Una prova oggettiva e riproducibile di apprendimento olfattivo e discriminazione nei topi
22 marzo 2018
Qui, ci alleniamo topi su un compito di apprendimento associativo per testare la discriminazione di odore. Questo protocollo consente inoltre di studi sui cambiamenti strutturali indotti su apprendimento nel cervello.
L'obiettivo generale di questo protocollo comportamentale è addestrare i topi in modo che associno un odore a una ricompensa e un altro odore a una punizione. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle neuroscienze, come l'apprendimento, la plasticità sinaptica e la discriminazione sensoriale. Il vantaggio principale di questa tecnica è che, una volta addestrati, i topi eseguono centinaia di prove in poche ore per un robusto campionamento statistico.
Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia o alla diagnosi delle malattie neurodegenerative, perché la gravità della disfunzione olfattiva è predittiva del successivo declino cognitivo negli esseri umani. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sull'olfatto, può essere applicato anche ad altri sistemi, come la vista o l'udito. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché i passaggi iniziali sia per l'impostazione della camera di comportamento che per l'utilizzo del software sono difficili da apprendere, a causa delle diverse porte di connessione e passaggi di formazione.
Per iniziare, assembla una camera del mouse con il pavimento della camera. Tieni la scatola di allenamento in un'area poco trafficata e scarsamente illuminata per evitare distrazioni. Quindi, forare ogni porta dell'acqua con un piccolo foro sulla parte superiore, per consentire a un ago calibro 18 di erogare acqua all'interno della porta.
Riempi una fiala di vetro con l'odorizzante sciolto in olio minerale e stringi saldamente il tappo. Quindi, collegare un ago calibro 18 al tubo in silicone. Forare il tappo della fiala di vetro e collegare l'altra estremità del tubo in silicone all'aspirazione delle porte degli odori.
Successivamente, posizionare ciascun tubo di silicone in una valvola per gli odori. Collegare la linea del vuoto alle porte degli odori. Collegare due siringhe da 10 millilitri a un'asta di supporto in metallo e collegare il tubo alle siringhe.
Successivamente, collegare l'altro lato del tubo a un ago calibro 18. Inserire l'ago nel foro praticato della porta di innesco del naso sulla camera del mouse e collegare l'altra estremità del tubo alla valvola dell'acqua. Riempi le due siringhe da 10 millilitri con acqua potabile per roditori.
Quindi collegare un misuratore di flusso d'aria alla presa d'aria e mantenere il flusso d'aria da tre a cinque litri al minuto. Collegare le due valvole dell'acqua, le due valvole degli odori, le due porte dell'acqua, la porta degli odori e l'alimentazione al sistema di interfaccia USB. Infine, collegare la scatola di interfaccia USB all'alimentazione.
Quindi, regolare l'aspirazione del vuoto per evitare la contaminazione incrociata degli odori tra le prove e utilizzare tubi specifici per gli odori per collegare le fiale di odoresi alla camera. Per preparare i topi all'allenamento, iniziare la restrizione idrica a 40 millilitri per chilogrammo al giorno. Pesa i topi ogni giorno per assicurarti che siano superiori all'80% del peso di base e mantieni costanti tutti i fattori ambientali durante tutto il protocollo, inclusi temperatura, rumore e odori vaganti.
Pulisci la gabbia prima che ogni mouse venga trasferito su di essa. Spruzzare e pulire la camera con etanolo al 70% per ridurre al minimo la distrazione dell'odore del topo. Per la prima fase di addestramento, configurare la scatola di comportamento con una porta d'acqua al centro e con tutte le porte laterali inaccessibili.
Metti un mouse nella camera e chiudila. Quindi, inizia il programma della prima fase. Considera questa fase come completa quando il topo raggiunge 100 prove entro 60 minuti.
Rimuovi il mouse dalla camera dopo 60 minuti, o sono state completate 100 prove. Per la seconda fase di addestramento, configura questa e tutte le fasi successive con due porte per l'acqua sui lati e la porta per gli odori al centro. Metti un mouse nella camera e chiudila.
Quindi, inizia il programma della seconda fase. Considera questa fase come completa quando vengono eseguite un minimo di 40 prove in 60 minuti, con almeno il 25% delle ricompense in acqua ricevute entro cinque secondi dal colpo del muso centrale a sinistra. Rimuovi il mouse una volta completata questa fase.
Per la terza fase di addestramento, collegare l'S-plus odor al controller di erogazione degli odori. Metti un mouse nella camera e chiudila. Successivamente, inizia il programma della terza fase.
Considera questa fase come completa quando ci sono più di 60 ricompense entro 60 minuti e rimuovi il mouse una volta che la fase ha gareggiato. Per l'addestramento della fase quattro-A, impostare la configurazione della scatola come la fase tre precedente. Quindi, collegare sia l'odore S-plus che S-minus al controller di erogazione degli odori.
Metti un mouse nella camera e chiudila. Quindi, inizia il programma della fase quattro-A. Dopo che il mouse ha completato 40 prove, cambia il programma per erogare casualmente gli odori.
Rimuovi il mouse una volta completata la fase. Per l'addestramento alla fase quattro-B, fai in modo che questa fase sia identica alla fase quattro-A. Tuttavia, la punizione per il timeout per il tentativo di una ricompensa in acqua dopo un odore S-minus è di quattro secondi.
Collegare sia l'odore S-plus che S-minus al controller di erogazione degli odori. Metti un mouse nella camera. Chiudere la camera del mouse e iniziare il programma stage quattro-B.
Considerare questa fase completa quando ci sono più di 100 prove entro 60 minuti, con una precisione superiore all'85%Per il test passa/non passa, impostare la configurazione della scatola come la precedente fase quattro-B. Collegare sia l'odore S-plus che S-minus al controller di erogazione degli odori. Quindi, posiziona un topo nella camera.
Inizia il programma go/no-go e poi esponi il topo che ha appreso il compito di apprendimento olfattivo a nuove coppie di odori chimicamente simili. Una volta che i topi hanno appreso il compito di apprendimento olfattivo, possono associare nuove coppie di odori a ricompensa e punizione. Questi topi addestrati normalmente iniziano con una precisione di circa il 50% nell'attività go/no-go.
La percentuale corretta può essere tracciata per blocco di prova come curva di apprendimento per nuove coppie di odori. Entro 10 prove a blocchi, i topi sono in grado di discriminare correttamente tra gli odori, con una precisione superiore all'85%. Ciò dimostra che il nostro protocollo ha addestrato con successo topi di tipo selvatico ad associare un odore a una ricompensa per l'acqua e un altro a una punizione per il timeout.
Una volta che i topi imparano il compito, le coppie di odori possono essere modificate per aumentare o diminuire la difficoltà del compito. Ad esempio, diminuendo la concentrazione della coppia di odori aumenta la difficoltà del compito. I topi sono anche in grado di ricordare le precedenti coppie di odori apprese.
Dopo aver atteso sette giorni dall'apprendimento del compito, un test di richiamo mostra che i topi wild-type possono ricordare rapidamente le associazioni di odori apprese in precedenza. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di assicurarsi che gli odorizzanti desiderati siano collegati correttamente alla casella del comportamento. È particolarmente importante se più sperimentatori utilizzano odori diversi.
Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come la mappatura degli odori per rispondere a ulteriori domande come: in che modo l'apprendimento influenza il modo in cui le informazioni sensoriali sono rappresentate dal cervello? Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo delle neuroscienze per esplorare i cambiamenti neurali indotti dall'apprendimento nel sistema olfattivo del topo. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come insegnare ai topi ad associare un odore a una ricompensa e un altro odore a una punizione.
Non dimenticare che lavorare con aghi affilati può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni come il corretto smaltimento degli oggetti taglienti.
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Panoramica
Questo studio analizza la discriminazione degli odori mediante un compito di apprendimento associativo nei topi, concentrandosi sui cambiamenti strutturali indotti dall'apprendimento nel cervello. La tecnica esamina questioni fondamentali delle neuroscienze, come la discriminazione sensoriale e la plasticità sinaptica.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Olfatto
- Apprendimento comportamentale
Sfondo
- I protocolli di apprendimento associativo sono fondamentali per lo studio delle funzioni cognitive.
- La discriminazione degli odori svolge un ruolo cruciale nell'elaborazione sensoriale dei mammiferi.
- Comprendere il comportamento olfattivo nei topi potrebbe essere correlato al declino cognitivo umano.
- Questo metodo può essere adattato ad altri sistemi sensoriali come la visione e l'udito.
Scopo dello studio
- Addestrare i topi ad associare odori a ricompense e punizioni.
- Esplorare l'elaborazione olfattiva e le sue implicazioni nelle malattie neurodegenerative.
- Sviluppare un saggio comportamentale robusto per l'analisi statistica dell'apprendimento.
Metodi Utilizzati
- I topi vengono addestrati utilizzando una camera comportamentale appositamente configurata.
- L'addestramento prevede diverse fasi, valutando l'accuratezza nella discriminazione degli odori.
- Non sono menzionati flussi di lavoro di multiomica.
- I passaggi critici includono la restrizione dell'acqua per gestire la motivazione e i criteri di completamento delle fasi.
- Le procedure includono l'accurata configurazione dei sistemi di somministrazione degli odori e dei protocolli di condizionamento.
Risultati principali
- I topi imparano con successo ad associare diversi odori a ricompense o punizioni.
- L'addestramento consente un elevato campionamento statistico attraverso prove ripetute.
- L'accuratezza nella discriminazione degli odori raggiunge circa l'85% dopo l'addestramento.
- I risultati indicano che l'apprendimento olfattivo può essere valutato efficacemente mediante questo protocollo.
Conclusioni
- Il protocollo dimostra un metodo affidabile per lo studio dell'apprendimento associativo nell'olfatto.
- Questo approccio potrebbe fornire spunti per strategie terapeutiche nei confronti delle malattie neurodegenerative.
- I risultati migliorano la comprensione dei meccanismi di discriminazione sensoriale nei mammiferi.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questo protocollo consente una valutazione quantitativa ad alto rendimento dell'apprendimento olfattivo e della discriminazione nei topi, fornendo un output comportamentale robusto per la validazione di bersagli nella scoperta di farmaci nel campo delle neuroscienze. Supportando l'analisi meccanicistica e la riduzione dei rischi associati alla funzione e plasticità dei circuiti olfattivi, esso orienta i test iniziali delle ipotesi relative a composti diretti contro disturbi neurodegenerativi o del processamento sensoriale. La riproducibilità e la scalabilità del saggio facilitano l'allineamento tra squadre di ricerca biologica e ricerca traslazionale.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche relative all'apprendimento olfattivo, alla plasticità sinaptica e ai meccanismi di discriminazione sensoriale.
- Valore operativo: Supporta la riduzione del rischio biologico quantificando l'apprendimento per associazione odorosa e il mantenimento della memoria in un sistema controllato e riproducibile.
- Valore predittivo: Genera dati comportamentali quantitativi (ad esempio, tassi di accuratezza, curve di apprendimento) che aiutano nella selezione del portafoglio e nelle decisioni di avanzamento o interruzione per composti mirati al sistema nervoso centrale.
Sviluppo di screening e saggi
- Prontezza del saggio: Produce sistemi biologici validati (topi addestrati) in grado di eseguire centinaia di prove automatizzate al giorno, consentendo una valutazione affidabile dei composti.
- Standardizzazione: Garantisce la riproducibilità attraverso rigorosi controlli ambientali, protocolli di restrizione idrica e criteri di addestramento basati su stadi.
- Scalabilità: Facilita campionamenti statistici elevati e studi longitudinali, supportando l'adattamento del saggio per schermature dose-risposta o nel tempo.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Rilevanza per la malattia: Si allinea alla disfunzione olfattiva umana come biomarcatore predittivo del declino cognitivo, sostenendo la continuità traslazionale dai modelli murini alla valutazione del rischio clinico.
- De-risking meccanicistico: Permette lo studio della sopravvivenza neuronale e della plasticità dipendenti dall'attività, collegando il comportamento a letture biochimiche, elettrofisiologiche o di imaging a valle.
- Avanzamento aggiustato per il rischio: Supporta le decisioni sugli effetti del composto sulle modifiche neurali indotte dall'apprendimento, riducendo il rischio biologico in fase avanzata nei programmi sensoriali o neurodegenerativi.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nel percorso di scoperta, dalla validazione iniziale della proteina bersaglio fino alla validazione preclinica, in particolare per progetti incentrati sull'elaborazione olfattiva, sulla discriminazione sensoriale o sui meccanismi delle malattie neurodegenerative.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi mediante la misurazione di come l'apprendimento olfattivo alteri la struttura e la funzione neuronale.
- Screening: Fornisce output quantitativi e riproducibili (accuratezza del test, curve di apprendimento) che consentono il confronto tra diverse condizioni sperimentali o modelli genetici.
- Analisi: Offre curve di apprendimento statistiche e soglie di discriminazione che aiutano i gruppi di lavoro a valutare gli effetti dei composti sul trattamento sensoriale e sulla memoria.
- Ricerca traslazionale: Si collega alla validazione preclinica attraverso l'allineamento con biomarcatori olfattivi umani predittivi del declino cognitivo.
- Riutilizzo aziendale: Funziona come piattaforma comportamentale riutilizzabile per test iterativi su più composti, genotipi o manipolazioni ambientali.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione degli obiettivi riducendo l'ambiguità meccanicistica nei percorsi di apprendimento olfattivo e di plasticità.
- Valore operativo: Garantisce standardizzazione, riproducibilità e scalabilità attraverso l'esecuzione automatizzata delle prove e rigorosi controlli procedurali.
- Valore strategico: Migliora l'efficienza del capitale consentendo una riduzione precoce dei rischi associati agli obiettivi del sistema nervoso centrale e riducendo il rischio di fallimento nelle fasi successive.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione dei composti aggiustata per il rischio in base agli effetti sull'apprendimento, sulla memoria e sulla discriminazione sensoriale.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche in neuroscienze comportamentali, anatomia del sistema olfattivo e tecniche di condizionamento operante.
- Si basa su strumentazione specializzata, inclusi sistemi di somministrazione degli odori, valvole per l'acqua, linee sottovuoto e controller di interfaccia USB.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per quanto riguarda i controlli ambientali (odori, rumore, temperatura) e i protocolli di addestramento, al fine di garantire la riproducibilità.
- Comporta considerazioni relative all'adattamento dei protocolli in caso di trasferimento tra diverse linee di topi, età diverse o proprietà fisico-chimiche differenti degli odoranti.
- Presenta limitazioni pratiche, come la complessità dell'allestimento, i rischi legati all'uso di aghi e la necessità di un trattamento costante degli animali per evitare fattori di confondimento dovuti a distrazioni o stress.
