e scansione Laser oftalmoscopia

Cellule epiteliali del pigmento retinico potrebbero servire come una terapia di sostituzione delle cellule per la forma avanzata di degenerazione maculare senile secca. Questo protocollo descrive la generazione di un modello di grande-eyed di atrofia geografica e il subretinal trapianto delle cellule epiteliali del pigmento retinico derivati da cellule staminali embrionali umane in questo modello della malattia.

Subretinal trapianto delle cellule epiteliali del pigmento retinico derivato di cellule staminali embrionali umane in un modello di atrofia geografica gran-eyed

Qui, presentiamo un protocollo per ottenere un ampio campo visivo (FOV) tridimensionale (3D) fluorescenza e immagine retinica OCT utilizzando una nuova piattaforma di imaging multimodale. Introdurremo l'installazione del sistema, il metodo di allineamento e i protocolli operativi. In vivo imaging sarà dimostrato, e saranno forniti risultati rappresentativi.

Multimodale Imaging retinico volumetrica da Oblique scansione Laser oftalmoscopia (oSLO) e tomografia a coerenza ottica (OCT)

Un protocollo dettagliato per la valutazione delle letture strutturali e visivi in roditori dalla risposta di tomografia e optokinetic ottica di coerenza è presentato. I risultati forniscono informazioni preziose per la ricerca oftalmologica, nonché neurologica.

Tramite tomografia ottica di coerenza e risposta Optokinetic come strutturale e funzionale sistema visivo letture in topi e ratti

Qui, descriviamo l'uso della tomografia a coerenza ottica di dominio spettrale (SD-OCT) per visualizzare strutture retiniche e oculari in vivo in modelli di degenerazione retinica, glaucoma, retinopatia diabetica e miopia.

Valutazioni strutturali in vivo della malattia oculare in modelli di roditori mediante tomografia a coerenza ottica

L'imaging in vivo è un potente strumento per lo studio della biologia in salute e malattia. Questo protocollo descrive l'imaging transpupillare della retina del topo con un microscopio standard a due fotoni. Dimostra anche diversi metodi di imaging in vivoimaging per marcare in modo fluorescente più coorti cellulari della retina.

Transpupillare Due fotoni In vivo Imaging della retina del topo

Qui, descriviamo una tecnica di imaging in vivo che utilizza la tomografia a coerenza ottica per facilitare la diagnosi e la misurazione quantitativa della retinopatia nei topi.

Applicazione della tomografia a coerenza ottica a un modello murino di retinopatia

Questo protocollo descrive un metodo affidabile per ottenere criosezioni di alta qualità di occhi interi di coniglio. Descrive in dettaglio le procedure di dissezione, fissazione, inclusione e sezionamento dell'occhio di coniglio, che possono essere facilmente adattate per l'uso in qualsiasi studio che utilizza l'immunoistochimica negli occhi più grandi.

Ottenere criosezioni di alta qualità dell'intero occhio di coniglio 

Scopri la microscopia fotoacustica e la tomografia a coerenza ottica per l'imaging coroidoretinico non invasivo negli occhi dei conigli. Questo metodo consente di visualizzare la saturazione di ossigeno e la distribuzione del sangue.

Romanzo fotoacustico microscopia e tomografia a coerenza ottica doppia modalità coroidoretinica Imaging in vita gli occhi dei conigli (Video) | JoVE Journal

Romanzo fotoacustico microscopia e tomografia a coerenza ottica doppia modalità coroidoretinica Imaging in vita gli occhi dei conigli

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