Identificazione delle cellule satelliti del muscolo scheletrico dall'immunofluorescenza con Pax7 e Laminin anticorpi

L'obiettivo generale di questo protocollo è identificare le cellule satelliti del muscolo scheletrico adulto tramite immunofluorescenza. Questo metodo può rispondere a domande chiave relative al numero e alla distribuzione delle cellule staminali muscolari sia in condizioni fisiologiche che patologiche. Il vantaggio principale della tecnica è che è possibile identificare le cellule staminali muscolari nel loro ambiente fisiologico con una manipolazione limitata.

A dimostrare la procedura sarà Faiza Naz, una postdoc del mio laboratorio. Per iniziare, prepara un bagno di azoto liquido versando azoto liquido in un pallone Dewar. Quindi, versare 10 millilitri di metilbutano in un becher di plastica da 20 millilitri e trasferire il becher nel bagno di azoto liquido.

Appoggiare il muscolo tibiale anteriore sezionato sulla superficie piana di un piccolo stantuffo a siringa di plastica. Quindi, coprire il muscolo sezionato con alcune gocce di composto a temperatura di taglio ottimale o OCT. Rimuovere il becher di metilbutano dal bagno di azoto liquido, quindi scongelare la superficie utilizzando i manici di un paio di forbici. Immergere rapidamente il fazzoletto ricoperto di O.C.T. nel metilbutano fuso per congelarlo.

Quindi, usa una pinza per staccare il tessuto incorporato dallo stantuffo e trasferirlo in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri. Quindi, conservare la provetta per microcentrifuga nell'azoto liquido. Per iniziare il sezionamento del criostato, aggiungere una goccia di composto OCT al centro del portacampione di un criostato e lasciarlo solidificare parzialmente.

Quindi, infilare il tessuto incorporato nel composto OCT con la caviglia rivolta verso il basso e il ginocchio rivolto verso l'alto. Quindi, montare il portacampioni sul criostato e tagliare il tessuto a intervalli di 10 micrometri. Raccogli da quattro a otto criosezioni su ogni vetrino rivestito di gelo.

Asciugare le sezioni a temperatura ambiente per tre ore, quindi raccogliere i vetrini in una scatola per vetrini e conservarli a meno 80 gradi Celsius. Quindi, rimuovere un vetrino dalla scatola dei vetrini e riscaldarlo a temperatura ambiente. Quindi, utilizzare una penna bloccante per liquidi per contrassegnare un'area attorno alle criosezioni per evitare che i liquidi fluiscano lateralmente.

In una cappa aspirante, aggiungere da 300 a 500 microlitri di paraformaldeide al 4% nell'area contrassegnata. Incubare il vetrino a temperatura ambiente per 10 minuti per fissare le sezioni. Quindi, sciacquare la paraformaldeide dal vetrino con PBS in un contenitore per vetrini.

Per iniziare il recupero dell'antigene, riempire un contenitore di vetrini con 200 millilitri di tampone citrato e trasferire il vetrino nel contenitore. Quindi, trasferire il contenitore dello scivolo in una pentola a pressione ad alta pressione per 10 minuti. La fase di recupero dell'antigene è facoltativa se le sezioni vengono essiccate a temperatura ambiente per 30 minuti e procedono immediatamente.

In questo caso non è necessaria la fase di recupero dell'antigene. Ma se le sezioni vengono essiccate a temperatura ambiente per più di tre ore e poi conservate a meno 80 gradi Celsius, è necessaria la fase di recupero dell'antigene. Quindi, raffreddare il contenitore dello scivolo sotto l'acqua corrente per 10 minuti.

Quindi trasferire il vetrino in un nuovo contenitore con 200 millilitri di PBST e risciacquare con PBST. Aggiungere salviette da laboratorio imbevute d'acqua al vassoio, quindi annotare il vetrino risciacquato con una penna PAP e posizionarlo nel vassoio. Aggiungere 200 microlitri di soluzione bloccante al vetrino.

Quindi coprire il vassoio e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti. La fase di blocco è molto importante perché l'anticorpo Pax7 utilizzato è un anticorpo monoclonale di topo. Il passaggio di blocco mouse su mouse riduce le associazioni non specifiche.

Quindi, sciacquare il vetrino con PBST nel contenitore del vetrino e rimetterlo nel vassoio. Aggiungere 200 microlitri di miscela di anticorpi primari al vetrino e incubare a temperatura ambiente per un'ora. Successivamente, sciacquare il vetrino con PBST, quindi aggiungere 200 microlitri di miscela di anticorpi secondari e incubare al buio a temperatura ambiente per un'ora.

Dopo il periodo di incubazione, sciacquare il vetrino con PBST. Diluire DAPI in un contenitore per vetrini e incubare il vetrino nel contenitore per tre minuti. Quindi, sciacquare il DAPI con PBST per cinque minuti.

Infine, montare il vetrino con il supporto di montaggio e applicare un vetrino coprioggetti. In questo studio, le cellule satelliti sono state visualizzate con successo in sezioni muscolari adulte a riposo sotto un microscopio a fluorescenza. Il rumore di fondo solitamente osservato con il tessuto muscolare adulto e alcuni tipi di fibre viene ridotto utilizzando il blocco topo su topo.

I segnali specifici dell'immunocolorazione sono potenziati utilizzando anticorpi secondari coniugati con coloranti Alexa brillanti. Un microscopio confocale a due fotoni cattura un'immagine più nitida rispetto al microscopio fluorescente a campo largo. Lo stesso protocollo può essere applicato anche al tessuto muscolare di topi giovani, embrioni di topo e tessuti muscolari adulti danneggiati.

Sia i tessuti muscolari giovanili che quelli embrionali raffigurano cellule satelliti più attivate o precursori miogenici di Pax7 con nuclei relativamente più grandi. In questo modo diventa più facile visualizzare le cellule satelliti dei topi più giovani che dei topi adulti. Nel tessuto muscolare danneggiato, sono visibili più cellule Pax7-positive attivate.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in cinque ore se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che il rumore proveniente dall'autofluorescenza e dall'immuno-legame aspecifico topo su topo non può essere totalmente eliminato, ma con questo protocollo il rumore può essere notevolmente ridotto. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come identificare le cellule satelliti nelle criosezioni muscolari.