Formazione di covalente del DNA addotti da agenti cancerogeni enzimaticamente attivati e farmaci In Vitro e la loro determinazione di ³²P-postlabeling

L'obiettivo generale di questo protocollo è la descrizione dei metodi che impiegano le reazioni catalizzate dal citocromo p450 e da ulteriori enzimi di biotrasformazione per studiare la potenza di sostanze chimiche o farmaci per la loro attivazione nei metaboliti che formano addotti covalenti del DNA. Questo metodo può aiutare a rispondere alle domande chiave nel campo dello sviluppo del cancro e del suo trattamento. Il vantaggio principale di questa tecnica è che mostra un tipo di metodo per valutare la potenza di sostanze chimiche o farmaci ambientali per formare addotti covalenti del DNA che rappresentano l'inizio dello sviluppo del cancro.

Le implicazioni della tecnica che determina la potenza cancerogena delle sostanze chimiche. Potenza ambientale, sostanze tossiche e farmaci e determina anche metodi relativamente semplici per la formazione di addotti covalenti del DNA formati da tali composti. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sull'inizio dello sviluppo del cancro e sul suo trattamento, può essere applicato anche ad altri campi scientifici.

Come gli studi sui meccanismi molecolari, sul danno al DNA e gli studi orali sull'attivazione enzimatica e la tossificazione delle sostanze chimiche. Ho sentito per la prima volta l'idea di questo metodo quando ho studiato i processi coinvolti nella fase di inizio della cancerogenesi chimica. Per prima cosa preparare la miscela di incubazione aggiungendo tutti i composti e i sistemi enzimatici fino a un volume finale di 0,75 millilitri a quattro gradi Celsius.

Questo serve a incubare il cancerogeno con il DNA in presenza di citocromo p450. Quindi, aggiungere alla miscela microsomi o p450 ricombinante puro in supersoma. Successivamente, aggiungere 7,5 microlitri di farmaco ellittico da 0,1 millimolari disciolti in DMSO e 42,5 microlitri di acqua per regolare il volume finale a 0,75 millilitri.

Quindi, mescolare i componenti facendo vorticare il tubo per cinque secondi. Subito dopo, incubare la provetta a 37 gradi Celsius con il coperchio aperto per 30-60 minuti. Quindi, mescolare il fenolo o il cloroformio fenolico in un rapporto uno a uno con la miscela di incubazione in una provetta Eppendorf.

Questo rimuoverà la contaminazione proteica dal DNA nella miscela di incubazione. Quindi mescolare il composto fino a formare un'emulsione. Quindi centrifugare il composto a 1600 volte g per tre minuti a temperatura ambiente.

Una volta terminata la centrifugazione, utilizzare una pipetta per trasferire la fase acquosa superiore in una nuova provetta in polipropilene. Quindi scartare l'interfaccia proteica insieme alla fase organica. Successivamente, mescolare la fase acquosa con un volume equivalente di fenolo e cloroformio in un rapporto uno a uno.

Ripetere quindi la centrifugazione. Quindi aggiungere volumi uguali di cloroformio alla fase acquosa raccolta e centrifugare nuovamente. Quindi precipitare il DNA dalla fase acquosa aggiungendo due volumi di etanolo freddo mantenuto a meno 20 gradi Celsius.

Quindi mescolare bene la soluzione. Per prepararsi alla marcatura degli addotti del DNA, mescolare la soluzione tampone bicina con la soluzione di ATP radiomarcata per marcare gli addotti del DNA. Aggiungere la miscela di etichettatura alla soluzione NP1 o alla miscela di arricchimento di butanolo.

Lasciate riposare il composto a temperatura ambiente per 30 minuti. Quindi applicare circa 20 microlitri su tutto il campione sulla piastra TLC in PEI-cellulosa. Dopo aver individuato il campione sulla piastra TLC in PEI-cellulosa, lasciare che la piastra si sviluppi in direzione D1 per ripulire gli addotti.

Una volta che la piastra si è asciugata, lasciare che la piastra si sviluppi nelle direzioni D3 e D4. Per lo sviluppo in D3, utilizzare tampone formiato di litio a pH 3,5 con urea. Per lo sviluppo della D4, utilizzare il tampone Tris-HCl con cloruro di litio e urea.

Per evitare problemi di sviluppo in direzione D4, sviluppare anche le piastre in direzione D5. In primo luogo, la tecnica di post-marcatura P32 viene utilizzata per studiare l'efficienza dell'elliptticina bioattivata mediata da p450 microsomiale nella formazione di addotti di DNA. I risultati mostrano la formazione di addotti covalenti del DNA del DNA della desossiguanosina del timo di vitello in presenza di microsomi epatici sia di ratto che umani; Tuttavia, non si formano addotti nel gruppo di controllo.

Successivamente, viene studiato il potenziale dell'ellipticina attivata dipendente dall'enzima perossidasi. L'immagine mostra la formazione di addotti covalenti del DNA nel DNA del timo di vitello in presenza di perossidasi di rafano, lattoperossidasi bovina e mieloperossidasi umana. Infatti, gli addotti del DNA si formano anche dal DNA del fegato quando i ratti vengono trattati con 40 milligrammi per chilogrammo di peso corporeo di ellipticina in vivo.

È interessante notare che l'enzima umano del citocromo p450 CYP3A4 mostra anche un forte potenziale per ossidare efficacemente l'ellipticina in metaboliti come la 12-idrossiellipticina e la 13-idrossielliptticina. Questi metaboliti possono facilmente legarsi al DNA per formare gli adddotti. Successivamente, i metodi di arricchimento della nucleasi P1 e dell'n-butanolo vengono utilizzati per studiare la formazione di addotti del DNA dopo l'attivazione del 3-nitrobenzantrono con reduttasi citosolica come NQ01 dal ratto e dall'uomo.

I risultati mostrano la formazione di un massimo di cinque addotti di DNA dal timo di vitello DNA ottenuto dal ratto, citosol epatico umano e anche fegato di topi. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in due giorni se eseguita correttamente. Tentando questa procedura è importante ricordare la stabilità dei sistemi enzimatici utilizzati.

L'attività enzimatica può diminuire se non viene conservata nel ghiaccio. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biochimica, la biochimica della cancerogenesi chimica per esplorare la natura del fenomeno dai processi di inizio dello sviluppo del cancro negli organismi. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come valutare la potenza di sostanze chimiche ambientali o farmaci da attivare enzimaticamente per metabolizzare gli addotti genetici covalenti del DNA.

Questo processo rappresenta un'importanza elevata per lo sviluppo di trattamenti basati sul cancro. Non dimenticare che stai lavorando con sostanze chimiche che possono essere estremamente pericolose. Potenziali agenti cancerogeni, sostanze chimiche radioattive, ad esempio il fosforo ATP.

Pertanto, durante l'esecuzione di questa procedura è necessario adottare sempre precauzioni come guanti in lattice da laboratorio e fogli di plexiglass.