Name: Protocolli di fabbricazione (EcoFAB) di ecosistema per la costruzione degli ecosistemi di laboratorio progettato per studiare le interazioni piante-microrganismi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-10T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 57 s
Description: Scopri i protocolli di costruzione degli EcoFAB per studiare le interazioni piante-microrganismi in laboratorio. Questo metodo utilizza la stampa 3D per creare ecosistemi controllati e riproducibili.

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Questo lavoro è stato supportato dal programma laboratorio diretto di ricerca e sviluppo (LDRD) del Lawrence Berkeley National Laboratory supportati da Office of Science, del US Department of Energy sotto contratto n. DE-AC02-05CH11231 e un premio DE-SC0014079 da dipartimento US di energia Office of Science all'Università di Berkeley. Lavoro presso la fonderia molecolare è stato sostenuto sotto U.S. Dipartimento di energia contratto numero DE-AC02-05CH11231. Ringraziamo anche Suzanne M. Kosina, Katherine Louie, Benjamin P. Bowen e Benjamin J. Cole al Lawrence Berkeley National Laboratory per il loro aiuto.

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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

I protocolli segnalato qui per l'utilizzo di fabbricazione ecosistema per creare che ecofabs fornisce risorse comunitarie per impianto sistematico studi di biologia in condizioni di laboratorio altamente controllate. I progressi nella stampa 3D offrono tecnologie ampiamente accessibili per costruire e perfezionare in modo iterativo EcoFAB disegni. La camera di root presentata qui è trovata per essere adatto per imaging microscopia e mantenere la sterilità, consentendo l'aggiunta controllata di microbi per indagare le interazioni piante-microrganismi. La piattaforma EcoFAB è compatibile con varie specie di piante. È importante riconoscere gli effetti fisiologici della crescita delle piante all'interno della camera di radice stretta tale che ulteriori esperimenti saranno necessario generalizzare i risultati a piante che crescono in ambienti naturali.
L'utilizzo di camere sterili e LED coltiva la luce consente l'indagine degli effetti delle diverse condizioni di luce, tra cui lunghezza d'onda, intensità e durata, sulla crescita delle piante e dei relativi parametri fisiologici in parallelo. Legame reversibile radice camere permettono l'utilizzo di substrati solidi anche per quanto riguarda spazialmente raccogliere campioni solidi per analisi biochimica e genetica. Le applicazioni di substrati solidi, quali terreni, sabbia e perle di quarzo, offrono la possibilità di usare EcoFABs per costruire gli ecosistemi di laboratorio più ecologicamente rilevanti. Tuttavia, tutti i sistemi presentati qui uso liquido saturo (colture idroponiche) che non sono una riflessione accurata della maggior parte dei suoli e sarà importante ulteriormente perfezionare questi disegni per mantenere le sacche d'aria all'interno del suolo tale che meglio rappresentano suoli naturali.
L'uso di macchine fotografiche semplici e di microscopi è descritto allo sviluppo di morfologia di radice sistema immagine a entrambi rinfusa ai livelli cellulari. Questa idoneità per monitoraggio radice morfologia imaging e quantificazione sarà probabilmente utile per comprendere i meccanismi di regolazione dei segnali fisiologici e molecolari di pianta innescati da adattamenti genotipica di pianta a condizioni di crescita. Tuttavia, una limitazione per studiare lo sviluppo fisiologico della radice è l'attuale posizionamento orizzontale del dispositivo EcoFAB. Negli ambienti naturali, la risposta di radici gravitropic conduce ad uno sviluppo prevalentemente verticale del sistema della radice. Così, il sistema orizzontale presentato qui probabilmente differisce in alcuni fattori da un ambiente naturale, e la realizzazione di sistemi di EcoFAB con posizionamento verticale della camera principale è un obiettivo desiderabile per le future versioni di EcoFAB. Sebbene i dispositivi EcoFAB correnti vengono posizionati orizzontalmente, l'analisi dei parametri di morfologia radice in varie condizioni, o in risposta ai microbi, è possibile. Formazione immagine ad alta risoluzione può essere applicata per l'acquisizione dinamica di colonizzazione radice singoli isolati o comunità, fornendo informazioni su quale pianta parti sono colonizzati in varie condizioni sufficienti e carente dei nutrienti. Si prevede che tali studi forniranno importanti nuove intuizioni come pianta microbiomi vengono assemblati, e come queste dinamiche cambiano nel tempo, per esempio come le radici si sviluppano.
Attivare dispositivi microfluidici imaging di piante molto giovani, e di solito la quantità di metaboliti raccolti non è sufficiente per l'analisi LCMS. Sistemi basati su terreno, ad esempio rhizotrons, consentono l'imaging della morfologia della radice quando entrambi le piante si trasformano con costrutto chemiluminescente (Glo-radice) o con metodi basati su NMR33,34. Estrazioni di metabolita da questi sistemi sono molto tempo a causa del grande volume di campioni. EcoFABs sono una combinazione di entrambi: la fabbricazione è simile a dispositivi microfluidici. EcoFABs sono stati progettati per essere semplice e poco costoso da riprodurre, ma la dimensione della camera può essere regolata per crescere le piante con piccoli o grandi sistemi di radice, fino a loro fasi riproduttive. Osservazioni simultanee di cambiamenti di morfologia di radice ed essudazione di radice sono possibili. Il sistema è sterile, consentendo l'aggiunta controllata di microbi specifici.
EcoFABs sono progettati per consentire l'introduzione controllata e campionamento dei microbi e dei metaboliti. In particolare, campioni raccolti da camere di crescita di radice si trovano ad per essere sufficiente per il profiling del metabolita massa spettroscopica. L'integrazione di imaging con spettrometria di massa (ad es., NIMS tecnica presentata qui) fornisce un approccio non-distruttivo di studiare distribuzioni spaziali di metabolita degli apparati radicali. Questa tecnica sarà probabilmente esperimenti di analisi isotopica utile in futuro e mappatura microbica localizzazione di specifici metaboliti36. Mentre questo protocollo si è concentrata su singoli isolati, lo stesso design certamente può essere utilizzato per comunità più complesse. I volumi di campione e la biomassa all'interno del EcoFABs sono probabilmente più che sufficiente per un'ulteriore integrazione con tecnologie di sequenziamento del DNA, che sarà importante per caratterizzare e monitoraggio comunità microbica struttura ed espressione genica.
In conclusione, questo protocollo dettaglia la fabbricazione degli ecosistemi di laboratorio progettato per l'indagine sulle interazioni piante-microrganismi, con enfasi sui metodi semplici e accessibili che può essere facilmente implementato ed estesa dai ricercatori di tutto il mondo. Attuali sforzi sono volti a dimostrare la riproducibilità tra laboratori e l'integrazione di un sistema di controllo di temperatura tale che ogni EcoFAB sarà hanno controllato in modo indipendente luce e temperatura. Un ulteriore avanzamento del sistema sarà l'integrazione di campionamento automatico e riempimento delle camere EcoFAB radice e lo sviluppo di protocolli riproducibile per stabilire il relativo impianto microbiomi all'interno EcoFABs.

L'applicazione di microbi benefici pianta in agricoltura offre un grande potenziale per aumentare la produzione di biocarburanti per fornire per una crescente popolazione1,2,3,4e alimentare sostenibile. Una quantità significativa di lavoro sostiene l'importanza della pianta microbiomi nell'assorbimento dei nutrienti della pianta, tolleranza agli stress e resistenza alla malattia5,6,7,8. Tuttavia, è difficile indagare questi meccanismi delle interazioni piante-microrganismi negli ecosistemi di campo dovute alla complessità e irriproducibilità associato e incapacità di controllare con precisione la composizione microbiome e genetica (ad es., usando microbica mutanti)4,9,10.
Una strategia consiste nel costruire gli ecosistemi di modello semplificato per consentire controllato, esperimenti di laboratorio replicate indagare interazioni piante-microrganismi per generare intuizioni che possono essere ulteriormente testati nel campo10,11, 12. Questo concetto si basa su approcci tradizionali utilizzando piante coltivate in vasi riempiti di terreno o su lastre di agar all'interno di serre o incubatori13. Anche se queste probabilmente rimarrà il più ampiamente utilizzati approcci, essi mancano della capacità di precisamente monitorare e gestire ambienti di crescita della pianta. A tal fine, rizobox e rhizotrons rappresentano un importante miglioramento nella capacità di studiare i processi sotto-terra14,15, e protocolli prime sono stati pubblicati per l'analisi dei metaboliti della rizosfera nel suolo16. Più recentemente, per consentire analisi di rendimento elevato, microfluidici avanzati dispositivi13,17 come pianta Chip18,19, RootArray20e RootChip21, sono stati sviluppato come strumenti efficaci per fenotipizzazione di pianta con risoluzione spaziale di scala micrometrica per monitorare le prime fasi di crescita della pianta piccolo modello Arabidopsis thaliana in medium liquido di flusso. Recentemente, una piattaforma di formazione immagine di due-strato è stata descritta che permette l'imaging dei capelli di radice di Arabidopsis thaliana nella fase del semenzale con una piattaforma di microfluidica22.
Qui, protocolli dettagliati per la costruzione di dispositivi controllati del laboratorio (EcoFABs) sono forniti, per lo studio delle interazioni pianta microbo e spettacolo che può essere utilizzati per studiare varie piante tra cui Arabidopsis thaliana, Brachypodium distachyon23, l'avena Avena barbata, ecologicamente importante e il raccolto di bioenergia Panicum virgatum (switchgrass). EcoFAB è una piattaforma di crescita di pianta sterile che include due componenti principali: il dispositivo EcoFAB e contenitore trasparente dimensioni impianto sterile. EcoFAB dispositivo è costituito da un polidimetilsilossano (PDMS) produzione processo che coinvolge colata PDMS strati da uno stampo di plastica stampato 3D e incollaggio di strati PDMS sui vetrini microscopio utilizzando metodi precedentemente segnalato24,25 . Le procedure dettagliate di EcoFAB del flusso di lavoro, come la fabbricazione di dispositivi, sterilizzazione, germinazione del seme, trapianto di piantine, microbo inoculazione/cocultivation, preparazione del campione e l'analisi, sono descritte in questo protocollo (Figura 1). Ulteriori modifiche del flusso di lavoro base sono descritte, compreso l'installazione del computer controllato luci a LED grow e l'utilizzo di substrati solidi. L'utilizzo di tecniche per studiare la morfologia della radice di imaging cambia, colonizzazione microbica delle radici, e imaging massa spettroscopico di essudati radicali sono descritti. Possiamo anticipare che il design semplice, poco costoso, basato su materiali facilmente reperibili, nonché i protocolli dettagliati qui presentati, si trasformerà la piattaforma EcoFAB in una risorsa di comunità, standardizzando le ricerche di laboratorio pianta-microbiome.

<table><tbody><tr>File <td>LBNL</td><td></td> STL <td>stampati in 3D su stampo personalizzato</td><td>disponibili qui www.eco-fab.org; Gli stampi EcoFABs qui descritti sono stati stampati da FATHOM: http://studiofathom.com</td></tr><tr><td>Dow sylgard 184 kit trasparente in elastomero siliconico</td><td>Ellsworth Adhesives</td><td>184 SIL ELAST KIT 0,5 kg</td><td></td></tr><tr><td>Spray per spolverino d'aria</td><td>VWR</td><td>75780-350</td><td>qualsiasi spolverino a gas compresso dovrebbe funzionare</td></tr><tr><td>ago smussato calibro 15</td><td>VWR</td><td>89166-240</td><td></td></tr><tr><td>siringa da 5 ml con punta Luer-Lok</td><td>VWR</td><td>BD309646</td><td></td></tr><tr><td>3 pollici x2" vetrino per microscopio</td><td>VWR</td><td>48382-179</td><td></td></tr><tr><td>1.75" x 2.56" x 3.56" EcoFAB scatola</td><td>Amazon</td><td>B005GAQ25Q</td><td></td></tr><tr><td>4" x 3 &frac14; &rdquo; vetrino per microscopio</td><td>Ted Pella</td><td>260231</td><td></td></tr><tr><td>4,87" x 4,87" x 5,50" Scatola EcoFAB</td><td>Pulitore al plasma Amazon</td><td>B00P9QVOS2</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-001</td><td></td></tr><tr><td>Morsetto personalizzato stampato in 3D</td> File <td>LBNL</td><td></td><td>STL disponibili presso il laboratorio di Trent Northen</td></tr><tr><td>Cappa sterile</td><td>AirClean Systems</td><td>Workstation PCR serie AC600</td><td></td></tr><tr><td>Tubo per siringa in PTFE</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z117315-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>VWR</td><td>89125-172</td><td></td></tr><tr><td>Candeggina</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Murashige e Skoog (MS) Macronutriente a base di sale</td><td>Phytotechnologies Laboratories</td><td>M502</td><td></td></tr><tr><td>Murashige e Skoog (MS) Micronutriente a base di sale</td><td>Phytotechnologies Laboratories</td><td>M554</td><td></td></tr><tr><td>Soil</td><td>Hummert International</td><td>Pro-Mix PGX</td><td></td></tr><tr><td>Phytagel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71010-52-1</td><td></td></tr><tr><td>Arabidopsis thaliana</td><td>Lehle Seeds</td><td>WT-24 Col-4 Columbia wild type</td><td></td></tr><tr><td>Brachypodium distachyon</td><td>LBNL</td><td>Standard Bd-21 line</td><td>Disponibile presso il laboratorio di John Vogel</td></tr><tr><td>Panicum virgatum</td><td>The Samuel Roberts Noble Foundation</td><td>Alamo switchgrass</td><td></td></tr><tr><td>Nastro microporoso</td><td>VWR</td><td>56222-182</td><td></td></tr><tr><td>Metanolo di grado LC-MS</td><td>VWR</td><td>JT9830-3</td><td></td></tr><tr><td>Liofilizzatore</td><td>LABCONCO</td><td>FreeZone 2.5 Plus</td><td></td></tr><tr><td>Concentratore SpeedVAC</td><td>Thermo Scientific</td><td>Savant&trade; SPD111 SpeedVac</td><td></td></tr><tr><td>Ultrafree-MC GV Filtro Centrifugo-0,22 & micro; m</td><td>Millipore</td><td>UFC30GV00</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di cromatografia liquida</td><td>Agilent Agilent</td><td>1290 LC system</td><td></td></tr><tr><td>Q Spettrometro di massa exattivo</td><td>Thermo Scientific</td><td>Q Exactive&trade; Chip ibrido Quadrupole-Orbitrap MS</td><td></td></tr><tr><td>NIMS e piastra MALDI personalizzata</td><td>LBNL Per il</td><td></td><td>protocollo dettagliato vedere: doi:10.1038/nprot.2008.110</td></tr><tr><td>Spettrometro di massa MALDI</td><td>AB Sciex</td><td>TOF/TOF 5800 MALDI MS</td><td></td></tr><tr><td>Striscia luminosa di coltivazione a LED con rivestimento nano-rivestito</td><td>LED World Lighting</td><td>HH-SRB60F010-2835</td><td></td></tr><tr><td>Alimentatore</td><td>LED World Lighting</td><td>MD45W24VA, LV100-24N-UNV-J</td><td></td></tr><tr><td>Controller TC420</td><td>Amazon</td><td>B0197U7R8Q</td><td></td></tr><tr><td>Clip LED in silicone</td><td>Amazon</td><td>B00N9X1GI0</td><td></td></tr><tr><td>Pistola per colla a caldo</td><td>Amazon</td><td>B006IY359K</td><td></td></tr><tr><td>Cavo connettore LED femmina-nudo</td><td>LED World Lighting LED</td><td>HH-F05</td><td></td></tr><tr><td>Cavo di prolunga del connettore LED femmina-maschio</td> LED <td>World Lighting</td><td>HH-MF1</td><td></td></tr><tr><td>Cavo a 2 fili 20AWG</td><td>LED World Lighting</td><td>6102051TFT4</td><td></td></tr><tr><td>WAGO 221-415 Connettore di giunzione</td><td>LED World Lighting</td><td>221-415</td><td></td></tr></tbody></table>

protocolli di fabbricazione (ecofab) di ecosistema per la costruzione degli ecosistemi di laboratorio progettato per studiare le interazioni piante-microrganismi

Ecosystem Fabrication (EcoFAB) Protocols for The Construction of Laboratory Ecosystems Designed to Study Plant-microbe Interactions

Interazioni piante-microrganismi benefici offrono una soluzione biologica sostenibile con il potenziale per incrementare la produzione alimentare e bioenergia basso input. Una migliore comprensione meccanicistica di queste interazioni piante-microrganismi complessi sarà cruciale per migliorare la produzione vegetale come ben più performante basic ecologico studi investigativi interazioni pianta-suolo-microbo. Qui, viene visualizzata una descrizione dettagliata per la fabbricazione di ecosistema, utilizzando ampiamente disponibili tecnologie di stampa 3D, per creare habitat controllati del laboratorio (EcoFABs) per studi meccanicistici di interazioni piante-microrganismi all'interno di specifiche ambientali condizioni. Due dimensioni di EcoFABs sono descritti che sono adatti per l'indagine sulle interazioni microbiche con varie specie di piante, tra cui Arabidopsis thaliana, Brachypodium distachyone Panicum virgatum. Questi dispositivi di scorrimento consentono controllata manipolazione e campionamento di radice microbiomi, chimica di radice nonché di imaging della morfologia della radice e della localizzazione microbica. Questo protocollo include i dettagli per mantenere condizioni di sterilità all'interno EcoFABs e montaggio di sistemi di illuminazione LED indipendente sul EcoFABs. Metodi dettagliati per l'aggiunta di diverse forme di media, compresi i suoli, sabbia e mezzi liquidi di sviluppo accoppiato alla caratterizzazione di questi sistemi usando la formazione immagine e metabolomica è descritti. Insieme, questi sistemi consentono indagini dinamico e dettagliato della pianta e pianta-microbica consorzi tra cui la manipolazione del microbioma composizione (tra cui mutanti), il monitoraggio della crescita delle piante, morfologia della radice, composizione di essudato, e localizzazione microbica in condizioni ambientali controllate. Ci aspettiamo che questi protocolli dettagliati servirà come punto di partenza importante per altri ricercatori, idealmente contribuendo a creare sistemi standardizzati sperimentale per lo studio di interazioni piante-microrganismi.

Ogni sistema EcoFAB include un dispositivo di EcoFAB e una pianta di dimensioni contenitore di plastica trasparente. Un dispositivo di EcoFAB ha un serbatoio di impianto, una camera di crescita di radice, un'insenatura di flusso di 1,6 mm e una presa di 1.6 mm per dispositivo EcoFAB standard (Figura 2D &amp; H di figura 3) o una presa di 10 mm per wide-Saldi EcoFAB dispositivo (Figura 2F &amp; Figura 3I ). La pianta è stata progettata a forma trapezoidale che ha un'apertura superiore di 6 mm e l'apertura inferiore di 3 mm, e questa struttura riduce la probabilità di perdita di flusso durante l'iniezione di liquido e garantisce anche abbastanza spazio per la crescita delle piante. La camera di crescita di radice adotta una forma ovale con 2 mm di profondità per adattarsi apparato radicale delle piante modello molti, come mostrato in Figura 2 ed E. Canali di ingresso e di uscita di un dispositivo di EcoFAB standard possono essere collegati con tubi in PTFE così soluzioni nutritive possono fluire nella camera di crescita di radice senza aprire il contenitore EcoFAB. Il dispositivo EcoFAB wide-Saldi notevolmente riduce la resistenza al flusso della presa e preferibilmente viene utilizzato quando la coltivazione di piante con sistemi della radice spessi o essudati radicali periodicamente raccolta dopo complessi sistemi della radice sono derivati dalle piante.
Gli stampi di colata per la realizzazione di strati PDMS dei dispositivi EcoFAB vengono creati in un software di progettazione e quindi 3D stampato in rigida fotopolimeri opaco, come mostrato nella Figura 2 e Figura 3. Piante all'interno di EcoFABs possono essere direttamente osservate con un microscopio utilizzando una distanza di lavoro lungo, assicurando che la sterile crescere ambiente (Figura 8A, File supplementari 1). EcoFAB dispositivi con piante possono anche montare su un palcoscenico di microscopio ad alta risoluzione, che permette l'imaging a risoluzione più alta delle interazioni piante-microrganismi (Figura 8B, File supplementari 2). Sterilità non è mantenuto in questo ambiente, e imaging ad alta risoluzione solo è quindi adatto per misure di endpoint.
EcoFABs sono progettati per consentire studi sistematici di piante, come la loro morfologia, metabolismi e comunità microbiche nelle loro fasi di crescita differenti tra loro cicli di vita. Qui, EcoFABs sono stati esaminati come una piattaforma generale per studiare una varietà di specie vegetali. Figura 8 -E Visualizza 7 - giorno-vecchio di Arabidopsis thaliana, Brachypodium distachyone Panicum virgatum crescendo in EcoFABs. Tutti i tre impianti sono stati trovati per crescere bene nella EcoFAB per oltre un mese. Sia le dicotiledoni, Arabidopsis thaliana e le monocotiledoni, Brachypodium distachyon sono stati trovati a vivere fino al loro fasi di riproduzione nella EcoFABs.
Il reversibile sistema di tenuta consente l'utilizzo di substrati solidi (ad es., suolo) all'interno di EcoFABs (punto 2.2). Questo approccio di sigillamento di reversibile consente il caricamento di substrati solidi in camere di crescita di radice e consente inoltre la raccolta di campioni da regioni specifiche e di metodologie di radice. Figura 8F -H Visualizza un gruppo di 14 - giorno-vecchio Brachypodium distachyon crescendo in mezzo idroponico, come sabbia e terreno completati con mezzo idroponico (sabbia) e acqua (terreno). Lo strato sottile substrato solido in camere di crescita di radice permette alla luce di penetrare per formazione immagine microscopica degli apparati radicali.
Morfologia della radice è definito come configurazione spaziale e la distribuzione di un sistema di radice di pianta ed è stato approvato come risposta fisiologia essenziali per gli ambienti di crescita diversificata, come sostanza nutriente o acqua disponibilità32,33, 34. EcoFABs fornire un approccio conveniente di studiare la morfologia della pianta nel tempo o in condizioni diverse sostanze nutritive. Figura 9A-F Visualizza un esempio di utilizzo di EcoFABs per tenere traccia di morfologie di radice di Brachypodium distachyon nelle prime tre settimane. Una piantina di Brachypodium distachyon fu trasferita nel dispositivo EcoFAB, e la struttura principale è stata registrata da una telecamera all'interno di un imager di gel BIO-RAD. Programma di elaborazione di immagine, come immagine J, python e matlab, possa essere applicato per quantificare le modifiche delle morfologie di radice nel tempo o a diversi ambienti medi. La quantificazione dell'area radice totale nel corso di tre settimane ha mostrato un aumento graduale nella fase iniziale (&lt; 1 settimana) seguita da un trend di crescita lineare fino alla fine di tre settimane, come illustrato nella Figura 9.
Una motivazione primaria per la costruzione del EcoFAB è quello di indagare le interazioni piante-microrganismi. Come descritto al punto 5.4, microrganismi vengono trasferiti in camere di crescita di radice di EcoFAB dispositivi attraverso il canale di ingresso. La figura 10 Mostra, un EcoFAB contenente Pseudomonas simea (precedentementefluorescens) WCS417 (WCS417), una crescita di pianta Promozione rhizobacteria con etichette a chemiluminescenza, è stato aggiunto in sistemi della radice di pianta con una concentrazione di 106 cellule per pianta. Il segnale di WCS417 è stato rilevato con un imager di gel, che ha indicato una distinta distribuzione spaziale dei microbi WCS417 in camere di crescita di radice. In entrambi MS mezzo liquido con e senza sabbia substrato solido, WCS417 microbi colonizzarono le superfici dei sistemi della radice intera con microbi concentrati intorno alle aree di punta di radice, possibilmente dovuto la produzione attiva di nutrienti di punte delle radici (Figura 10 &amp; H)35. D'altra parte, i microbi WCS417 nel substrato di terreno accumulato intorno alla regione di serbatoio pianta invece di punte delle radici (Figura 10ho). Come i microbi sono stati aggiunti tramite il canale di sbocco, i microbi sono stati anche in grado di muoversi nel substrato del terreno, ma non si accumulano sulla radice, come osservato in mezzo liquido con o senza sabbia. Questo potrebbe indicare che il terreno è una fonte di nutrienti sufficiente, e i microbi migrarono al serbatoio impianto per condizioni di respirazione ottimale.
Per studiare il profiling del metabolita di essudati radicali pianta così come metabolita assorbimento e rilascio dalle interazioni piante-microrganismi, le soluzioni di essudato dalle camere di crescita di radice è stato raccolto attraverso varie fasi di crescita delle piante in EcoFABs. Come descritto nel passaggio 6, campioni di essudato vengono poi estratti per analisi LC-MS. Usando questo metodo, una gamma di metaboliti trasudava dalla pianta e consumato dai microbi è stata rilevata, e il profiling del metabolita correlata di essudati radicali con e senza colonizzazione di microbi è attualmente sotto inchiesta.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57170/57170fig1.jpg"> Figura 1: flusso di lavoro The EcoFAB. Piante sono germinati sulla piastra e trasferiti a EcoFAB sterilizzati, i microbi possono essere aggiunti. Campionamento non distruttivo: essudati radicali possono essere campionati ed imaged e morfologia della radice possa essere visualizzato. Campionamento distruttivo permette l'analisi di microbo, radice e sparare parametri in dettaglio.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57170/57170fig2.jpg"> Figura 2: I componenti di 3D stampato stampi per la fabbricazione di dispositivi EcoFAB. (A) viste superiore e inclinate di un frame di colata. (B) viste superiore e inclinate di un'istruzione insert. (C) alto e inclinati visualizzazioni di una base di stampo standard. (E) viste superiore e inclinate di un wide-Saldi stampo base. (D, F) Assemblati stampi per fabbricare dispositivi EcoFAB standard e wide-presa di corrente, rispettivamente. Le dimensioni ovale sono 51 x 34 mm per la piccola EcoFAB muffa e 76 mm x 62 mm per grandi EcoFAB muffa. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57170/57170fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57170/57170fig3.jpg"> Figura 3: fabbricazione di dispositivi EcoFAB. (A) versare il composto di base e polimerizzazione agente di elastomero nello stampo. (B) riscaldamento dello stampo con la miscela a 85 ° C per 4 h. (C) rimozione dell'inserto dallo stampo. (D) che separa il PDMS dal telaio della colata. (E) spingendo lo stampo base fuori della cornice di colata. (F) utilizzando un coltello per separare il PDMS dallo stampo lungo i bordi. (G) peeling lo strato PDMS lentamente fuori la base dello stampo. (H) Poking fori per canali di ingresso e di uscita del livello standard PDMS. (I) che prendono in un buco per il canale di ingresso del livello PDMS wide-presa. Strato (J) il PDMS (costituito da un elastomero di 15:1 base di miscela di agente di polimerizzazione) e un vetrino da microscopio sono sciacquati e trasferiti in un plasma pulitore per l'incollaggio. (K) tramite morsetti per tenere il livello PDMS (in una base di 5:1 in elastomero per polimerizzazione miscela agente) su un vetrino da microscopio. (L) premendo lo strato PDMS (in una base di elastomero di 30: 1 a miscela agente di polimerizzazione) direttamente su un vetrino da microscopio. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57170/57170fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57170/57170fig4.jpg"> Figura 4: il design dei morsetti personalizzati. (A) viste superiore e inclinate di un top piastra di serraggio. (B) piastra di serraggio viste superiore e inclinate di un fondo. (C) superiore e vista inclinata del morsetto assemblato con quattro serie di viti a testa esagonale. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57170/57170fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57170/57170fig5.jpg"> Figura 5: installazione LED coltiva le luci. (A) marcatura fuori le posizioni per 9 clip LED in una spirale attorno al contenitore EcoFAB. (B) il LED clip collegato al contenitore EcoFAB. (C) una striscia di LED attraverso queste clip di threading. (D) la striscia di LED di collegamento a un controller cablato con un'alimentazione elettrica 24V. (E) lo schema dei collegamenti dei cavi al controller. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57170/57170fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57170/57170fig6.jpg"> Figura 6: trasferimento di piantine in EcoFABs. (A) Brachypodium distachyon piante coltivate per 2 giorni su una zolla di 0,5 MS. (B) la principale camera di riempimento con mezzo di crescita della pianta. (C) utilizzando una pinzetta per inserire con cautela la radice nel serbatoio dell'impianto. (D) sigillare il contenitore EcoFAB con nastro microforato, dopo l'aggiunta di 3 mL di acqua alla parte inferiore del contenitore. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57170/57170fig6large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57170/57170fig7.jpg"> Figura 7: NIMS imaging della pianta radici in EcoFABs. (A) un Brachypodium distachyon crescendo in una sterile EcoFAB. (B) Posizionare lo strato PDMS con la pianta su un chip di NIMS per 20 min (C) usando rame nastro collegare il chip NIMS su un piatto MALDI personalizzato e caricarlo in uno spettrometro di massa MALDI. (D-G) uno 7 - giorno-vecchio e un 20 - giorno-vecchio Brachypodium distachyon pianta usata per NIMS imaging (D, E) e le corrispondenti immagini di NIMS (F, G). Gli ioni predominanti sono stati evidenziati in rosso, verde e blu. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57170/57170fig7large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57170/57170fig8.jpg"> Figura 8: le applicazioni generali di EcoFABs. (A) direttamente catturare la crescita delle radici di Brachypodium distachyon in un EcoFAB con un setup di microscopio di distanza lungo lavoro. (B) direttamente osservando le interazioni di radice-microbo con un setup di microscopio ad alta definizione. Panicum virgatum (E) in mezzo idroponico di 0,5 MS, (F-H) 14 - giorno-vecchio Brachypodium distachyon coltivato in idroponica 0,5 MS (F), in sabbia (G) e terreno (H), Brachypodium distachyon (D) e (C-E) 7 - giorno-vecchio thaliana di Arabidopsis (C) substrato fornito con 0,5 MS Media e acqua, rispettivamente. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57170/57170fig8large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57170/57170fig9.jpg"> Figura 9: utilizzo di EcoFABs per studiare la morfologia della radice. (A-F) Lo sviluppo delle radici di Brachypodium distachyon crescendo in EcoFABs riempito con il mezzo di 0,5 MS durante le prime tre settimane: (A) 2 giorni, (B) 4 giorni, (C) 7 giorni, (D) 11 giorni, (E) 14 giorni, (F) 21 giorni di crescita. (G) aree di superficie media radice sono state stimate dal software ImageJ. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57170/57170fig9large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57170/57170fig10.jpg"> Figura 10: utilizzando EcoFABs per studiare le interazioni di radice-microbo. (A, B, C) Un gruppo di 15 - giorno-vecchio Brachypodium distachyon colonizzando con Pseudomonas fluorescens WCS417 in diverse forme di media-MS substrati di soluzione, sabbia e terreno liquidi. (D, E, F) Immagini di campo luminoso dei loro sistemi di root. (G, H, I) Le immagini corrispondenti a chemiluminescenza di questi sistemi di radice dopo co-coltura di 14 giorni. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57170/57170fig10large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
File supplementari 1. Usando EcoFAB per catturare la crescita delle radici. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57170/video1_capture_growing_roots_(2).mp4">Per favore clicca qui per scaricare questo file.</a>
File supplementare 2. Usando EcoFAB per catturare interazioni radice-microbi. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57170/video2_capture_root_microbes_interaction.avi">Per favore clicca qui per scaricare questo file.</a>

Questo articolo descrive protocolli dettagliati per la fabbricazione di ecosistema di dispositivi (EcoFABs) che permettono studi di piante e interazioni piante-microrganismi in condizioni di laboratorio altamente controllate.

Protocolli di fabbricazione (EcoFAB) di ecosistema per la costruzione degli ecosistemi di laboratorio progettato per studiare le interazioni piante-microrganismi

Beneficial plant-microbe interactions offer a sustainable biological solution with the potential to boost low-input food and bioenergy production. A ...

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di definire approcci standardizzati per la costruzione di ecosistemi vegetali modello semplificati, chiamati EcoFAB, che consentano esperimenti di laboratorio controllati e replicati per studiare le interazioni tra i microbi delle piante che possono essere ulteriormente testate sul campo. Questo metodo può essere utilizzato per studiare le interazioni dei microbi delle piante all'interno di ambienti controllati, il che ci consente di ottenere informazioni meccanicistiche dettagliate sulle funzioni dei microbiomi per consentirci di sfruttarli per un'agricoltura sostenibile. Abbiamo contribuito alla progettazione di questo primo Eco-FAB, che impiega una varietà di tecnologie di stampa 3D disponibili e alla sterilizzazione delle camere di crescita delle piante che consentono sia immagini ad alta risoluzione che analisi chimiche che non distraenti.Il dispositivo Eco-FAB qui sviluppato è adatto per l'analisi delle interazioni tra microbi delle piante perché incorpora l'analisi della morfologia delle radici e l'imaging spettroscopico di massa. A seguito della costruzione degli stampi Eco-FAB, utilizzando la stampa 3D secondo il protocollo di testo, in un contenitore monouso da un litro, miscelare 40 millilitri di base di elastomero silossanico con diversi volumi di agente indurente, a seconda dell'esperimento. Posizionare il contenitore in una camera a vuoto per almeno 30 minuti per rimuovere le bolle d'aria dalla miscela di elastomeri.Quindi, rimuovere il composto e versarlo nello stampo di plastica stampato in 3D assemblato. Per generare uno strato PDMS uniforme, le bolle d'aria devono essere accuratamente rimosse. Utilizzare aria compressa per soffiare via eventuali residui d'aria dopo aver trasferito la miscela nello stampo.Tenere lo stampo su un blocco riscaldante a 85 gradi Celsius per quattro ore. Lasciare raffreddare lo stampo per cinque minuti. Quindi, estrarre delicatamente l'inserto dallo stampo e utilizzare un taglierino per separare lentamente il PDMS dal telaio di colata.Premere la base dello stampo con il PDMS verso l'alto fuori dal telaio di colata. Quindi, utilizzare un coltello o altri strumenti per separare delicatamente lo strato PDMS dalla base dello stampo ai bordi e staccarlo lentamente dalla superficie dello stampo. Utilizzando un ago smussato calibro 15, creare un canale di ingresso sugli strati PDMS praticando fori da 1,6 millimetri in quella parte.Quindi, utilizzare le forbici per tagliare i bordi dei livelli PDMS. Per legare in modo permanente gli strati PDMS ai vetrini del microscopio, utilizzare il metanolo per sciacquare il lato di incollaggio dello strato PDMS su un vetrino da microscopio di 7,6 x cinque centimetri, quindi asciugarli con aria compressa o una pistola ad azoto ultrapuro. Posizionare il vetrino del microscopio e lo strato PDMS in un pulitore al plasma con i lati di incollaggio rivolti verso l'alto.Chiudere la camera e la valvola di sfiato del gas. Quindi, accendi l'aspirapolvere e pompa la camera per un minuto. Accendere il generatore di plasma e impostare la frequenza radio, o il livello RF, su alto per un minuto.Quindi, spegnere sia la pompa del vuoto che l'alimentazione al plasma e sfiatare la camera nell'atmosfera. Estrarre il vetrino del microscopio e lo strato PDMS dalla camera al plasma e premere rapidamente tutti e quattro i bordi dello strato PDMS sul vetrino con una pressione uniforme. Assicurarsi che la regione ovale centrale, che è la camera della radice, non tocchi il vetrino.Utilizzando acqua ultrapura, sciacquare i dispositivi Eco-FAB. Posizionare un dispositivo Eco-FAB in un contenitore Eco-FAB e aggiungere il 70% di etanolo fino a quando il dispositivo non è sommerso. Quindi, chiudi il coperchio del contenitore e agitalo delicatamente per bagnare tutte le superfici interne con etanolo, assicurandoti che la camera di crescita delle radici del dispositivo Eco-FAB sia riempita di etanolo, con pochissime o nessuna bolla d'aria.Dopo aver incubato i dispositivi a temperatura ambiente per 30 minuti, versare l'etanolo al 70% e sostituirlo con etanolo al 100%. Quindi, incubare i dispositivi per cinque minuti. Dopo l'incubazione, scolare l'etanolo e lasciare l'Eco-FAB sterilizzato in una cappa a flusso laminare per 16 ore per asciugarlo completamente.Se disponibile, sterilizzare il sistema accendendo la luce UV nella cappa per un'ora. Per eseguire la sterilizzazione e la germinazione dei semi, immergere i semi in etanolo al 70% per due minuti. Quindi, con una pipetta, rimuovere l'etanolo e utilizzare acqua sterile per sciacquare i semi tre volte.Quindi, immergi i semi in una soluzione di candeggina al 10% per cinque minuti. Quindi, rimuovi la soluzione di candeggina e usa acqua sterile per lavare accuratamente i semi tre volte. Dopo i lavaggi, aggiungere acqua sterile ai semi e incubare la provetta a quattro gradi Celsius per sette giorni.Distribuire uniformemente i semi su 0,5 Murashige e Skoog, o MS medium, con 0,6% di vitagel. E con nastro microporoso, sigillare le piastre. Quindi, fai crescere le piante fino a una lunghezza delle radici di circa cinque millilitri.Per trasferire le piantine negli Eco-FAB, utilizzando una siringa sterile o una micropipetta e acqua sterile, sciacquare tre volte la camera della radice di un dispositivo Eco-FAB, quindi riempire la camera della radice con il terreno di crescita di interesse, come un terreno 0,5 MS. Ora, inserisci con cautela una singola piantina nel serbatoio della pianta del dispositivo Eco-FAB. È importante che le piantine vengano trasferite con cura dalla piastra all'Eco-FAB in modo che le radici non si rompano.Aggiungere tre millilitri di acqua sterile nel contenitore, evitando il dispositivo Eco-FAB. Ciò aumenterà l'umidità e ridurrà l'evaporazione del terreno dalla camera della radice. Quindi, chiudere il contenitore e utilizzare del nastro adesivo microporoso per sigillare il coperchio.Posizionare l'Eco-FAB in un'incubatrice per piante o utilizzare il sistema di illuminazione Eco-FAB in un ambiente a temperatura controllata adatto alla crescita della rispettiva pianta. Quindi, impostare la camera a 24 gradi Celsius. Infine, effettuare la profilazione dei metaboliti e la spettrometria di massa, secondo il protocollo di testo.Queste cifre mostrano Aaabidopsis thaliana di sette giorni, brachypodium distachyon e panicum virgatum che crescono in Eco-FAB. Sia il dicotiledone che il monocotiledone sono stati trovati all'altezza delle loro fasi di riproduzione nell'Eco-FAB. Queste piantine rappresentano un gruppo di brachypodium distachyon di 14 giorni che crescono in substrato idroponico, così come sabbia e terreno integrati rispettivamente con substrato idroponico e acqua.Lo strato di substrato sottile e solido e le camere di crescita delle radici consentono alla luce di penetrare per l'imaging microscopico degli apparati radicali. Qui, una piantina di brachypodium distachyon è stata trasferita nel dispositivo Eco-FAB e la sua struttura radicale è stata registrata da una telecamera all'interno di un imager su gel biorad. La quantificazione dell'area radicale totale nel corso di tre settimane ha mostrato un aumento graduale nella fase iniziale, seguito da un trend di crescita lineare fino alla fine.In questa figura, un Eco-FAB contenente i rizobatteri che promuovono la crescita delle piante, pseudomonas simiae, WCS417 è stato aggiunto ai sistemi radicali delle piante a 10 o alla sesta cellula per pianta. I microbi WCS147 hanno colonizzato la superficie dell'intero apparato radicale con microbi concentrati intorno alle aree della punta delle radici. Quando si rinfrescano i substrati di coltivazione e si raccolgono gli essudati radicali dagli Eco-FAB, è importante ricordare di lavorare tutto il lavoro in una cappa sterile per evitare qualsiasi contaminazione.I dispositivi Eco-FAB possono anche essere fabbricati utilizzando una tenuta fisica reversibile utilizzando un morsetto stampato in 3D o modificando la viscosità del PDMS. Ciò consente l'uso di terreni di crescita solidi e di imaging spettroscopico di massa diretto. Dopo lo sviluppo di Eco-FAB, questo sistema consentirà ai ricercatori di tutto il mondo di utilizzare questi ecosistemi modello di laboratorio per studiare le interazioni tra i microbi delle piante utilizzando la biologia dei sistemi e le tecnologie di imaging.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come fabbricare un sistema Eco-FAB, nonché delle sue ampie applicazioni negli studi sugli ecosistemi. Speriamo che questo progetto Eco-FAB permetta ad altri scienziati di raggiungere i loro specifici obiettivi scientifici. Ancora più importante, speriamo che altri scienziati si basino su questo progetto Eco-FAB e lo migliorino, e lo condividano con altri scienziati, in modo che, come comunità, possiamo costruire questi ecosistemi di laboratorio per permetterci di comprendere meglio le interazioni tra i microbi delle piante.Non dimenticare che lavorare con microbi e oggetti taglienti può essere estremamente pericoloso e che è necessario prendere sempre precauzioni durante l'esecuzione di questa procedura.

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Protocolli di fabbricazione (EcoFAB) di ecosistema per la costruzione degli ecosistemi di laboratorio progettato per studiare le interazioni piante-microrganismi (Video) | JoVE Journal

Protocolli di fabbricazione (EcoFAB) di ecosistema per la costruzione degli ecosistemi di laboratorio progettato per studiare le interazioni piante-microrganismi

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