Protocolli di fabbricazione (EcoFAB) di ecosistema per la costruzione degli ecosistemi di laboratorio progettato per studiare le interazioni piante-microrganismi

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di definire approcci standardizzati per la costruzione di ecosistemi vegetali modello semplificati, chiamati EcoFAB, che consentano esperimenti di laboratorio controllati e replicati per studiare le interazioni tra i microbi delle piante che possono essere ulteriormente testate sul campo. Questo metodo può essere utilizzato per studiare le interazioni dei microbi delle piante all'interno di ambienti controllati, il che ci consente di ottenere informazioni meccanicistiche dettagliate sulle funzioni dei microbiomi per consentirci di sfruttarli per un'agricoltura sostenibile. Abbiamo contribuito alla progettazione di questo primo Eco-FAB, che impiega una varietà di tecnologie di stampa 3D disponibili e alla sterilizzazione delle camere di crescita delle piante che consentono sia immagini ad alta risoluzione che analisi chimiche che non distraenti.

Il dispositivo Eco-FAB qui sviluppato è adatto per l'analisi delle interazioni tra microbi delle piante perché incorpora l'analisi della morfologia delle radici e l'imaging spettroscopico di massa. A seguito della costruzione degli stampi Eco-FAB, utilizzando la stampa 3D secondo il protocollo di testo, in un contenitore monouso da un litro, miscelare 40 millilitri di base di elastomero silossanico con diversi volumi di agente indurente, a seconda dell'esperimento. Posizionare il contenitore in una camera a vuoto per almeno 30 minuti per rimuovere le bolle d'aria dalla miscela di elastomeri.

Quindi, rimuovere il composto e versarlo nello stampo di plastica stampato in 3D assemblato. Per generare uno strato PDMS uniforme, le bolle d'aria devono essere accuratamente rimosse. Utilizzare aria compressa per soffiare via eventuali residui d'aria dopo aver trasferito la miscela nello stampo.

Tenere lo stampo su un blocco riscaldante a 85 gradi Celsius per quattro ore. Lasciare raffreddare lo stampo per cinque minuti. Quindi, estrarre delicatamente l'inserto dallo stampo e utilizzare un taglierino per separare lentamente il PDMS dal telaio di colata.

Premere la base dello stampo con il PDMS verso l'alto fuori dal telaio di colata. Quindi, utilizzare un coltello o altri strumenti per separare delicatamente lo strato PDMS dalla base dello stampo ai bordi e staccarlo lentamente dalla superficie dello stampo. Utilizzando un ago smussato calibro 15, creare un canale di ingresso sugli strati PDMS praticando fori da 1,6 millimetri in quella parte.

Quindi, utilizzare le forbici per tagliare i bordi dei livelli PDMS. Per legare in modo permanente gli strati PDMS ai vetrini del microscopio, utilizzare il metanolo per sciacquare il lato di incollaggio dello strato PDMS su un vetrino da microscopio di 7,6 x cinque centimetri, quindi asciugarli con aria compressa o una pistola ad azoto ultrapuro. Posizionare il vetrino del microscopio e lo strato PDMS in un pulitore al plasma con i lati di incollaggio rivolti verso l'alto.

Chiudere la camera e la valvola di sfiato del gas. Quindi, accendi l'aspirapolvere e pompa la camera per un minuto. Accendere il generatore di plasma e impostare la frequenza radio, o il livello RF, su alto per un minuto.

Quindi, spegnere sia la pompa del vuoto che l'alimentazione al plasma e sfiatare la camera nell'atmosfera. Estrarre il vetrino del microscopio e lo strato PDMS dalla camera al plasma e premere rapidamente tutti e quattro i bordi dello strato PDMS sul vetrino con una pressione uniforme. Assicurarsi che la regione ovale centrale, che è la camera della radice, non tocchi il vetrino.

Utilizzando acqua ultrapura, sciacquare i dispositivi Eco-FAB. Posizionare un dispositivo Eco-FAB in un contenitore Eco-FAB e aggiungere il 70% di etanolo fino a quando il dispositivo non è sommerso. Quindi, chiudi il coperchio del contenitore e agitalo delicatamente per bagnare tutte le superfici interne con etanolo, assicurandoti che la camera di crescita delle radici del dispositivo Eco-FAB sia riempita di etanolo, con pochissime o nessuna bolla d'aria.

Dopo aver incubato i dispositivi a temperatura ambiente per 30 minuti, versare l'etanolo al 70% e sostituirlo con etanolo al 100%. Quindi, incubare i dispositivi per cinque minuti. Dopo l'incubazione, scolare l'etanolo e lasciare l'Eco-FAB sterilizzato in una cappa a flusso laminare per 16 ore per asciugarlo completamente.

Se disponibile, sterilizzare il sistema accendendo la luce UV nella cappa per un'ora. Per eseguire la sterilizzazione e la germinazione dei semi, immergere i semi in etanolo al 70% per due minuti. Quindi, con una pipetta, rimuovere l'etanolo e utilizzare acqua sterile per sciacquare i semi tre volte.

Quindi, immergi i semi in una soluzione di candeggina al 10% per cinque minuti. Quindi, rimuovi la soluzione di candeggina e usa acqua sterile per lavare accuratamente i semi tre volte. Dopo i lavaggi, aggiungere acqua sterile ai semi e incubare la provetta a quattro gradi Celsius per sette giorni.

Distribuire uniformemente i semi su 0,5 Murashige e Skoog, o MS medium, con 0,6% di vitagel. E con nastro microporoso, sigillare le piastre. Quindi, fai crescere le piante fino a una lunghezza delle radici di circa cinque millilitri.

Per trasferire le piantine negli Eco-FAB, utilizzando una siringa sterile o una micropipetta e acqua sterile, sciacquare tre volte la camera della radice di un dispositivo Eco-FAB, quindi riempire la camera della radice con il terreno di crescita di interesse, come un terreno 0,5 MS. Ora, inserisci con cautela una singola piantina nel serbatoio della pianta del dispositivo Eco-FAB. È importante che le piantine vengano trasferite con cura dalla piastra all'Eco-FAB in modo che le radici non si rompano.

Aggiungere tre millilitri di acqua sterile nel contenitore, evitando il dispositivo Eco-FAB. Ciò aumenterà l'umidità e ridurrà l'evaporazione del terreno dalla camera della radice. Quindi, chiudere il contenitore e utilizzare del nastro adesivo microporoso per sigillare il coperchio.

Posizionare l'Eco-FAB in un'incubatrice per piante o utilizzare il sistema di illuminazione Eco-FAB in un ambiente a temperatura controllata adatto alla crescita della rispettiva pianta. Quindi, impostare la camera a 24 gradi Celsius. Infine, effettuare la profilazione dei metaboliti e la spettrometria di massa, secondo il protocollo di testo.

Queste cifre mostrano Aaabidopsis thaliana di sette giorni, brachypodium distachyon e panicum virgatum che crescono in Eco-FAB. Sia il dicotiledone che il monocotiledone sono stati trovati all'altezza delle loro fasi di riproduzione nell'Eco-FAB. Queste piantine rappresentano un gruppo di brachypodium distachyon di 14 giorni che crescono in substrato idroponico, così come sabbia e terreno integrati rispettivamente con substrato idroponico e acqua.

Lo strato di substrato sottile e solido e le camere di crescita delle radici consentono alla luce di penetrare per l'imaging microscopico degli apparati radicali. Qui, una piantina di brachypodium distachyon è stata trasferita nel dispositivo Eco-FAB e la sua struttura radicale è stata registrata da una telecamera all'interno di un imager su gel biorad. La quantificazione dell'area radicale totale nel corso di tre settimane ha mostrato un aumento graduale nella fase iniziale, seguito da un trend di crescita lineare fino alla fine.

In questa figura, un Eco-FAB contenente i rizobatteri che promuovono la crescita delle piante, pseudomonas simiae, WCS417 è stato aggiunto ai sistemi radicali delle piante a 10 o alla sesta cellula per pianta. I microbi WCS147 hanno colonizzato la superficie dell'intero apparato radicale con microbi concentrati intorno alle aree della punta delle radici. Quando si rinfrescano i substrati di coltivazione e si raccolgono gli essudati radicali dagli Eco-FAB, è importante ricordare di lavorare tutto il lavoro in una cappa sterile per evitare qualsiasi contaminazione.

dispositivi Eco-FAB possono anche essere fabbricati utilizzando una tenuta fisica reversibile utilizzando un morsetto stampato in 3D o modificando la viscosità del PDMS. Ciò consente l'uso di terreni di crescita solidi e di imaging spettroscopico di massa diretto. Dopo lo sviluppo di Eco-FAB, questo sistema consentirà ai ricercatori di tutto il mondo di utilizzare questi ecosistemi modello di laboratorio per studiare le interazioni tra i microbi delle piante utilizzando la biologia dei sistemi e le tecnologie di imaging.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come fabbricare un sistema Eco-FAB, nonché delle sue ampie applicazioni negli studi sugli ecosistemi. Speriamo che questo progetto Eco-FAB permetta ad altri scienziati di raggiungere i loro specifici obiettivi scientifici. Ancora più importante, speriamo che altri scienziati si basino su questo progetto Eco-FAB e lo migliorino, e lo condividano con altri scienziati, in modo che, come comunità, possiamo costruire questi ecosistemi di laboratorio per permetterci di comprendere meglio le interazioni tra i microbi delle piante.

Non dimenticare che lavorare con microbi e oggetti taglienti può essere estremamente pericoloso e che è necessario prendere sempre precauzioni durante l'esecuzione di questa procedura.