Una prova oggettiva e riproducibile di apprendimento olfattivo e discriminazione nei topi
March 22nd, 2018
Qui, ci alleniamo topi su un compito di apprendimento associativo per testare la discriminazione di odore. Questo protocollo consente inoltre di studi sui cambiamenti strutturali indotti su apprendimento nel cervello.
L'obiettivo generale di questo protocollo comportamentale è addestrare i topi in modo che associno un odore a una ricompensa e un altro odore a una punizione. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle neuroscienze, come l'apprendimento, la plasticità sinaptica e la discriminazione sensoriale. Il vantaggio principale di questa tecnica è che, una volta addestrati, i topi eseguono centinaia di prove in poche ore per un robusto campionamento statistico.
Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia o alla diagnosi delle malattie neurodegenerative, perché la gravità della disfunzione olfattiva è predittiva del successivo declino cognitivo negli esseri umani. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sull'olfatto, può essere applicato anche ad altri sistemi, come la vista o l'udito. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché i passaggi iniziali sia per l'impostazione della camera di comportamento che per l'utilizzo del software sono difficili da apprendere, a causa delle diverse porte di connessione e passaggi di formazione.
Per iniziare, assembla una camera del mouse con il pavimento della camera. Tieni la scatola di allenamento in un'area poco trafficata e scarsamente illuminata per evitare distrazioni. Quindi, forare ogni porta dell'acqua con un piccolo foro sulla parte superiore, per consentire a un ago calibro 18 di erogare acqua all'interno della porta.
Riempi una fiala di vetro con l'odorizzante sciolto in olio minerale e stringi saldamente il tappo. Quindi, collegare un ago calibro 18 al tubo in silicone. Forare il tappo della fiala di vetro e collegare l'altra estremità del tubo in silicone all'aspirazione delle porte degli odori.
Successivamente, posizionare ciascun tubo di silicone in una valvola per gli odori. Collegare la linea del vuoto alle porte degli odori. Collegare due siringhe da 10 millilitri a un'asta di supporto in metallo e collegare il tubo alle siringhe.
Successivamente, collegare l'altro lato del tubo a un ago calibro 18. Inserire l'ago nel foro praticato della porta di innesco del naso sulla camera del mouse e collegare l'altra estremità del tubo alla valvola dell'acqua. Riempi le due siringhe da 10 millilitri con acqua potabile per roditori.
Quindi collegare un misuratore di flusso d'aria alla presa d'aria e mantenere il flusso d'aria da tre a cinque litri al minuto. Collegare le due valvole dell'acqua, le due valvole degli odori, le due porte dell'acqua, la porta degli odori e l'alimentazione al sistema di interfaccia USB. Infine, collegare la scatola di interfaccia USB all'alimentazione.
Quindi, regolare l'aspirazione del vuoto per evitare la contaminazione incrociata degli odori tra le prove e utilizzare tubi specifici per gli odori per collegare le fiale di odoresi alla camera. Per preparare i topi all'allenamento, iniziare la restrizione idrica a 40 millilitri per chilogrammo al giorno. Pesa i topi ogni giorno per assicurarti che siano superiori all'80% del peso di base e mantieni costanti tutti i fattori ambientali durante tutto il protocollo, inclusi temperatura, rumore e odori vaganti.
Pulisci la gabbia prima che ogni mouse venga trasferito su di essa. Spruzzare e pulire la camera con etanolo al 70% per ridurre al minimo la distrazione dell'odore del topo. Per la prima fase di addestramento, configurare la scatola di comportamento con una porta d'acqua al centro e con tutte le porte laterali inaccessibili.
Metti un mouse nella camera e chiudila. Quindi, inizia il programma della prima fase. Considera questa fase come completa quando il topo raggiunge 100 prove entro 60 minuti.
Rimuovi il mouse dalla camera dopo 60 minuti, o sono state completate 100 prove. Per la seconda fase di addestramento, configura questa e tutte le fasi successive con due porte per l'acqua sui lati e la porta per gli odori al centro. Metti un mouse nella camera e chiudila.
Quindi, inizia il programma della seconda fase. Considera questa fase come completa quando vengono eseguite un minimo di 40 prove in 60 minuti, con almeno il 25% delle ricompense in acqua ricevute entro cinque secondi dal colpo del muso centrale a sinistra. Rimuovi il mouse una volta completata questa fase.
Per la terza fase di addestramento, collegare l'S-plus odor al controller di erogazione degli odori. Metti un mouse nella camera e chiudila. Successivamente, inizia il programma della terza fase.
Considera questa fase come completa quando ci sono più di 60 ricompense entro 60 minuti e rimuovi il mouse una volta che la fase ha gareggiato. Per l'addestramento della fase quattro-A, impostare la configurazione della scatola come la fase tre precedente. Quindi, collegare sia l'odore S-plus che S-minus al controller di erogazione degli odori.
Metti un mouse nella camera e chiudila. Quindi, inizia il programma della fase quattro-A. Dopo che il mouse ha completato 40 prove, cambia il programma per erogare casualmente gli odori.
Rimuovi il mouse una volta completata la fase. Per l'addestramento alla fase quattro-B, fai in modo che questa fase sia identica alla fase quattro-A. Tuttavia, la punizione per il timeout per il tentativo di una ricompensa in acqua dopo un odore S-minus è di quattro secondi.
Collegare sia l'odore S-plus che S-minus al controller di erogazione degli odori. Metti un mouse nella camera. Chiudere la camera del mouse e iniziare il programma stage quattro-B.
Considerare questa fase completa quando ci sono più di 100 prove entro 60 minuti, con una precisione superiore all'85%Per il test passa/non passa, impostare la configurazione della scatola come la precedente fase quattro-B. Collegare sia l'odore S-plus che S-minus al controller di erogazione degli odori. Quindi, posiziona un topo nella camera.
Inizia il programma go/no-go e poi esponi il topo che ha appreso il compito di apprendimento olfattivo a nuove coppie di odori chimicamente simili. Una volta che i topi hanno appreso il compito di apprendimento olfattivo, possono associare nuove coppie di odori a ricompensa e punizione. Questi topi addestrati normalmente iniziano con una precisione di circa il 50% nell'attività go/no-go.
La percentuale corretta può essere tracciata per blocco di prova come curva di apprendimento per nuove coppie di odori. Entro 10 prove a blocchi, i topi sono in grado di discriminare correttamente tra gli odori, con una precisione superiore all'85%. Ciò dimostra che il nostro protocollo ha addestrato con successo topi di tipo selvatico ad associare un odore a una ricompensa per l'acqua e un altro a una punizione per il timeout.
Una volta che i topi imparano il compito, le coppie di odori possono essere modificate per aumentare o diminuire la difficoltà del compito. Ad esempio, diminuendo la concentrazione della coppia di odori aumenta la difficoltà del compito. I topi sono anche in grado di ricordare le precedenti coppie di odori apprese.
Dopo aver atteso sette giorni dall'apprendimento del compito, un test di richiamo mostra che i topi wild-type possono ricordare rapidamente le associazioni di odori apprese in precedenza. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di assicurarsi che gli odorizzanti desiderati siano collegati correttamente alla casella del comportamento. È particolarmente importante se più sperimentatori utilizzano odori diversi.
Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come la mappatura degli odori per rispondere a ulteriori domande come: in che modo l'apprendimento influenza il modo in cui le informazioni sensoriali sono rappresentate dal cervello? Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo delle neuroscienze per esplorare i cambiamenti neurali indotti dall'apprendimento nel sistema olfattivo del topo. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come insegnare ai topi ad associare un odore a una ricompensa e un altro odore a una punizione.
Non dimenticare che lavorare con aghi affilati può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni come il corretto smaltimento degli oggetti taglienti.
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Panoramica
Questo studio indaga la discriminazione degli odori utilizzando un compito di apprendimento associativo nei topi, concentrandosi sui cambiamenti strutturali indotti dall'apprendimento nel cervello. La tecnica esamina questioni chiave della neuroscienza come la discriminazione sensoriale e la plasticità sinaptica.
Componenti chiave dello studio
Area della scienza
- Neuroscienza
- Olfatto
- Apprendimento comportamentale
Sfondo
- I protocolli di apprendimento associativo sono fondamentali per studiare le funzioni cognitive.
- La discriminazione degli odori svolge un ruolo cruciale nell'elaborazione sensoriale nei mammiferi.
- Comprendere il comportamento olfattivo nei topi potrebbe essere correlato al declino cognitivo umano.
- Questo metodo può essere adattato ad altri sistemi sensoriali come la visione e l'udito.
Obiettivo dello studio
- Addestrare i topi ad associare gli odori con ricompense e punizioni.
- Esplorare l'elaborazione olfattiva e le sue implicazioni per le malattie neurodegenerative.
- Sviluppare un robusto test comportamentale per l'analisi statistica dell'apprendimento.
Metodi utilizzati
- I topi sono addestrati utilizzando una camera comportamentale appositamente configurata.
- L'addestramento coinvolge varie fasi, valutando l'accuratezza nella discriminazione degli odori.
- Non sono menzionati flussi di lavoro multiomics.
- Le fasi critiche includono la restrizione idrica per gestire la motivazione e i criteri di completamento delle fasi.
- Le procedure includono una meticolosa configurazione dei sistemi di erogazione degli odori e dei protocolli di condizionamento.
Risultati principali
- I topi riescono ad associare con successo odori diversi a ricompense o punizioni.
- L'addestramento consente un'alta campionatura statistica attraverso ripetuti tentativi.
- L'accuratezza nella discriminazione degli odori si avvicina all'85% dopo l'addestramento.
- I risultati suggeriscono che l'apprendimento olfattivo può essere efficacemente valutato attraverso questo protocollo.
Conclusioni
- Il protocollo dimostra un metodo affidabile per studiare l'apprendimento associativo nell'olfatto.
- Questo approccio potrebbe offrire spunti per strategie terapeutiche per le malattie neurodegenerative.
- I risultati migliorano la comprensione dei meccanismi di discriminazione sensoriale nei mammiferi.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
This protocol enables high-throughput, quantitative assessment of olfactory learning and discrimination in mice, providing a robust behavioral readout for target validation in neuroscience drug discovery. By supporting mechanistic de-risking of olfactory circuit function and plasticity, it informs early-stage hypothesis testing for compounds targeting neurodegenerative or sensory processing disorders. The assay’s reproducibility and scalability facilitate cross-functional alignment between discovery biology and translational research teams.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses related to olfactory learning, synaptic plasticity, and sensory discrimination mechanisms.
- Operational Value: Supports biological de-risking by quantifying odor association learning and memory retention in a controlled, reproducible system.
- Predictive Value: Generates quantitative behavioral data (e.g., accuracy rates, learning curves) that aid in portfolio triage and go/no-go decisions for CNS-targeted compounds.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces validated biological systems (trained mice) capable of hundreds of automated trials daily, enabling reliable compound evaluation.
- Standardization: Ensures reproducibility through strict environmental controls, water restriction protocols, and stage-based training criteria.
- Scalability: Facilitates high statistical sampling and longitudinal studies, supporting assay adaptation for dose-response or time-course screening.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Aligns with human olfactory dysfunction as a predictive biomarker of cognitive decline, supporting translational continuity from mouse models to clinical risk assessment.
- Mechanistic De-risking: Enables study of activity-dependent neuronal survival and plasticity, linking behavior to downstream biochemical, electrophysiological, or imaging readouts.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports decisions on compound effects on learning-induced neural changes, reducing late-stage biological risk in sensory or neurodegenerative programs.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from early target validation through preclinical validation, particularly for projects focused on olfactory processing, sensory discrimination, or neurodegenerative disease mechanisms.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by measuring how odor learning alters neural structure and function.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible outputs (trial accuracy, learning curves) that enable comparison across experimental conditions or genetic models.
- Analytics: Provides statistical learning curves and discrimination thresholds that help teams assess compound effects on sensory processing and memory.
- Translational Research: Connects to preclinical validation through alignment with human olfactory biomarkers predictive of cognitive decline.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable behavioral platform for iterative testing across multiple compounds, genotypes, or environmental manipulations.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in olfactory learning and plasticity pathways.
- Operational Value: Delivers standardization, reproducibility, and scalability through automated trial performance and strict procedural controls.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of CNS targets and reducing failure risk in later stages.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of compounds based on effects on learning, memory, and sensory discrimination.
Implementation Considerations
- Requires expertise in behavioral neuroscience, olfactory system anatomy, and operant conditioning techniques.
- Depends on specialized instrumentation including odor delivery systems, water valves, vacuum lines, and USB interface controllers.
- Necessitates cross-team standardization of environmental controls (odor, noise, temperature) and training protocols to ensure reproducibility.
- Involves adaptation considerations when transferring protocols across mouse strains, ages, or odorant physicochemical properties.
- Includes practical limitations such as setup complexity, needle hazards, and the need for consistent animal handling to avoid distraction or stress confounds.
