Name: Un metodo per il trapianto dellisolotto al omento in Mouse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 25 s
Description: Impara il trapianto di isole pancreatiche nell'omentum di topi diabetici utilizzando idrogel per migliorare la sopravvivenza cellulare. Questo metodo avanza le terapie per il diabete di tipo I.

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Alcuni degli autori di questo lavoro sono state sostenute in parte dalle concessioni dal nazionali chiave R & D programma della Cina (2017YFC1103704), progetto di Sanming di medicina a Shenzhen (SZSM201412020), fondo per l'alto livello medico disciplina costruzione di Shenzhen (2016031638), Shenzhen Fondazione di scienza e tecnologia (JCJY20160229204849975, GJHZ20170314171357556, JCYJ20160425110110658), Fondazione di Shenzhen della salute e della Commissione di pianificazione familiare (SZXJ2017021).

Tutti i topi utilizzati in questo studio sono stati ottenuti dal centro medico animale di Guangdong. L'uso degli animali è stato approvato dall'ospedale del popolo secondo Shenzhen di comitato recensione etica, secondo i principi del benessere degli animali.
1. islet trapianto al omento
Nota: Questo protocollo richiede 2 persone compire.
<ol><li>Assemblare materiali chirurgici che sono elencati nella tabella 1. Preparare campo asettico in area chirurgica con materiali sterili quali tende e USA e getta e mantenere condizioni asettiche durante la chirurgia. Sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici. Indossare abiti da sterile.</li>
	<li>Scegli gli isolotti utilizzando una punta di pipetta 200 µ l sotto lo stereomicroscopio. Ogni mouse riceverà 450 – 500 isolotto equivalente (IEQ) a tansplant. Per ogni animale, posto abbastanza isolotti per un singolo trapianto in un tubo di snap-top sterili da 1,5 mL con 100 µ l di terreno di CMRL-1066. Nota: Gli isolotti possono essere isolati il giorno del trapianto, ma è meglio isolarli il giorno prima per permettere il recupero per il processo di isolamento.</li>
	<li>Mantenere le provette snap-top con isolotti su ghiaccio fino al momento del trapianto.</li>
	<li>Scongelare l'idrogel di matrice della membrana dello scantinato e tenerlo sul ghiaccio dopo averlo tolto dal congelatore a-20 ° C. L'idrogel è liquido a 4 ° C a 10 ° C e si solidifica a temperature più elevate.</li>
	<li>Pesare e tag tutti i topi diabetici di destinatario. Iniettare sodio pentobarbital 60 mg/kg per via intraperitoneale. Prova la profondità dell'anestesia con la somministrazione di un pizzico di punta. Dare un sodio pentobarbital ulteriori 10 mg/kg se l'animale reagisce per il pizzico. Se non c'è nessun ritirare riflesso, il livello di anestesia è corretto per la chirurgia.</li>
	<li>Tamponare il sito chirurgico sull'addome con etanolo al 70%. Radersi i capelli dal sito con una lama di razer e disinfettare la zona con iodoforo. Amministrare veterinario unguento per gli occhi per prevenire la secchezza mentre sotto anestesia.</li>
	<li>Utilizzare le forbici oftalmiche per aprire l'addome lungo la linea mediana dell'addome con un'incisione di 4-5 cm. mossa gli intestini al lato sinistro e coprire con garza imbevuta salina per prevenire la disidratazione eccessiva durante la procedura di chirurgia.</li>
	<li>Utilizzare tamponi di cotone per completamente esporre il campo visivo dello stomaco e individuare l'omento (situato sotto lo stomaco). Utilizzare due coppie di una pinzetta per distendere l'omento. Fare attenzione a evitare danni dallo strappo.</li>
	<li>L'idrogel è completamente sciolto a questo punto. Girare il tubo con gli isolotti per 30 s a 200 x g e rimuovere il surnatante. 50 µ l di idrogel di aspirare, aggiungerlo nella provetta contenente gli isolotti e risospendere il mix delicatamente evitando la formazione di bolle. Mantenere i tubi sul ghiaccio durante la procedura.</li>
	<li>Utilizzare due paia di pinze per prendere i bordi dell'omento e sollevarlo delicatamente per formare una scanalatura tra la parete gastrica e dell'intestino che può ospitare un piccolo volume di liquido con l'innesto dell'isolotto.</li>
	<li>Lasciate che la seconda persona assistere nella procedura e aspirare la miscela di sedimento dell'isolotto-idrogel (l'intero contenuto del tubo) con una punta di pipetta 200 µ l, distribuire il contenuto nella scanalatura.</li>
	<li>Assicurare che la miscela sia ben posizionata nella scanalatura delicatamente alzando o abbassando i bordi dell'omento. Completo di posizionamento della miscela all'interno di 3 min prima l'idrogel si solidifica come un effetto della temperatura corporea. Dopo aver impostato l'idrogel, piegare l'omento per coprire l'innesto. Nota: omento aderirà alla parete gastrica circostante come l'idrogel si solidifica.</li>
	<li>Dopo l'idrogel è completamente solidificato, utilizzare tamponi di cotone per riposizionare l'intestino nella cavità addominale, facendo attenzione a non per toccare il sito di trapianto.</li>
	<li>Aggiungere 20 µ l di cefalosporina (5 ~ 10 mg) nella cavità addominale per prevenire l'infezione, quindi utilizzare sutura 4-0 per chiudere l'addome.</li>
	<li>Tornare il mouse alla sua gabbia e ripetere tutti i passaggi per ogni destinatario del mouse. Tenere in caldo i topi e monitorare visivamente fino a quando non riacquistano pienamente sufficiente coscienza per mantenere decubito sternale. Tenere i topi separati dagli altri animali fino a quando non hanno pienamente recuperato.</li>
	<li>Iniettare 50 µ l di sodio cefazolina (0,05 mg/mL) ogni giorno per una settimana come profilassi post-operatoria. Amministrare la lidocaina + buprenorfina, vale a dire applicare 1-3 gocce di 0,25% lidocaina al sito di incisione per via topica prima del posizionamento delle clip di ferita. Amministrare Buprenorphine(0.03 mg/ml with sterile 0.9% saline, 0.05-0.10 mg/kg) la via della intraperitoneale (IP).</li>
	<li>Misurare il livello di glucosio nel sangue non a digiuno da un campione di sangue della vena caudale utilizzando un misuratore di glucosio del sangue una volta al giorno dopo il trapianto. Quando trapiantare l'omento, l'innesto dell'isolotto può avere una funzione in ritardo e non raggiungere un livello di glucosio nel sangue completamente normale per 2 – 3 settimane.</li>
	<li>Per istologia, rimuovere l'innesto omentale dal mouse alla fine dell'esperimento dopo il trapianto. Difficoltà il tessuto secondo i protocolli istologici. L'innesto può essere analizzato per immunostaining o immunofluorescenza studi.</li>
</ol>2. in alternativa per il trapianto al omento
Nota: Un idrogel di fibrina-trombina alternativo che viene utilizzata a temperatura ambiente può essere sostituito per l'idrogel di matrice della membrana dello scantinato. Si compone di 2 componenti, una soluzione di proteine del sigillante di fibrina (50 U/mL trombina e fibrinogeno di 10 mg/mL). Quando i componenti vengono miscelati, formano un coagulo che trattiene gli isolotti in posizione.
<ol><li>Utilizzare l'idrogel di fibrina-thombin composto a temperatura ambiente. Come descritto al punto 1.2, ogni mouse riceverà 450 – 500 equivalenti di isolotto (IEQ) per trapianto. Posizionare gli isolotti in un tubo di snap-top sterili da 1,5 mL con 100 µ l di terreno di CMRL-1066. Immediatamente prima del trapianto, aspirare gli isolotti in una tubazione PE50 sterile per una lunghezza di 10 cm e centrifugare delicatamente (30 s a 200 x g) per formare un pellet sciolto.</li>
	<li>Preparare l'animale come indicato in precedenza (passaggi 1.5-1.8) con l'omento sparso. Miscelare i componenti di idrogel (10 µ l/CAD) e posizionare il omento. (Figura 3D)</li>
	<li>Espellere immediatamente gli isolotti dal tubo sull'idrogel. L'idrogel forma un coagulo intorno gli isolotti. (Figura 3E)</li>
	<li>Ripiegare l'omento l'idrogel e isolotti per formare un sacchetto. (Figura 3F) Continuare con i passaggi 1.13 a 1.18.</li>
</ol>

<ol><li>Guariguata, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+estimates+of+diabetes+prevalence+for+2013+and+projections+for+2035%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+research+and+clinical+practice%22%5BJournal%5D)">Global estimates of diabetes prevalence for 2013 and projections for 2035.</a> Diabetes research and clinical practice. 103 (2), 137-149 (2014).</li>
<li>Bellin, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potent+Induction+Immunotherapy+Promotes+Long-Term+Insulin+Independence+After+Islet+Transplantation+in+Type+1+Diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Potent Induction Immunotherapy Promotes Long-Term Insulin Independence After Islet Transplantation in Type 1 Diabetes.</a> American Journal of Transplantation. 12 (6), 1576-1583 (2012).</li>
<li>Moberg, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+tissue+factor+by+pancreatic+islet+cells+as+a+trigger+of+detrimental+thrombotic+reactions+in+clinical+islet+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22The+lancet%22%5BJournal%5D)">Production of tissue factor by pancreatic islet cells as a trigger of detrimental thrombotic reactions in clinical islet transplantation.</a> The lancet. 360 (9350), 2039-2045 (2002).</li>
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<li>Bellin, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Similar+islet+function+in+islet+allotransplant+and+autotransplant+recipients%2C+despite+lower+islet+mass+in+autotransplants%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Similar islet function in islet allotransplant and autotransplant recipients, despite lower islet mass in autotransplants.</a> Transplantation. 91 (3), 367-372 (2011).</li>
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<li>Schmidt, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+islets+find+a+new+transplant+home+in+the+omentum%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Pancreatic islets find a new transplant home in the omentum.</a> Nature Biotechnology. 35 (1), 82017(2017).</li>
<li>Voigt, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+and+Progression+Rate+of+Diabetic+Retinopathy+in+Type+2+Diabetes+Patients+in+Correlation+with+the+Duration+of+Diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Clin+Endocrinol+Diabetes%22%5BJournal%5D)">Prevalence and Progression Rate of Diabetic Retinopathy in Type 2 Diabetes Patients in Correlation with the Duration of Diabetes.</a> Exp Clin Endocrinol Diabetes. , (2017).</li>
<li>Baidal, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioengineering+of+an+Intraabdominal+Endocrine+Pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Bioengineering of an Intraabdominal Endocrine Pancreas.</a> New England Journal of Medicine. 376 (19), 1887-1889 (2017).</li>
<li>Espes, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+restoration+of+vascularity+and+oxygenation+in+mouse+and+human+islets+transplanted+to+omentum+may+contribute+to+their+superior+function+compared+to+intraportally+transplanted+islets%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Rapid restoration of vascularity and oxygenation in mouse and human islets transplanted to omentum may contribute to their superior function compared to intraportally transplanted islets.</a> American Journal of Transplantation. , (2016).</li>
<li>Berman, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioengineering+the+endocrine+pancreas%3A+intraomental+islet+transplantation+within+a+biologic+resorbable+scaffold%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Bioengineering the endocrine pancreas: intraomental islet transplantation within a biologic resorbable scaffold.</a> Diabetes. 65 (5), 1350-1361 (2016).</li>
<li>Delaune, V., Berney, T., Lacotte, S., Toso, C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28109023">Intraportal islet transplantation: the impact of the liver micro-environment.</a> Transplant International. 30 (3), 227-238 (2017).</li>
<li>Espes, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+restoration+of+vascularity+and+oxygenation+in+mouse+and+human+islets+transplanted+to+omentum+may+contribute+to+their+superior+function+compared+to+intraportally+transplanted+islets%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Rapid restoration of vascularity and oxygenation in mouse and human islets transplanted to omentum may contribute to their superior function compared to intraportally transplanted islets.</a> American Journal of Transplantation. 16 (11), 3246-3254 (2016).</li>
<li>Hajizadeh-Saffar, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+VEGF+expression+by+human+embryonic+stem+cell-derived+mesenchymal+stromal+cells+reduces+the+minimal+islet+mass+required+to+reverse+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Inducible VEGF expression by human embryonic stem cell-derived mesenchymal stromal cells reduces the minimal islet mass required to reverse diabetes.</a> Scientific Reports. 5, (2015).</li>
</ol>

Gli autori non segnalano conflitti di interesse.

Trapianto dell'isolotto al fegato tramite la vena portale è il più diffuso metodo di trapianto dell'isolotto in esseri umani, ma ci sono ancora problemi di efficienza e sicurezza come vena portale trombosi e fegato steatosi17. Studi recenti dimostrano che l'omento può essere un'alternativa adatta per il fegato, ma più ricerca deve essere condotta prima della traduzione clinica12,14,18,<sup clas...

Secondo l'International Diabetes Federation (IDF), diabete mellito colpisce attualmente 382 milioni di persone, con un aumento previsto di persone 592 milioni di 20351. In entrambi trapianto di insule pancreatiche allogeniche e xenogeniche, terapia immunosoppressiva sistemica è necessaria. Senza immunosoppressione, rigetto immunitario è delle principali cause di perdita di innesto2. C'è anche un significativo problema di perdita dell'isolotto trapiantato dovuto il sangue istantaneo mediata reazione infiammatoria (IBMIR)3,4. Tuttavia, anche in assenza di una risposta immunitaria come syngeneic o modelli di auto-trapianto, cellule delle isole trapiantate nel fegato tramite la vena portale sono persi a causa di infiammazione e/o a condizioni ambientali sfavorevoli, come sangue povero alimentazione con ridotta ossigenazione e/o sostanze nutritive5,6. Di conseguenza, al fine di garantire a lungo termine funzione metabolica, numeri più alti dell'isolotto sono necessari per compensare la perdita di cellule iniziali che riduce il engraftment7.
Nel tentativo di ottimizzare attecchimento dell'isolotto, diversi siti anatomici alternativi sono stati studiati sperimentalmente come pure clinicamente, con promettenti, ma non definitivo risultati8. Considerando che alcuni dei siti alternativi offrono un accesso facile e sicuro (ad es., pelle, capsula del rene, submucosa gastrico e camera anteriore dell'occhio) o una superficie più ampia per grandi masse dell'isolotto (ad es., cavità peritoneale), sopravvivenza e fisiologico prestazione metabolica delle isole trapiantate sono ancora limitate e rimangono una preoccupazione9. La ricerca di un sito più adatto per attecchimento dell'isolotto è in corso.
L'omento è stato tra i tanti siti anatomici che sono stati studiati nello sviluppo iniziale di trapianto dell'isolotto e si è rivelati un ambiente di successo per gli isolotti10,11,12,13, 14. Tuttavia, infusione intraportal isolotto è diventato il clinico dovuto scelta in parte per la relativa semplicità della procedura e primi successi nell'animale modelli6. Inoltre, in parte, gli aspetti negativi associati con questo sito, particolarmente massiccia perdita iniziale dell'isolotto, erano meno comprensibili e meno vincolante nei primi giorni di trapianto dell'isolotto sperimentale come il campo maturata. Con più recente prova coercitiva che indica che l'infusione intravascolare isolotto è ben lungi dall'ideale, omento sta riemergendo come un sito potenzialmente importante per trapianto di cellule.
L'omento (sotto forma di un sacchetto omentale) offre vantaggi relativi sopra il fegato15,16. È bene-vascularized e facilmente accessibile. Esso consente il recupero di innesto (se necessario) e/o biopsia. Il periodo ischemico sperimentato dagli isolotti è ridotto rispetto al fegato, e l'omento può accettare relativamente masse di grande isolotto che non è possibile intraportally, dove un aumento della pressione portale possono causare complicazioni.
Un modello syngeneic del topo del trapianto è stato usato nel protocollo testato nello studio, che impiegano i topi maschii C57BL/6 tra 6 – 8 settimane con un peso corporeo di 20 – 25 destinatari dell'isolotto di g. sono stati resi diabetici con una singola iniezione dello streptozotocin con una dose di 250 mg/kg ip. L'induzione del diabete può essere considerato riuscito se il livello di glucosio nel sangue del mouse è maggiore di 24 mmol/L 48 h dopo l'iniezione e rimane sopra quel livello per un minimo di 5 giorni.
Isolotti syngeneic sono stati isolati dal pancreas di pari età donatori seguendo metodi precedentemente pubblicati con alcune modifiche. In breve, la collagenasi è stato iniettato nella vescica di scorticatura invece il dotto biliare. Questo è stato fatto come un miglioramento per facilitare la facilità di iniezione. Collagenasi infusione è stata seguita da incubazione, la rottura del tessuto, separazione di gradienti di densità e raccolta a mano per ottenere puri isolotti. Gli isolotti sono stati coltivati durante la notte in CMRL-1066 supplementato con 10% inattivati siero bovino fetale (FBS) in matracci T175 a 37 ° C, meno 95% aria - 5% CO2 prima del trapianto.

<table><tbody><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr>5 <tr><td>pollici (12-13 cm) Forbici</td><td>RWD Life Science&nbsp;</td><td>S12030-11</td><td></td></tr><tr><td>Pinze fini</td><td>RWD Life Science</td><td>F11010-13</td><td></td></tr><tr><td>Piccole clip per ferite</td><td>RWD Life Science</td><td>R33003-01</td><td></td></tr><tr><td>Acutenaculum</td><td>RWD Life Science</td><td>F31044-13</td><td></td></tr><tr><td>2 paia di pinze per tessuti</td><td>RWD Life Science</td><td>&nbsp; F13023-10</td><td></td></tr><tr><td>4-0 Sutura con ago</td><td>Chenghe, Cina</td><td>17094</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu; L Pipetta e puntali</td><td>Gilson</td><td>PN11</td><td></td></tr><tr><td>One Touch ultraeasy Sistema di monitoraggio della glicemia di base&nbsp; &nbsp;</td><td>Johnson & Johnson</td><td>33391713</td><td></td></tr><tr><td>lama di rasoio</td><td>Philips</td><td>HC1099/15</td><td></td></tr><tr><td>Materiali e animali</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital Sodium Sigmaaldrich.com</td><td></td><td>P3761</td><td>Per anestesia&nbsp;</td></tr><tr><td>Idrogel&nbsp;</td><td>bdbiosciences.com</td><td>356234</td><td>Idrogel</td></tr> di <tr><td>fibrina-trombina</td> della matrice della membrana basale&nbsp;<td>Baxter.com</td><td>1501250</td><td>I componenti coagulano quando miscelati</td></tr><tr><td>al 70% di etanolo</td><td>Yingniu medical, Anhui, Cina</td><td>23170608</td><td></td></tr><tr><td>Iodophor</td><td>Lierkang medical technology, Shangdong, Cina</td><td>170521</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina normale</td><td>Baxter.com</td><td>2B1324</td><td></td></tr><tr><td>Cefalosporina</td><td>Lukang medical, Shangdong, Cina</td><td>150303</td><td></td></tr><tr><td>Cefazolina</td><td>Baxter.com</td><td>2G3508</td><td></td></tr><tr><td>unguento lubrificante per gli occhi</td><td>Major Pharmaceuticals</td><td>203964</td><td></td></tr><tr><td>streptozotocina</td><td>Sigmaaldrich.com</td><td>S0130</td><td></td></tr><tr><td>collagenasi di tipo V</td><td>Sigmaaldrich.com</td><td>C9262</td><td></td></tr><tr><td>CMRL-1066 media</td><td>celltrans, Wenzhou, Cina</td><td>X018D1</td><td></td></tr><tr><td>histopaque</td><td>Sigmaaldrich.com</td><td>10771</td><td></td></tr><tr><td>tubo PE50</td> a gradiente di densità <td>Braintreesci.com</td><td>PE50 100 FT</td><td>Polietilene .023" x .038</td></tr><tr><td>Calceina AM</td><td>Sigmaaldrich.com</td><td>C1359</td><td></td></tr><tr><td>Ioduro di propidio</td><td>Sigmaaldrich.com</td><td>P4864</td><td></td></tr><tr><td>composto per temperatura di taglio ottimale (OCT)</td><td>Tissue-Tek; Miles, Naperville, IL</td><td>4583</td><td>incorporamento</td></tr> di <tr><td>un anticorpo medio contro l'insulina</td><td>Tecnologia di segnalazione cellulare, Danvers, MA 01923</td><td>8138S</td><td></td></tr><tr><td>mezzi di colorazione dell'ematossilina</td><td>Tecnologia di segnalazione cellulare, Danvers, MA 01923</td><td>14166S</td><td></td></tr><tr><td>mezzi di colorazione dell'eosina</td><td>Beyotime Biotech, Cina</td><td>C0109</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>C57Bl/6 Topi</td> Medical <td>Animal Center della provincia del Guangdong</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>Feto Siero bovino</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30084</td><td></td></tr><tr><td>T175 fiasche</td><td>Falcon</td><td>353112</td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL Provette snap-top</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr></tbody></table>

un metodo per il trapianto dell'isolotto al omento in mouse

A Method for Islet Transplantation to the Omentum in Mouse

Trapianto dell'isolotto è stato proposto per essere un potenziale trattamento per il diabete di tipo 1. Convincente la prova recente indica che l'infusione intravascolare isolotto è tutt'altro che ideale e di conseguenza, l'omento sta riemergendo come un sito potenzialmente importante per trapianto dell'isolotto. Questo esperimento richiede l'isolamento degli isolotti di alta qualità e l'impianto degli isolotti ai destinatari diabetici. Trapianto al omento richiede passaggi chirurgiche che possono essere meglio dimostrati visivamente. Qui, vengono presentati i passaggi dettagliati per questa procedura. Qui sono descritti due metodi di miscelazione isolotti isolati con idrogel prima di mettere la miscela nel sacchetto omentale di topi diabetici. Idrogeli differenti sono utilizzati per le diverse condizioni. Livelli di glucosio nel sangue dei destinatari di topo diabetico di isolotti syngeneic nell'omento sono stati controllati per fino a 35 giorni. Alcuni animali sono stati sacrificati dopo 14 giorni per eseguire analisi immuno-istochimica. Questo approccio pre-clinica di trapianto può essere utilizzato come dati preliminari che portarono alla traduzione a trapianto clinico.

Stato post-digestivo del pancreas è illustrato nella Figura 1A. Purificata isolotti sono mostrati in Figura 1B. Ditizone macchiatura e test di vitalità degli isolotti sono mostrati nella Figura 2. Le fasi principali del trapianto dell'isolotto di omento sono mostrate nella Figura 3. Il glucosio nel sangue dei destinatari dopo trapianto omentale sono mostrati in <strong c...

È stato introdotto un metodo per il trapianto omentale di isolotti in un mouse. Gli isolotti isolati sono mescolati con idrogel e la miscela viene inserita nel sacchetto omentale di un topo diabetico. Quindi, il glucosio nel sangue è controllato e viene eseguita l'analisi immuno-istochimica.

Un metodo per il trapianto dell'isolotto al omento in Mouse

Islet transplantation has been proposed to be a potential treatment for type 1 diabetes. Recent compelling evidence indicates that intravascular islet ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo del trapianto di isolotto come il trapianto di isolotto all'omento. Le implicazioni di questa tecnica si estendono verso la terapia del diabete di tipo I perché l'omento è ro emergente come potenziale sito di valore per il trapianto di isolotto. Il principale vantaggio di questa tecnica è che gli isolotti isolati vengono mescolati con idrogel e la miscela viene posta nella busta di omentum del topo diabetico.Inizia preparando un campo asettico nell'area chirurgica con materiale sterile come tende e monouso. Posizionare gli strumenti chirurgici sterilizzati nel campo asettico. Selezionare gli isolotti donatori al microscopio stereo utilizzando una punta di pipetta da 200 microlitri.Per ogni animale, raccogliere da 450 a 500 isolotti e trasferirli in un tubo superiore sterile a scatto da 1,5 millilitri con 100 microlitri di CMRL 10 66 medio. Posizionare il tubo sul ghiaccio fino a quando non è pronto per il trapianto. Una volta raccolti gli isolotti, scongelare l'idrogel a matrice di membrana basale sul ghiaccio.Pesare e etichettare tutti i topi riceventi diabetici. Dopo aver anestetizzato il primo topo secondo un protocollo approvato istituzionalmente, testare la profondità dell'anestesia somministrando un dito del dito. Se non c'è un riflesso di astinenza, il livello di anestesia è corretto per l'intervento chirurgico.Somministrare un unguento veterinario agli occhi per prevenire la secchezza durante l'anestesia. Tamponare l'addome con il 70% di etanolo. Quindi radere i capelli dal sito dell'intervento.Coprire l'animale con un drappo sterile e disinfettare l'area con uno scrub allo iodio. Dopo aver usato le forbici oftalmiche per creare un'incisione da 4 a 5 centimetri lungo la linea mediana dell'addome, spostare l'intestino sul lato sinistro e coprire con garza imbevuta salina per prevenire la disidratazione durante la procedura chirurgica. Quindi utilizzare tamponi di cotone per esporre completamente lo stomaco e localizzare l'omento sotto lo stomaco.A questo punto, l'idrogel dovrebbe essere completamente scongelato. Ruotare il tubo contenente gli isolotti a 200 volte g per 30 secondi. Dopo lo spin, rimuovere il supernatante.Quindi aspirare 50 microlitri dell'idrogel aggiungerlo al tubo contenente gli isolotti e mescolare delicatamente evitando la formazione di bolle. Quindi utilizzare due paia di forcep per raccogliere i bordi dell'omento e sollevarlo delicatamente per formare una scanalatura tra la parete gastrica e l'intestino. A questo punto dell'intervento chirurgico, è necessaria una seconda persona per aspirare la miscela di idrogel di isolotto rimorsio con una punta di pipetta da 200 microliter e consegnarla nella scanalatura.Assicurarsi che la miscela sia ben posizionata nella scanalatura sollevando o abbassando delicatamente i bordi dell'omento. Completare il posizionamento della miscela entro tre minuti prima che l'idrogel si solidifichi. Dopo i set di idrogel, piegare l'omento per coprire l'innesto.L'omento aderirrà alla parete gastrica circostante man mano che l'idrogel si solidifica. Quando l'idrogel è completamente solidificato, utilizzare tamponi di cotone per riposizionare l'intestino nella cavità addominale facendo attenzione a non toccare il sito di trapianto. Successivamente erogare 200 microlitri di un antibiotico appropriato nella cavità addominale per prevenire l'infezione.Quindi usa la sutura 4 O per chiudere l'addome. Generalmente gli individui nuovi a questo metodo avranno difficoltà perché i siti dell'omento nei topi sono piccoli e faticosi da valutare. Posizionare il mouse in una gabbia di recupero riscaldata fino a quando non riacquista completamente la reclinanza esterna.Il giorno successivo e ogni giorno dopo per una settimana, iniettare antibiotico come profilassi post-operatoria. Inoltre, misurare il livello di glucosio nel sangue non a digiuno da un campione di sangue della vena della coda usando un misuratore di glucosio nel sangue una volta al giorno dopo il trapianto. Durante il trapianto nell'omento, l'innesto di isolotto può avere una funzione ritardata e non raggiungere un livello di glucosio nel sangue completamente normale per due o tre settimane.Il tessuto innestato è stato recuperato dal topo eutanasiato 14 giorni dopo il trapianto. Qui l'innesto è visibile come un gruppo di nuclei dopo la colorazione DAPI. La funzionalità del tessuto innestato è rivelata dalla colorazione immunofluorescenza con anticorpi anti-insulina.La colorazione H&E mostra i tessuti innestati circondati dagli adipociti dell'omento. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in un'ora se viene eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare anche che l'omento del mouse è fragile.Seguendo questa procedura, altri metodi come utilizzati in diversi licei, prestazioni MB in tutto ciò che risponderà a domande particolari come la diffusione dell'isolotto nella vascuolizzazione e le prestazioni. Dopo questo sviluppo, questa tecnica ha spianato la strada ai ricercatori nel loro e trapianto per esplorare il trattamento per il diabete di tipo I in più di un estratto. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come trapiantare gli isolotti nell'omento nel topo.

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Il nostro protocollo è stato sviluppato per fornire in modo pulito e facilmente le cellule o isolotti sotto la capsula renale di topi. Le cellule sono concentrate in pellet nel tubo finale utilizzato per il trapianto delle cellule sotto la capsula renale. La facilità di questa tecnica riduce lo stress per le cellule e il mouse.

Il trapianto di isole pancreatiche nella capsula renale di topi diabetici

Trapianto di isole isolate è stato proposto di essere un potenziale trattamento per il diabete di tipo 1. Qui si descrive un metodo per isolare le isole dal pancreas del mouse e trapiantarle allo spazio sottocapsulare del rene.

Un metodo per isolamento Islet murini e trapianto renale subcapsulare

Questo video descrive il protocollo per l'innesto di isole pancreatiche umane nella camera anteriore dell'occhio del topo per monitorare la rivascolarizzazione degli innesti di isole umane in vivo. Aiuta anche a comprendere il contributo delle cellule riceventi rispetto a quelle del donatore nel promuovere l'incapsulamento e la vascolarizzazione del trapianto.

Innesto di isole pancreatiche: un metodo per impiantare le isole pancreatiche nella camera anteriore dell'occhio del topo per l'imaging in vivo

In questo video, descriviamo una procedura per infondere cellule delle isole pancreatiche nella vena porta epatica, seguita dall'applicazione di schiuma di gel per prevenire con successo il sanguinamento. Il sanguinamento postoperatorio è una causa comune di elevata mortalità durante il trapianto di isole.

Modello murino di trapianto di isole: un metodo chirurgico per infondere le isole pancreatiche nella vena porta e prevenzione del sanguinamento postoperatorio

Questo protocollo dimostra l'isolamento delle isole murine e la semina su un impalcatura decellulare. Isole supportate da ponteggi sono state trapiantate nel pad di grasso epididimo di topi diabetici indotti da streptozotocina (STZ). Isole sopravvissute al sito di trapianto e invertite la condizione iperglicemica.

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Trapianto di isole pancreatiche è un modo per raggiungere normoglycemia in diabete di tipo 1. Questo articolo si concentra sulla tecnica di trapianto attraverso il percorso intraportal per mantenere i livelli normali del glucosio nei topi diabetici.

Intraportal trapianto di isole pancreatiche nel modello del topo

Qui, presentiamo un protocollo per la convalida in vivo della terapia cellulare basata su idrogel, illustrata dall'esempio del trapianto di insule pancreatiche. h-omentale isolotto di Matrix (hOMING) l'impianto di riempimento permette l'impianto di una miscela di cella-idrogel tra gli strati omentale, vicino ai vasi sanguigni, per massimizzare l'attecchimento in un ambiente metabolico adeguato.

Utilizzo di trapianto dell'isolotto intra-omentale di riempimento Matrix isolotto h-omentale (hOMING)

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Modello di trapianto di Murine (ISWAT) del tessuto adiposo sottocutaneo inguinale (ISWAT)

Questo metodo di trapianto di isole ricoperte di grasso è adatto per il rilevamento di isole innestate nella cavità intraperitoneale. In particolare, non richiede l'uso di agenti bioleganti o sutura.

Trapianto di isole ricoperte di grasso utilizzando tessuto adiposo bianco epididimo

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Ridurre al minimo il sanguinamento della vena porta post-infusione durante il trapianto di isole intraepatiche nei topi

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Trapianto ortotopico di fegato di successo nei topi che utilizzano l'angiografia con tomografia microcomputerizzata

Impara il trapianto di isole pancreatiche nell'omentum di topi diabetici utilizzando idrogel per migliorare la sopravvivenza cellulare. Questo metodo avanza le terapie per il diabete di tipo I.

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