Name: Analisi di afflusso del calcio mitocondriale in mitocondri isolati e cellule coltivate (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-27T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: Scopri come misurare l'afflusso di calcio mitocondriale in mitocondri isolati e cellule coltivate utilizzando saggi con plate reader e microscopia confocale. Questi metodi aiutano a studiare la segnalazione del calcio e le dinamiche mitocondriali nelle malattie.

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Questo lavoro è stato supportato da concedere finanziamenti dall'associazione americana di cuore (J.Q.K.).

Tutti i metodi descritti in questo protocollo sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e uso Comitato della Emory University.
Nota: La prima parte è la procedura sperimentale per la misura di afflusso Ca2 + mitocondriale in mitocondri cardiaci isolati utilizzando un lettore di piastra.
1. reagenti e soluzioni
<ol><li>Fare 500 mL di tampone di MS-EGTA per isolamento mitocondriale: 225 mM mannitolo, saccarosio di 75 mM, 5 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acido (HEPES), 1 mM glicole etilenico-bis(β-aminoethyl ether)-N, N, N', N'-acido etilendiamminotetraacetico (EGTA), pH regolato a 7,4 con KOH. Sterilizzarlo attraverso un filtro di 0,22 μm e conservarla a 4 ° C. Assicurarsi che il buffer di MS-EGTA è pre-refrigerato a 4 ° C prima dell'uso.</li>
	<li>Preparare 100 mL di tampone di KCl: 125 mM KCl, 20 mM HEPES, 1mm KH2PO4, 2mm MgCl2, 40 μM EGTA e pH regolato a 7,2 con KOH. Conservare a temperatura ambiente.</li>
	<li>Preparare calcio 1 mM verde-5N stock in dimetilsolfossido (DMSO). Lo stock di verde-5N di calcio può essere aliquotato e conservato a-20 ° C.</li>
	<li>
Preparare substrati per Ca2 + l'assorbimento.
	<ol>
<li>Preparare il piruvato di sodio 1 M, pH 7,4. Conservarlo in aliquote a-20 ° C.</li>
		<li>Preparare malate di 500 mM, pH 7.4. Conservarlo in aliquote a-20 ° C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. isolamento dei mitocondri cardiaci
<ol><li>Eutanasia il mouse secondo le norme istituzionali. Nota: Per il nostro metodo approvato dall'istituzione dell'eutanasia, topi erano anestetizzati per inalazione isofluorano e sacrificati dalla dislocazione cervicale.</li>
	<li>Raccogliere il cuore di cavità toracica di apertura, taglio lungo entrambi i lati delle nervature, che fiancheggiano il cuore, tagliando via il diaframma e asportando il tessuto del cuore. Nota: In questo protocollo, isolamento mitocondriale viene eseguita da un cuore intero raccolto da un topo adulto (circa 120 mg), che dovrebbe essere sufficiente per 3-4 esperimenti. Per l'isolamento mitocondriale da altri tessuti ricchi di mitocondri quali il fegato, fino a 200 mg di tessuto può essere utilizzato seguendo il protocollo descritto.</li>
	<li>Sciacquare il tessuto accuratamente in 25 mL di gelida 1x tamponato fosfato salino (PBS) assicurando che tutto il sangue viene spremuto fuori i ventricoli. Nota: Il cuore viene risciacquato sufficientemente quando il liquido spremuto fuori dal cuore esce pulito.</li>
	<li>Tritare il cuore in piccoli pezzi in 5 mL di PBS 1X ghiacciata usando un paio di forbici affilate.</li>
	<li>Scartare il PBS e trasferimento di tessuto cardiaco macinate in un omogeneizzatore di lisata pre-refrigerati 7 mL vetro-teflon con una clearance di 0,10 a 0,15 mm.</li>
	<li>Aggiungere 5 mL di buffer di MS-EGTA ghiacciata e omogeneizzare il campione fino a pezzi di tessuto non sono più visibili (circa 11 colpi). Nota: Non over-omogeneizzare il tessuto come l'obiettivo è quello di ottenere i mitocondri intatti e funzionali.</li>
	<li>Trasferire l'omogeneizzato in una provetta da 15 mL.</li>
	<li>Centrifugare l'omogeneizzato a 600 x g a 4 ° C per 5 min a pellet di nuclei e cellule ininterrotte.</li>
	<li>Trasferire il surnatante in una provetta di fresco da 15 mL e centrifugare esso a 10.000 x g a 4 ° C per 10 min a pellet mitocondri.</li>
	<li>Scartare il surnatante e tenere il pellet mitocondriale sul ghiaccio.</li>
	<li>Lavare la pallina mitocondriale utilizzando due volte ghiacciata MS-EGTA buffer. Per ogni lavaggio, risospendere il pellet mitocondriale in 5 mL di buffer di MS-EGTA, centrifugare e a 10.000 x g a 4 ° C per 10 min e scartare il surnatante.</li>
	<li>Dopo il lavaggio finale, scartare il surnatante e risospendere i mitocondri in 100 μL di tampone di MS-EGTA freddo di ghiaccio. Tenere i mitocondri sul ghiaccio. Nota: I mitocondri devono essere utilizzati per la sperimentazione entro 1 h.</li>
	<li>Misurare la concentrazione di proteina mitocondriale utilizzando un' analisi della proteina di Bradford26.</li>
</ol>3. piastra lettore-basato di misurazione dell'assorbimento del calcio mitocondriale
Nota: Qui è descritto il protocollo per l'analisi mitocondriale Ca2 + assorbimento utilizzando un lettore di piastra multimodo dotato di iniettori. Qualsiasi piatto lettore con la capacità di lettura di fluorescenza verde-5N calcio (eccitazione/emissione di 506/532 nm) in modalità cinetica con reagente automatizzato possono essere utilizzati iniettori per mantenere la reazione al riparo dalla luce.
<ol><li>Programma lettore della piastra per eseguire una cinetica leggere di fluorescenza verde-5N calcio con misurazioni effettuate ogni secondo per un tempo di dosaggio totale di 1.000 s. Inoltre, programmare gli iniettori di reagente a dispensare 5 μL di soluzione di CaCl2 ore 30 s, 150 s, 300 s , 480 s e 690 punti di tempo s. Nota: I tempi di CaCl2 iniezioni sono definiti dall'utente e possono essere adattate per esigenze sperimentali.</li>
	<li>Adescare gli iniettori di reagente con la soluzione di CaCl2 deve essere utilizzato. Nota: La concentrazione della soluzione CaCl2 è definito dall'utente e può essere registrata in esecuzioni successive a titolare la quantità di Ca2 + per attivare MPTP apertura necessaria.</li>
	<li>Aggiungere 200 μg di mitocondri in un individuale pozzetto di una piastra ben 96.</li>
	<li>Aggiungere il volume appropriato di buffer di KCl tale che il volume totale dei mitocondri e buffer di KCl nasce a 197 μL.</li>
	<li>Aggiungere 1 μL di piruvato di 1 M e 1 μL di malate di 500 mM per la miscela di mitocondri. Pipettare delicatamente per mescolare e incubare i mitocondri con i substrati per 2 min a temperatura ambiente per consentire i mitocondri diventare stimolato.</li>
	<li>Aggiungere 1 μL di stock di 1mm del calcio verde-5N. Mescolare delicatamente pipettando. Nota: Proteggere la reazione dalla luce dopo l'aggiunta del colorante verde-5N calcio.</li>
	<li>Avviare il pre-programmati cinetica protocollo e monitor del calcio verde-5N fluorescenza.</li>
</ol>4. reagenti e soluzioni
Nota: La seconda parte è una procedura sperimentale per l'imaging confocale di mitocondriale Ca2 + in cellule coltivate
<ol><li>Rendere la soluzione di Tyrode (130 mM NaCl, 4 mM KCl, 2mm CaCl2, 1mm MgCl2, 10 millimetri di glucosio e 10 mM HEPES, pH di 7,2 con KOH). Conservare a 4 ° C. Scaldare a temperatura ambiente prima dell'uso.</li>
	<li>Preparare la soluzione di lavaggio (acetato di potassio di 100 mM, 15 mM KCl, 5mm KH2PO4, 5mm Mg-ATP, 0,35 mM EGTA, 0,12 mM CaCl2, 0.75 mM MgCl2, fosfocreatina di 10 mM, 10 mM HEPES, pH di 7,2 con KOH). Conservare a 4 ° C. Scaldare a temperatura ambiente prima dell'uso.</li>
	<li>Preparare la soluzione di permeabilizzazione, che contiene saponina 0,005% in soluzione di lavaggio. Prepararlo fresco ogni giorno.</li>
	<li>Preparare 0 Ca2 + soluzione interna (100mm potassio acetato, 15 mM KCl, 0,35 mM EGTA, 0,75 mM MgCl2, 10 mM HEPES, pH regolato a 7,2 con KOH). Conservare a 4 ° C. Scaldare a temperatura ambiente prima dell'uso.</li>
	<li>Preparare soluzione interna contenente Ca2 +. Aggiungere CaCl2 per la soluzione interna sopra per raggiungere la concentrazione di Ca libero2 +desiderata. La quantità di CaCl2 per aggiungere viene calcolata utilizzando il programma MaxChelator (maxchelator.stanford.edu).</li>
	<li>Preparare 1 mM Rhod-2/AM brodo in DMSO e conservare a-20 ° C fino all'utilizzo.</li>
	<li>Preparare 1 mM MitoTracker brodo verde in DMSO e conservare a-20 ° C fino all'utilizzo.</li>
</ol>5. placcatura cellule per l'Imaging
<ol><li>22x22 cm2 vetrini coprioggetti con etanolo al 100% di lavare e asciugare i vetrini coprioggetto per aria.</li>
	<li>Posizionare i vetrini coprioggetti in singoli pozzetti di una piastra di coltura del tessuto 6 pozzetti. Nota: Le lamelle possono essere rivestite con laminina, poli-L-lisina o simile matrice per promuovere l'adesione delle cellule.</li>
	<li>Tripsinizzano e le cellule sul lamelle che mira per circa il 70% confluenza il giorno dell'imaging della lastra.</li>
</ol>6. caricamento di cellule con il Rhod-2/AM e MitoTracker Green
<ol><li>Preparare Rhod-2/AM-MitoTracker verde soluzione di lavoro. Aggiungere 20 μL di Rhod-2/AM 1 mM stock, 0,2 μL di Stock in MitoTracker verde 1 mM e 2,5 μL di 20% pluronic F-127 a 1 mL di soluzione di Tyrode. La concentrazione finale di Rhod-2 della soluzione di lavoro è di 20 µM e la concentrazione finale di MitoTracker green è di 200 nM.</li>
	<li>Rimuovere delicatamente il supporto di crescita dal vetrino coprioggetti. Nota: Un passaggio di lavaggio non è necessario prima dell'aggiunta di soluzione colorante.</li>
	<li>Aggiungere il Rhod-2/AM-MitoTracker soluzione verde in modo goccia a goccia sul coprioggetto finché il coprioggetto è appena coperto (circa 3-4 gocce al vetrino coprioggetti).</li>
	<li>Incubare per 30 min a temperatura ambiente al riparo dalla luce per permettere alle cellule di carico con i coloranti.</li>
	<li>De-esterificare il Rhod-2am. Rimuovere delicatamente il Rhod-2/AM-MitoTracker soluzione verde e sostituirlo con soluzione di Tyrode fresca temperatura ambiente Incubare 30 min a temperatura ambiente al riparo dalla luce.</li>
</ol>7. confocale Imaging del mitocondriale Rhod-2am e fluorescenza MitoTracker Green
<ol><li>Trasferire il coprioggetto al microscopio imaging camera e riempire la camera con soluzione di lavaggio.</li>
	<li>In impostazioni per l'osservazione di cellule in contrasto di fase a 40x, regolare la messa a fuoco fino a quando le cellule sono visibili e messo a fuoco.</li>
	<li>
Permeabilize membrana plasmatica di Rhod-2/AM-MitoTracker verde caricato celle per rimuovere localizzato cytosol Rhod-2, pur mantenendo la tintura localizzato i mitocondri.
	<ol>
<li>Rimuovere la soluzione di lavaggio dal vetrino coprioggetti.</li>
		<li>Sostituirlo con soluzione di permeabilizzazione per circa 1 min.</li>
		<li>Controllare visivamente la morfologia di membrana plasmatica durante tutto il processo di permeabilizzazione. Celle permeabilized svilupperà una superficie ruvida.</li>
		<li>Quando permeabilizzazione è completa, immediatamente rimuovere la soluzione di permeabilizzazione e sostituirlo con 0 Ca2 + soluzione interna.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Allo stesso tempo immagine Rhod-2 fluorescenza (eccitazione utilizzando la linea laser nm e l'emissione raccolti a lunghezze d'onda tra 575-675 nm 559) e MitoTracker verde fluorescenza (eccitazione utilizzando la linea laser 488nm e l'emissione raccolti a lunghezze d'onda tra 505-525 nm). Concentrarsi su celle permeabilized visualizzati da un chiaro colocalizzazione di Rhod-2 e MitoTracker verde.</li>
	<li>Diminuire il laser di microscopio e impostazioni di guadagno tale che la fluorescenza Rhod-2 mitocondriale è fioca e appena visibile.</li>
	<li>Selezionare impostazioni di microscopio di acquisire scansioni 2-dimensionale di un corso di tasso e tempo di frame appropriato per la specifica applicazione. Un frame rate di almeno 30 fotogrammi/s è consigliato per acquisire con precisione la cinetica dei cambiamenti in mitocondriale Ca2 +.</li>
	<li>Rimuovere la Ca 02 + soluzione interna senza disturbare le celle o la messa a fuoco del microscopio.</li>
	<li>Avviare l'acquisizione di immagini.</li>
	<li>Aggiungere Ca2 +-soluzione interna piena al momento s 10 punto manualmente o con un sistema di perfusione.</li>
	<li>Selezionare le regioni di interesse (ROI) per comprendere le regioni di colocalizzazione tra mitocondriale Rhod-2 e MitoTracker verde segnale del software di acquisizione immagine. Nota: Per ogni ROI vengono ottenuti i valori di fluorescenza arbitrario (F) per ogni punto di tempo della registrazione. Questi valori sono sfondo sottratto e normalizzato per la fluorescenza iniziale (prima del Ca2 + aggiunta; F0) e tracciate come F/F0 nel corso del tempo per la presentazione dei dati e la quantificazione dell'ampiezza del cambiamento di mitocondriale Ca2 +.</li>
</ol>

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<li>Matlib, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen-bridged+dinuclear+ruthenium+amine+complex+specifically+inhibits+Ca2%2B+uptake+into+mitochondria+in+vitro+and+in+situ+in+single+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Oxygen-bridged dinuclear ruthenium amine complex specifically inhibits Ca2+ uptake into mitochondria in vitro and in situ in single cardiac myocytes.</a> J Biol Chem. 273 (17), 10223-10231 (1998).</li>
<li>Chamberlain, B. K., Volpe, P., Fleischer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+calcium-induced+calcium+release+from+purified+cardiac+sarcoplasmic+reticulum+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Inhibition of calcium-induced calcium release from purified cardiac sarcoplasmic reticulum vesicles.</a> J Biol Chem. 259 (12), 7547-7553 (1984).</li>
</ol>

Gli autori non hanno alcuna informativa al rapporto.

Qui, descriviamo due diversi approcci per misurare mitocondriale afflusso di Ca2 + . La piastra lettore-basato del calcio verde-5N Metodo Monitor extramitochondrial Ca2 + livelli ed è una Ca2 + analisi di assorbimento che è ben adatta per le misurazioni in mitocondri isolati. Mentre abbiamo dimostrato risultati rappresentativi da mitocondri cardiaci murini isolati, questo test può essere facilmente adattato per i mitocondri isolati dai tessuti con alta abbondanza mitocondriale compreso fe...

I mitocondri sono siti critici di intracellulare Ca2 + deposito e segnalazione. Decenni di ricerche hanno dimostrato che i mitocondri hanno la capacità di importare e sequestrare il Ca2 + 1,2. Mitocondri, tuttavia, non sono meramente passive siti diCa 2 + storage. CA2 + presso il compartimento mitocondriale svolge funzioni di segnalazione fondamentali tra cui la regolazione della produzione metabolica e l'attivazione delle vie di morte mitocondriale-mediata delle cellule, che è stata esaminata in precedenza3. Per la regolazione metabolica, Ca2 + migliora l'attività di tre deidrogenasi localizzato matrice del ciclo dell'acido tricarbossilico, nonché complessi della catena respiratoria, per aumentare la produzione di energia mitocondriale4,5 . Con sovraccarico mitocondriale di Ca2 + e dysregulated mitocondriale Ca2 + movimentazione, transizione di permeabilità mitocondriale di Ca2 + trigger poro apertura (MPTP), che conduceva ad permeabilizzazione della membrana mitocondriale interna, perdita potenziale di membrana, la disfunzione mitocondriale, gonfiore, rottura e in ultima analisi, delle cellule morte6,7,8,9. Così, mitocondriale di Ca2 + segnalazione direttamente influisce sia vita cellulare e le vie di morte attraverso controllo metabolico e asse di MPTP-morte.
Negli ultimi anni, c'è stato rapidamente in espansione interesse per lo studio della mitocondriale Ca2 + dinamica dovuta in gran parte per l'identificazione dei costituenti molecolari del Ca2 + uniporter mitocondriale complesso, un'interna mitocondriale trasportatore di membrana che è una modalità primaria di Ca2 + importare nella matrice mitocondriale 10,11,12. Identificazione di queste subunità strutturali e regolamentari del uniporter ha portato avanti la possibilità di targeting geneticamente afflusso Ca2 + mitocondriale per modulare la funzione mitocondriale e disfunzione e facilitato lo studio della contributo dell'uniporter complesso e mitocondriale Ca2 + afflusso a malattia13,14,15. Infatti, Ca2 + segnalazione mitocondriale è stata implicata nelle patologie di una vasta gamma di malattie che variano dalla malattia cardiaca alla neurodegenerazione e cancro16,17,18, 19,20.
Data l'importanza fondamentale di mitocondriale Ca2 + segnalazione nella morte delle cellule e del metabolismo e combinata con la vasta portata dei sistemi biologici che mitocondriale di Ca2 + segnalazione impatti, metodi di valutazione mitocondriale Ca2 + afflusso sono di grande interesse. Non sorprendentemente, sono stati sviluppati una varietà di tecniche e strumenti per misurare mitocondriale Ca2 + . Questi includono metodi che utilizzano strumenti quali fluorescente Ca2 +-coloranti sensibili21,22 e geneticamente codificato Ca2 + sensori mirati ai mitocondri, come cameleon ed equorina23, 24. L'obiettivo di questo articolo è quello di evidenziare diversi metodi e sistemi di modello in cui mitocondriale Ca2 + l'assorbimento può essere misurato. Presentiamo due metodi sperimentali per valutare la capacità mitocondriale Ca2 + afflusso. Utilizzando i mitocondri cardiaci come esempio, dettagliamo una piattaforma basata su lettore di piastra per la misurazione mitocondriale Ca2 + assorbimento utilizzando il Ca2 + sensibili tinta del calcio verde-5N che è adatto idealmente per i mitocondri del tessuto isolato14 . Utilizzando cellule in coltura NIH 3T3, descriviamo anche un saggio di basati su formazione immagine di microscopia confocale per misura di mitocondriale Ca2 + in celle permeabilized utilizzando il Ca2 + sensibile colorante Rhod-2/AM25.

<table><tbody><tr><td>Olympus FV1000 Laser Scanning microscopio confocale</td><td>Olympus</td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td>Synergy Neo2 Lettore multimodale di micropiastre con iniettori</td><td>Biotek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Omogeneizzatore tissutale</td><td>Kimble</td><td>886000-0022</td><td></td></tr><tr><td>22 x 22 mm Vetrini coprioggetti</td><td>Corning</td><td>2850-22</td><td></td></tr><tr><td>Piastra a 96 pozzetti</td><td>Corning</td><td>3628</td><td></td></tr><tr><td>6 pozzetto</td><td>piastra Corning</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>Calcium Green-5N</td><td>Invitrogen</td><td>C3737</td><td></td></tr><tr><td>MitoTracker verde FM</td><td>Invitrogen</td><td>M7514</td><td></td></tr><tr><td>Rhod-2, AM</td><td>Invitrogen</td><td>R1244</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Invitrogen</td><td>D12345</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Invitrogen</td><td>P3000MP</td><td></td></tr><tr><td>D-Mannitol</td><td>Sigma</td><td>M9546</td><td></td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>EMD Millipore</td><td>8510</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E8145</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di potassio</td><td>Fisher</td><td>BP366-500</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato di potassio monobasico</td><td>Sigma</td><td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di magnesio</td><td>Sigma</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato di sodio</td><td>Sigma</td><td>P2256</td><td></td></tr><tr><td>Acido L-malico</td><td>Sigma</td><td>M1125</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di calcio</td><td>Sigma</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>Acetato di potassio</td><td>Fisher</td><td>BP364-500</td><td></td></tr><tr><td>Adenosina 5&prime;-trifosfato sale di magnesio</td><td>Sigma</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>Fosfocreatina sale disodico</td><td>Sigma</td><td>P7936</td><td></td></tr><tr><td>Saponina</td><td>Sigma</td><td>S7900</td><td></td></tr><tr><td>Ru360</td><td>Calbiochem</td><td>557440</td><td></td></tr></tbody></table>

analisi di afflusso del calcio mitocondriale in mitocondri isolati e cellule coltivate

Analyses of Mitochondrial Calcium Influx in Isolated Mitochondria and Cultured Cells

CA2 + gestione dai mitocondri è una funzione critica che regolano processi sia fisiologici e fisiopatologici in un ampio spettro di cellule. La capacità di misurare con precisione l'afflusso e l'efflusso di Ca2 + dai mitocondri è importante per determinare il ruolo di mitocondriale Ca2 + gestione in questi processi. In questo rapporto, presentiamo due metodi per la misura di mitocondriale Ca2 + gestione in mitocondri isolati sia in cellule coltivate. Dettagliamo in primo luogo una piattaforma di basata su lettore di piastra per la misurazione mitocondriale Ca2 + assorbimento utilizzando il Ca2 + colorante sensibile del calcio verde-5N. Il formato basato su lettore di piastra elude la necessità di attrezzature specializzate, e la tintura di calcio verde-5N è adatta idealmente per misura Ca2 + dai mitocondri del tessuto isolato. Per la nostra applicazione, descriviamo la misurazione del mitocondriale Ca2 + assorbimento in mitocondri isolati dal tessuto del cuore del mouse; Tuttavia, questa procedura può essere applicata per misurare mitocondriale Ca2 + assorbimento in mitocondri isolati da altri tessuti quali fegato, muscolo scheletrico e cervello. In secondo luogo, descriviamo un saggio basato su microscopia confocale per misura di mitocondriale Ca2 + in celle permeabilized utilizzando il Ca2 + sensibile colorante Rhod-2/AM e imaging utilizzando la microscopia a scansione laser 2-dimensionale. Questo protocollo di permeabilizzazione Elimina la contaminazione di tintura citosolico, consentendo la registrazione specifica di cambiamenti in mitocondriale Ca2 +. Inoltre, microscopia a scansione laser permette un'alta frequenza di catturare rapidi cambiamenti di mitocondriale Ca2 + in risposta a diversi farmaci o reagenti applicati nella soluzione esterna. Questo protocollo può essere applicato per misurare mitocondriale Ca2 + assorbimento in molti tipi cellulari tra cui cellule primarie quali miociti cardiaci e neuroni e linee cellulari immortalizzate.

La figura 1 Mostra mitocondriale Ca2 + misure di assorbimento in mitocondri cardiaci isolati utilizzando la piattaforma basata su lettore di piastra e il Ca2 + tingere del calcio verde-5N. In condizioni di controllo (Figura 1A), i mitocondri cardiaci erano sospese in tampone di KCl contenente calcio verde-5N e poi sfidati con impulsi sequenziali di CaCl2 (5 μL di soluzione di CaCl2 0,6 ...

Qui, presentiamo due protocolli per la misurazione dell'afflusso Ca2 + mitocondriale in mitocondri isolati e cellule coltivate. Per mitocondri isolati, dettagliamo un piatto basato su lettore Ca2 + importazione analisi usando il Ca2 + sensibili tingere del calcio verde-5N. Per le cellule coltivate, descriviamo un metodo di microscopia confocale utilizzando il Ca2 + colorante Rhod-2/AM.

Analisi di afflusso del calcio mitocondriale in mitocondri isolati e cellule coltivate

Ca2+ handling by mitochondria is a critical function regulating both physiological and pathophysiological processes in a broad spectrum of cells. The ...

L'obiettivo generale di questa procedura è misurare l'afflusso di calcio mitocondriale nei mitocondri isolati e nelle cellule in coltura. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della segnalazione del calcio, come il modo in cui i mitocondri aiutano a modellare il panorama citosolico del calcio e il ruolo della dinamica del calcio mitocondriale nelle condizioni di malattia. Il vantaggio principale di questa tecnica è che i nostri protocolli possono essere adattati a una varietà di sistemi modello per valutare la capacità di afflusso di calcio mitocondriale.Dimostrerò la procedura di assorbimento del calcio mitocondriale basata su un lettore di piastre. E il Dr. Joshua Maxwell, un istruttore del Dipartimento di Pediatria, dimostrerà la procedura basata sul microscopio confocale per misurare l'afflusso di calcio mitocondriale. Inizia questo esperimento risciacquando accuratamente il cuore precedentemente isolato in 25 millilitri di PBS ghiacciato one-X, assicurandoti che il sangue sia completamente spremuto dai ventricoli.In cinque millilitri di PBS ghiacciato, usando un paio di forbici affilate, tritare il tessuto cardiaco in piccoli pezzi. Scartare con cura il PBS e trasferire il fazzoletto in un omogeneizzatore di vetro Teflon Dounce da sette millilitri pre-raffreddato. Quindi, aggiungere cinque millilitri di tampone MSEGTA ghiacciato e omogeneizzare fino a quando non ci sono pezzi di tessuto visibili.Trasferire l'omogeneizzato in una provetta da 15 millilitri, quindi centrifugare a 600 volte G a quattro gradi Celsius per cinque minuti per pellettare i nuclei indesiderati e le cellule integre. Trasferire il surnatante in una provetta fresca da 15 millilitri e centrifugare a 10.000 volte G a quattro gradi Celsius per 10 minuti. Dopo aver scartato il surnatante, mantenere il pellet mitocondriale sul ghiaccio.Per lavare il pellet, aggiungere cinque millilitri di tampone MSEGTA ghiacciato, risospendere e centrifugare a 10.000 volte G a quattro gradi Celsius per 10 minuti. Dopo aver scartato il surnatante, ripetere il lavaggio e mantenere il pellet in ghiaccio. Per avviare la misurazione dell'assorbimento di calcio mitocondriale utilizzando un lettore di piastre, programmare il lettore in modo che esegua una lettura cinetica della florescenza del verde di calcio-5N ogni secondo per un tempo totale di 1.000 secondi.Programmare gli iniettori di reagenti per erogare cinque microlitri di soluzione di cloruro di calcio in vari punti temporali. Quindi, adescare gli iniettori con la soluzione di cloruro di calcio che verrà utilizzata. Successivamente, aggiungere 200 microgrammi di mitocondri isolati a un pozzetto di una piastra a 96 pozzetti e aggiungere il volume appropriato di tampone di cloruro di potassio per ottenere un volume totale di 197 microlitri.Quindi, aggiungere un microlitro di piruvato molare, un microlitro di malato da 500 millimolari e un microlitro di brodo di Calcium Green-5N da un millimolare e mescolare delicatamente pipettando. Incubare al riparo dalla luce a temperatura ambiente per due minuti affinché i mitocondri diventino energizzati. Infine, avviare il protocollo cinetico pre-programmato e monitorare la flessione del Calcium Green-5N.Per questa parte del protocollo, preparare la soluzione di lavoro Rhod-2 AM MitoTracker Green mescolando 20 microlitri di Rhod-2 AM, 0,2 microlitri di MitoTracker Green, 2,5 microlitri di F-127 pluronico al 20% e un millilitro di soluzione di Tyrode. Su un vetrino coprioggetti precedentemente preparato, placcato con cellule NIH/3T3, aggiungere la soluzione Rhod-2 AM MitoTracker Green goccia a goccia fino a coprirla. Affinché le celle si carichino con i coloranti, incubare il vetrino coprioggetti al riparo dalla luce per 30 minuti a temperatura ambiente.Per deesterificare Rhod-2 AM, rimuovere delicatamente la soluzione Rhod-2 AM MitoTracker Green e sostituirla con circa 300 microlitri di soluzione fresca di Tyrode per coprire le cellule. Incubare il vetrino coprioggetti al riparo dalla luce per 30 minuti a temperatura ambiente. A questo punto, trasferire il vetrino coprioggetti nella camera di imaging del microscopio e riempire la camera con la soluzione di lavaggio.Regola la messa a fuoco per osservare le celle e il contrasto di fase con un ingrandimento di 40X. Per permeabilizzare la membrana plasmatica delle celle caricate Rhod-2 AM MitoTracker Green, rimuovere la soluzione di lavaggio dal vetrino coprioggetti e sostituirla con circa 300 microlitri di soluzione di permeabilizzazione per coprire le cellule. Monitorare la morfologia della membrana plasmatica durante questo processo.Una volta permeabilizzate, le cellule svilupperanno una superficie ruvida. Rimuovere la soluzione di permeabilizzazione immediatamente dopo la completa permeabilizzazione e sostituirla con una soluzione interna a zero calcio. Successivamente, concentrarsi sulle cellule permeabilizzate che mostrano una chiara co-localizzazione di Rhod-2 e MitoTracker Green per visualizzare contemporaneamente la fioritura di Rhod-2 e Mitotracker Green.Quindi, diminuire il laser del microscopio e aumentare le impostazioni per rendere la florescenza mitocondriale Rhod-2 fioca e appena visibile. Per acquisire la cinetica delle variazioni mitocondriali del calcio, selezionare le impostazioni del microscopio per acquisire scansioni bidimensionali a una frequenza di fotogrammi e un andamento temporale appropriati. Rimuovere la soluzione interna a zero calcio facendo attenzione a non disturbare le cellule e la messa a fuoco del microscopio, quindi avviare l'acquisizione dell'immagine.Utilizzando una siringa, aggiungere manualmente una soluzione interna ricca di calcio al punto temporale di 10 secondi. Infine, nel software di acquisizione delle immagini, selezionare le regioni di interesse per comprendere le regioni di co-localizzazione del segnale Rhod-2 e MitoTracker Green. Quando il cloruro di calcio viene aggiunto ai mitocondri cardiaci isolati, la fioritura dal colorante di calcio aumenta man mano che i mitocondri assorbono il calcio dalla florescenza tampone.Tuttavia, alla terza edizione del calcio, la florescenza inizia improvvisamente ad aumentare dopo un calo che indica un sovraccarico di calcio mitocondriale e l'apertura dei pori di transizione della permeabilità mitocondriale che può portare alla permeabilizzazione della membrana interna mitocondriale. D'altra parte, quando i mitocondri sono pretrattati con un inibitore dell'assorbimento mitocondriale del calcio, c'è un aumento della fioritura dopo ogni aggiunta di calcio. Nelle cellule NIH/3T3 in coltura, la rete mitocondriale viene colorata con il colorante MitoTracker Green.Le cellule vengono anche colorate con il colorante Rhod-2 e dopo la permeabililizzazione della saponina, il Rhod-2 citosolico viene lavato via lasciando solo la colorazione mitocondriale che co-localizza con il MitoTracker. Poiché Rhod-2 può accumularsi in strutture non mitocondriali, l'analisi dovrebbe concentrarsi solo sulle regioni in cui MitoTracker e Rhod-2 co-localizzano. L'aggiunta di calcio provoca un aumento della florescenza Rhod-2 nelle cellule di controllo, mentre nelle cellule trattate con l'inibitore dell'assorbimento mitocondriale del calcio, non vi è alcun cambiamento nella florescenza.Questi protocolli possono essere applicati per misurare l'assorbimento mitocondriale di calcio in molti tipi di cellule, comprese le cellule primarie come i miociti cardiaci e i neuroni in linee cellulari immortalizzate, nonché i mitocondri isolati da molti tipi di tessuto tra cui cuore, fegato e cervello. La gestione del calcio da parte dei mitocondri è una funzione critica che regola i processi fisiologici e fisiopatologici in diverse cellule. La capacità di misurare con precisione l'afflusso di calcio dai mitocondri è una parte importante per determinare il ruolo della manipolazione del calcio mitocondriale in questi processi.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come misurare l'afflusso di calcio mitocondriale nei mitocondri isolati e nelle cellule in coltura.

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Monitoraggio Cambiamenti dei livelli di calcio mitocondriale durante l&#39;apoptosi mediante un sensore di calcio geneticamente codificato

Un protocollo spettrofluorimetrico per la misura della permeabilità mitocondriale apertura dei pori di transizione nel cuore topo mitocondri isolati è presentato qui. Il test prevede la misurazione simultanea dei mitocondri...

Multi-parametro di misura della apertura dei pori di transizione di permeabilità nel Cuore mouse mitocondri isolati

Questo video descrive un test basato su un lettore di piastre per misurare l'assorbimento di calcio mitocondriale in mitocondri isolati. Il test analizza il segnale di fluorescenza di un colorante fluorescente sensibile al calcio per studiare la cinetica dell'assorbimento mitocondriale del calcio e del sovraccarico di calcio.

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Questo video descrive un test basato sull'imaging al microscopio confocale per misurare l'assorbimento di calcio mitocondriale nelle cellule in coltura. Il test utilizza il colorante fluorescente sensibile al calcio Rhod-2/AM per misurare il calcio mitocondriale in cellule coltivate permeabilizzate.

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Scopri come misurare l'afflusso di calcio mitocondriale in mitocondri isolati e cellule coltivate utilizzando saggi con plate reader e microscopia confocale. Questi metodi aiutano a studiare la segnalazione del calcio e le dinamiche mitocondriali nelle malattie.

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