Name: Analisi di afflusso del calcio mitocondriale in mitocondri isolati e cellule coltivate (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-27T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: Scopri come misurare l'afflusso di calcio mitocondriale in mitocondri isolati e cellule coltivate utilizzando saggi con plate reader e microscopia confocale. Questi metodi aiutano a studiare la segnalazione del calcio e le dinamiche mitocondriali nelle malattie.

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Questo lavoro è stato supportato da concedere finanziamenti dall'associazione americana di cuore (J.Q.K.).

Tutti i metodi descritti in questo protocollo sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e uso Comitato della Emory University.
Nota: La prima parte è la procedura sperimentale per la misura di afflusso Ca2 + mitocondriale in mitocondri cardiaci isolati utilizzando un lettore di piastra.
1. reagenti e soluzioni
<ol><li>Fare 500 mL di tampone di MS-EGTA per isolamento mitocondriale: 225 mM mannitolo, saccarosio di 75 mM, 5 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acido (HEPES), 1 mM glicole etilenico-bis(β-aminoethyl ether)-N, N, N', N'-acido etilendiamminotetraacetico (EGTA), pH regolato a 7,4 con KOH. Sterilizzarlo attraverso un filtro di 0,22 μm e conservarla a 4 ° C. Assicurarsi che il buffer di MS-EGTA è pre-refrigerato a 4 ° C prima dell'uso.</li>
	<li>Preparare 100 mL di tampone di KCl: 125 mM KCl, 20 mM HEPES, 1mm KH2PO4, 2mm MgCl2, 40 μM EGTA e pH regolato a 7,2 con KOH. Conservare a temperatura ambiente.</li>
	<li>Preparare calcio 1 mM verde-5N stock in dimetilsolfossido (DMSO). Lo stock di verde-5N di calcio può essere aliquotato e conservato a-20 ° C.</li>
	<li>
Preparare substrati per Ca2 + l'assorbimento.
	<ol>
<li>Preparare il piruvato di sodio 1 M, pH 7,4. Conservarlo in aliquote a-20 ° C.</li>
		<li>Preparare malate di 500 mM, pH 7.4. Conservarlo in aliquote a-20 ° C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. isolamento dei mitocondri cardiaci
<ol><li>Eutanasia il mouse secondo le norme istituzionali. Nota: Per il nostro metodo approvato dall'istituzione dell'eutanasia, topi erano anestetizzati per inalazione isofluorano e sacrificati dalla dislocazione cervicale.</li>
	<li>Raccogliere il cuore di cavità toracica di apertura, taglio lungo entrambi i lati delle nervature, che fiancheggiano il cuore, tagliando via il diaframma e asportando il tessuto del cuore. Nota: In questo protocollo, isolamento mitocondriale viene eseguita da un cuore intero raccolto da un topo adulto (circa 120 mg), che dovrebbe essere sufficiente per 3-4 esperimenti. Per l'isolamento mitocondriale da altri tessuti ricchi di mitocondri quali il fegato, fino a 200 mg di tessuto può essere utilizzato seguendo il protocollo descritto.</li>
	<li>Sciacquare il tessuto accuratamente in 25 mL di gelida 1x tamponato fosfato salino (PBS) assicurando che tutto il sangue viene spremuto fuori i ventricoli. Nota: Il cuore viene risciacquato sufficientemente quando il liquido spremuto fuori dal cuore esce pulito.</li>
	<li>Tritare il cuore in piccoli pezzi in 5 mL di PBS 1X ghiacciata usando un paio di forbici affilate.</li>
	<li>Scartare il PBS e trasferimento di tessuto cardiaco macinate in un omogeneizzatore di lisata pre-refrigerati 7 mL vetro-teflon con una clearance di 0,10 a 0,15 mm.</li>
	<li>Aggiungere 5 mL di buffer di MS-EGTA ghiacciata e omogeneizzare il campione fino a pezzi di tessuto non sono più visibili (circa 11 colpi). Nota: Non over-omogeneizzare il tessuto come l'obiettivo è quello di ottenere i mitocondri intatti e funzionali.</li>
	<li>Trasferire l'omogeneizzato in una provetta da 15 mL.</li>
	<li>Centrifugare l'omogeneizzato a 600 x g a 4 ° C per 5 min a pellet di nuclei e cellule ininterrotte.</li>
	<li>Trasferire il surnatante in una provetta di fresco da 15 mL e centrifugare esso a 10.000 x g a 4 ° C per 10 min a pellet mitocondri.</li>
	<li>Scartare il surnatante e tenere il pellet mitocondriale sul ghiaccio.</li>
	<li>Lavare la pallina mitocondriale utilizzando due volte ghiacciata MS-EGTA buffer. Per ogni lavaggio, risospendere il pellet mitocondriale in 5 mL di buffer di MS-EGTA, centrifugare e a 10.000 x g a 4 ° C per 10 min e scartare il surnatante.</li>
	<li>Dopo il lavaggio finale, scartare il surnatante e risospendere i mitocondri in 100 μL di tampone di MS-EGTA freddo di ghiaccio. Tenere i mitocondri sul ghiaccio. Nota: I mitocondri devono essere utilizzati per la sperimentazione entro 1 h.</li>
	<li>Misurare la concentrazione di proteina mitocondriale utilizzando un' analisi della proteina di Bradford26.</li>
</ol>3. piastra lettore-basato di misurazione dell'assorbimento del calcio mitocondriale
Nota: Qui è descritto il protocollo per l'analisi mitocondriale Ca2 + assorbimento utilizzando un lettore di piastra multimodo dotato di iniettori. Qualsiasi piatto lettore con la capacità di lettura di fluorescenza verde-5N calcio (eccitazione/emissione di 506/532 nm) in modalità cinetica con reagente automatizzato possono essere utilizzati iniettori per mantenere la reazione al riparo dalla luce.
<ol><li>Programma lettore della piastra per eseguire una cinetica leggere di fluorescenza verde-5N calcio con misurazioni effettuate ogni secondo per un tempo di dosaggio totale di 1.000 s. Inoltre, programmare gli iniettori di reagente a dispensare 5 μL di soluzione di CaCl2 ore 30 s, 150 s, 300 s , 480 s e 690 punti di tempo s. Nota: I tempi di CaCl2 iniezioni sono definiti dall'utente e possono essere adattate per esigenze sperimentali.</li>
	<li>Adescare gli iniettori di reagente con la soluzione di CaCl2 deve essere utilizzato. Nota: La concentrazione della soluzione CaCl2 è definito dall'utente e può essere registrata in esecuzioni successive a titolare la quantità di Ca2 + per attivare MPTP apertura necessaria.</li>
	<li>Aggiungere 200 μg di mitocondri in un individuale pozzetto di una piastra ben 96.</li>
	<li>Aggiungere il volume appropriato di buffer di KCl tale che il volume totale dei mitocondri e buffer di KCl nasce a 197 μL.</li>
	<li>Aggiungere 1 μL di piruvato di 1 M e 1 μL di malate di 500 mM per la miscela di mitocondri. Pipettare delicatamente per mescolare e incubare i mitocondri con i substrati per 2 min a temperatura ambiente per consentire i mitocondri diventare stimolato.</li>
	<li>Aggiungere 1 μL di stock di 1mm del calcio verde-5N. Mescolare delicatamente pipettando. Nota: Proteggere la reazione dalla luce dopo l'aggiunta del colorante verde-5N calcio.</li>
	<li>Avviare il pre-programmati cinetica protocollo e monitor del calcio verde-5N fluorescenza.</li>
</ol>4. reagenti e soluzioni
Nota: La seconda parte è una procedura sperimentale per l'imaging confocale di mitocondriale Ca2 + in cellule coltivate
<ol><li>Rendere la soluzione di Tyrode (130 mM NaCl, 4 mM KCl, 2mm CaCl2, 1mm MgCl2, 10 millimetri di glucosio e 10 mM HEPES, pH di 7,2 con KOH). Conservare a 4 ° C. Scaldare a temperatura ambiente prima dell'uso.</li>
	<li>Preparare la soluzione di lavaggio (acetato di potassio di 100 mM, 15 mM KCl, 5mm KH2PO4, 5mm Mg-ATP, 0,35 mM EGTA, 0,12 mM CaCl2, 0.75 mM MgCl2, fosfocreatina di 10 mM, 10 mM HEPES, pH di 7,2 con KOH). Conservare a 4 ° C. Scaldare a temperatura ambiente prima dell'uso.</li>
	<li>Preparare la soluzione di permeabilizzazione, che contiene saponina 0,005% in soluzione di lavaggio. Prepararlo fresco ogni giorno.</li>
	<li>Preparare 0 Ca2 + soluzione interna (100mm potassio acetato, 15 mM KCl, 0,35 mM EGTA, 0,75 mM MgCl2, 10 mM HEPES, pH regolato a 7,2 con KOH). Conservare a 4 ° C. Scaldare a temperatura ambiente prima dell'uso.</li>
	<li>Preparare soluzione interna contenente Ca2 +. Aggiungere CaCl2 per la soluzione interna sopra per raggiungere la concentrazione di Ca libero2 +desiderata. La quantità di CaCl2 per aggiungere viene calcolata utilizzando il programma MaxChelator (maxchelator.stanford.edu).</li>
	<li>Preparare 1 mM Rhod-2/AM brodo in DMSO e conservare a-20 ° C fino all'utilizzo.</li>
	<li>Preparare 1 mM MitoTracker brodo verde in DMSO e conservare a-20 ° C fino all'utilizzo.</li>
</ol>5. placcatura cellule per l'Imaging
<ol><li>22x22 cm2 vetrini coprioggetti con etanolo al 100% di lavare e asciugare i vetrini coprioggetto per aria.</li>
	<li>Posizionare i vetrini coprioggetti in singoli pozzetti di una piastra di coltura del tessuto 6 pozzetti. Nota: Le lamelle possono essere rivestite con laminina, poli-L-lisina o simile matrice per promuovere l'adesione delle cellule.</li>
	<li>Tripsinizzano e le cellule sul lamelle che mira per circa il 70% confluenza il giorno dell'imaging della lastra.</li>
</ol>6. caricamento di cellule con il Rhod-2/AM e MitoTracker Green
<ol><li>Preparare Rhod-2/AM-MitoTracker verde soluzione di lavoro. Aggiungere 20 μL di Rhod-2/AM 1 mM stock, 0,2 μL di Stock in MitoTracker verde 1 mM e 2,5 μL di 20% pluronic F-127 a 1 mL di soluzione di Tyrode. La concentrazione finale di Rhod-2 della soluzione di lavoro è di 20 µM e la concentrazione finale di MitoTracker green è di 200 nM.</li>
	<li>Rimuovere delicatamente il supporto di crescita dal vetrino coprioggetti. Nota: Un passaggio di lavaggio non è necessario prima dell'aggiunta di soluzione colorante.</li>
	<li>Aggiungere il Rhod-2/AM-MitoTracker soluzione verde in modo goccia a goccia sul coprioggetto finché il coprioggetto è appena coperto (circa 3-4 gocce al vetrino coprioggetti).</li>
	<li>Incubare per 30 min a temperatura ambiente al riparo dalla luce per permettere alle cellule di carico con i coloranti.</li>
	<li>De-esterificare il Rhod-2am. Rimuovere delicatamente il Rhod-2/AM-MitoTracker soluzione verde e sostituirlo con soluzione di Tyrode fresca temperatura ambiente Incubare 30 min a temperatura ambiente al riparo dalla luce.</li>
</ol>7. confocale Imaging del mitocondriale Rhod-2am e fluorescenza MitoTracker Green
<ol><li>Trasferire il coprioggetto al microscopio imaging camera e riempire la camera con soluzione di lavaggio.</li>
	<li>In impostazioni per l'osservazione di cellule in contrasto di fase a 40x, regolare la messa a fuoco fino a quando le cellule sono visibili e messo a fuoco.</li>
	<li>
Permeabilize membrana plasmatica di Rhod-2/AM-MitoTracker verde caricato celle per rimuovere localizzato cytosol Rhod-2, pur mantenendo la tintura localizzato i mitocondri.
	<ol>
<li>Rimuovere la soluzione di lavaggio dal vetrino coprioggetti.</li>
		<li>Sostituirlo con soluzione di permeabilizzazione per circa 1 min.</li>
		<li>Controllare visivamente la morfologia di membrana plasmatica durante tutto il processo di permeabilizzazione. Celle permeabilized svilupperà una superficie ruvida.</li>
		<li>Quando permeabilizzazione è completa, immediatamente rimuovere la soluzione di permeabilizzazione e sostituirlo con 0 Ca2 + soluzione interna.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Allo stesso tempo immagine Rhod-2 fluorescenza (eccitazione utilizzando la linea laser nm e l'emissione raccolti a lunghezze d'onda tra 575-675 nm 559) e MitoTracker verde fluorescenza (eccitazione utilizzando la linea laser 488nm e l'emissione raccolti a lunghezze d'onda tra 505-525 nm). Concentrarsi su celle permeabilized visualizzati da un chiaro colocalizzazione di Rhod-2 e MitoTracker verde.</li>
	<li>Diminuire il laser di microscopio e impostazioni di guadagno tale che la fluorescenza Rhod-2 mitocondriale è fioca e appena visibile.</li>
	<li>Selezionare impostazioni di microscopio di acquisire scansioni 2-dimensionale di un corso di tasso e tempo di frame appropriato per la specifica applicazione. Un frame rate di almeno 30 fotogrammi/s è consigliato per acquisire con precisione la cinetica dei cambiamenti in mitocondriale Ca2 +.</li>
	<li>Rimuovere la Ca 02 + soluzione interna senza disturbare le celle o la messa a fuoco del microscopio.</li>
	<li>Avviare l'acquisizione di immagini.</li>
	<li>Aggiungere Ca2 +-soluzione interna piena al momento s 10 punto manualmente o con un sistema di perfusione.</li>
	<li>Selezionare le regioni di interesse (ROI) per comprendere le regioni di colocalizzazione tra mitocondriale Rhod-2 e MitoTracker verde segnale del software di acquisizione immagine. Nota: Per ogni ROI vengono ottenuti i valori di fluorescenza arbitrario (F) per ogni punto di tempo della registrazione. Questi valori sono sfondo sottratto e normalizzato per la fluorescenza iniziale (prima del Ca2 + aggiunta; F0) e tracciate come F/F0 nel corso del tempo per la presentazione dei dati e la quantificazione dell'ampiezza del cambiamento di mitocondriale Ca2 +.</li>
</ol>

<ol><li>Deluca, H. F., Engstrom, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+uptake+by+rat+kidney+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Calcium uptake by rat kidney mitochondria.</a> P Natl Acad Sci USA. 47, 1744-1750 (1961).</li>
<li>Lehninger, A. L., Rossi, C. S., Greenawalt, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiration-dependent+accumulation+of+inorganic+phosphate+and+Ca+ions+by+rat+liver+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Co%22%5BJournal%5D)">Respiration-dependent accumulation of inorganic phosphate and Ca ions by rat liver mitochondria.</a> Biochem Biophys Res Co. 10, 444-448 (1963).</li>
<li>Kwong, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial+calcium+uniporter+in+the+heart%3A+energetics+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial calcium uniporter in the heart: energetics and beyond.</a> J Physiol. 595 (12), 3743-3751 (2017).</li>
<li>Denton, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+mitochondrial+dehydrogenases+by+calcium+ions%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Regulation of mitochondrial dehydrogenases by calcium ions.</a> Biochim Biophys Acta. 1787 (11), 1309-1316 (2009).</li>
<li>Jouaville, L. S., Pinton, P., Bastianutto, C., Rutter, G. A., Rizzuto, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+mitochondrial+ATP+synthesis+by+calcium%3A+evidence+for+a+long-term+metabolic+priming%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Regulation of mitochondrial ATP synthesis by calcium: evidence for a long-term metabolic priming.</a> P Natl Acad Sci USA. 96 (24), 13807-13812 (1999).</li>
<li>Haworth, R. A., Hunter, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ca2%2B-induced+membrane+transition+in+mitochondria.+II.+Nature+of+the+Ca2%2B+trigger+site%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">The Ca2+-induced membrane transition in mitochondria. II. Nature of the Ca2+ trigger site.</a> Arch Biochem Biophys. 195 (2), 460-467 (1979).</li>
<li>Hunter, D. R., Haworth, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ca2%2B-induced+membrane+transition+in+mitochondria.+I.+The+protective+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">The Ca2+-induced membrane transition in mitochondria. I. The protective mechanisms.</a> Arch Biochem Biophys. 195 (2), 453-459 (1979).</li>
<li>Kwong, J. Q., Molkentin, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+and+pathological+roles+of+the+mitochondrial+permeability+transition+pore+in+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Physiological and pathological roles of the mitochondrial permeability transition pore in the heart.</a> Cell Metab. 21 (2), 206-214 (2015).</li>
<li>Luongo, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial+Na%2B%2FCa2%2B+exchanger+is+essential+for+Ca2%2B+homeostasis+and+viability%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial Na+/Ca2+ exchanger is essential for Ca2+ homeostasis and viability.</a> Nature. 545 (7652), 93-97 (2017).</li>
<li>De Stefani, D., Patron, M., Rizzuto, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+the+mitochondrial+calcium+uniporter+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Structure and function of the mitochondrial calcium uniporter complex.</a> Biochim Biophys Acta. 1853 (9), 2006-2011 (2015).</li>
<li>Baughman, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+genomics+identifies+MCU+as+an+essential+component+of+the+mitochondrial+calcium+uniporter%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Integrative genomics identifies MCU as an essential component of the mitochondrial calcium uniporter.</a> Nature. 476 (7360), 341-345 (2011).</li>
<li>De Stefani, D., Raffaello, A., Teardo, E., Szabo, I., Rizzuto, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+forty-kilodalton+protein+of+the+inner+membrane+is+the+mitochondrial+calcium+uniporter%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A forty-kilodalton protein of the inner membrane is the mitochondrial calcium uniporter.</a> Nature. 476 (7360), 336-340 (2011).</li>
<li>Pan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+physiological+role+of+mitochondrial+calcium+revealed+by+mice+lacking+the+mitochondrial+calcium+uniporter%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The physiological role of mitochondrial calcium revealed by mice lacking the mitochondrial calcium uniporter.</a> Nat Cell Biol. 15 (12), 1464-1472 (2013).</li>
<li>Kwong, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Mitochondrial+Calcium+Uniporter+Selectively+Matches+Metabolic+Output+to+Acute+Contractile+Stress+in+the+Heart%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">The Mitochondrial Calcium Uniporter Selectively Matches Metabolic Output to Acute Contractile Stress in the Heart.</a> Cell Rep. 12 (1), 15-22 (2015).</li>
<li>Luongo, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Mitochondrial+Calcium+Uniporter+Matches+Energetic+Supply+with+Cardiac+Workload+during+Stress+and+Modulates+Permeability+Transition%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">The Mitochondrial Calcium Uniporter Matches Energetic Supply with Cardiac Workload during Stress and Modulates Permeability Transition.</a> Cell Rep. 12 (1), 23-34 (2015).</li>
<li>Brown, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expert+consensus+document%3A+Mitochondrial+function+as+a+therapeutic+target+in+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Expert consensus document: Mitochondrial function as a therapeutic target in heart failure.</a> Nat Rev Cardiol. 14 (4), 238-250 (2017).</li>
<li>Logan, C. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss-of-function+mutations+in+MICU1+cause+a+brain+and+muscle+disorder+linked+to+primary+alterations+in+mitochondrial+calcium+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Loss-of-function mutations in MICU1 cause a brain and muscle disorder linked to primary alterations in mitochondrial calcium signaling.</a> Nat Genet. 46 (2), 188-193 (2014).</li>
<li>Lewis-Smith, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homozygous+deletion+in+MICU1+presenting+with+fatigue+and+lethargy+in+childhood%5BTitle%5D)+AND+%22Neurol+Genet%22%5BJournal%5D)">Homozygous deletion in MICU1 presenting with fatigue and lethargy in childhood.</a> Neurol Genet. 2 (2), e59(2016).</li>
<li>Tosatto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial+calcium+uniporter+regulates+breast+cancer+progression+via+HIF-1alpha%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial calcium uniporter regulates breast cancer progression via HIF-1alpha.</a> EMBO Mol Med. 8 (5), 569-585 (2016).</li>
<li>Cardenas, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+Vulnerability+of+Cancer+Cells+by+Inhibition+of+Ca%282%2B%29+Transfer+from+Endoplasmic+Reticulum+to+Mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Selective Vulnerability of Cancer Cells by Inhibition of Ca(2+) Transfer from Endoplasmic Reticulum to Mitochondria.</a> Cell Rep. 15 (1), 219-220 (2016).</li>
<li>Dedkova, E. N., Blatter, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signaling+in+cardiac+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Calcium signaling in cardiac mitochondria.</a> J Mol Cell Cardiol. 58, 125-133 (2013).</li>
<li>Florea, S. M., Blatter, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+mitochondria+for+the+regulation+of+cardiac+alternans%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Physiol%22%5BJournal%5D)">The role of mitochondria for the regulation of cardiac alternans.</a> Front Physiol. 1, 141(2010).</li>
<li>Palmer, A. E., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+calcium+signaling+using+genetically+targetable+fluorescent+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Measuring calcium signaling using genetically targetable fluorescent indicators.</a> Nat Protoc. 1 (3), 1057-1065 (2006).</li>
<li>Bonora, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+calcium+measurements+in+mammalian+cells+using+jellyfish+photoprotein+aequorin-based+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Subcellular calcium measurements in mammalian cells using jellyfish photoprotein aequorin-based probes.</a> Nat Protoc. 8 (11), 2105-2118 (2013).</li>
<li>Zima, A. V., Kockskamper, J., Mejia-Alvarez, R., Blatter, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyruvate+modulates+cardiac+sarcoplasmic+reticulum+Ca2%2B+release+in+rats+via+mitochondria-dependent+and+-independent+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Pyruvate modulates cardiac sarcoplasmic reticulum Ca2+ release in rats via mitochondria-dependent and -independent mechanisms.</a> J Physiol. 550 (Pt 3), 765-783 (2003).</li>
<li>Kruger, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Bradford+method+for+protein+quantitation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The Bradford method for protein quantitation.</a> Methods Mol Biol. 32, 9-15 (1994).</li>
<li>Zazueta, C., Sosa-Torres, M. E., Correa, F., Garza-Ortiz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitory+properties+of+ruthenium+amine+complexes+on+mitochondrial+calcium+uptake%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bioenerg+Biomembr%22%5BJournal%5D)">Inhibitory properties of ruthenium amine complexes on mitochondrial calcium uptake.</a> J Bioenerg Biomembr. 31 (6), 551-557 (1999).</li>
<li>Davidson, S. M., Duchen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+mitochondrial+calcium+signalling+with+fluorescent+probes+and+single+or+two+photon+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging mitochondrial calcium signalling with fluorescent probes and single or two photon confocal microscopy.</a> Methods Mol Biol. 810, 219-234 (2012).</li>
<li>Matlib, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen-bridged+dinuclear+ruthenium+amine+complex+specifically+inhibits+Ca2%2B+uptake+into+mitochondria+in+vitro+and+in+situ+in+single+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Oxygen-bridged dinuclear ruthenium amine complex specifically inhibits Ca2+ uptake into mitochondria in vitro and in situ in single cardiac myocytes.</a> J Biol Chem. 273 (17), 10223-10231 (1998).</li>
<li>Chamberlain, B. K., Volpe, P., Fleischer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+calcium-induced+calcium+release+from+purified+cardiac+sarcoplasmic+reticulum+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Inhibition of calcium-induced calcium release from purified cardiac sarcoplasmic reticulum vesicles.</a> J Biol Chem. 259 (12), 7547-7553 (1984).</li>
</ol>

Gli autori non hanno alcuna informativa al rapporto.

Qui, descriviamo due diversi approcci per misurare mitocondriale afflusso di Ca2 + . La piastra lettore-basato del calcio verde-5N Metodo Monitor extramitochondrial Ca2 + livelli ed è una Ca2 + analisi di assorbimento che è ben adatta per le misurazioni in mitocondri isolati. Mentre abbiamo dimostrato risultati rappresentativi da mitocondri cardiaci murini isolati, questo test può essere facilmente adattato per i mitocondri isolati dai tessuti con alta abbondanza mitocondriale compreso fe...

I mitocondri sono siti critici di intracellulare Ca2 + deposito e segnalazione. Decenni di ricerche hanno dimostrato che i mitocondri hanno la capacità di importare e sequestrare il Ca2 + 1,2. Mitocondri, tuttavia, non sono meramente passive siti diCa 2 + storage. CA2 + presso il compartimento mitocondriale svolge funzioni di segnalazione fondamentali tra cui la regolazione della produzione metabolica e l'attivazione delle vie di morte mitocondriale-mediata delle cellule, che è stata esaminata in precedenza3. Per la regolazione metabolica, Ca2 + migliora l'attività di tre deidrogenasi localizzato matrice del ciclo dell'acido tricarbossilico, nonché complessi della catena respiratoria, per aumentare la produzione di energia mitocondriale4,5 . Con sovraccarico mitocondriale di Ca2 + e dysregulated mitocondriale Ca2 + movimentazione, transizione di permeabilità mitocondriale di Ca2 + trigger poro apertura (MPTP), che conduceva ad permeabilizzazione della membrana mitocondriale interna, perdita potenziale di membrana, la disfunzione mitocondriale, gonfiore, rottura e in ultima analisi, delle cellule morte6,7,8,9. Così, mitocondriale di Ca2 + segnalazione direttamente influisce sia vita cellulare e le vie di morte attraverso controllo metabolico e asse di MPTP-morte.
Negli ultimi anni, c'è stato rapidamente in espansione interesse per lo studio della mitocondriale Ca2 + dinamica dovuta in gran parte per l'identificazione dei costituenti molecolari del Ca2 + uniporter mitocondriale complesso, un'interna mitocondriale trasportatore di membrana che è una modalità primaria di Ca2 + importare nella matrice mitocondriale 10,11,12. Identificazione di queste subunità strutturali e regolamentari del uniporter ha portato avanti la possibilità di targeting geneticamente afflusso Ca2 + mitocondriale per modulare la funzione mitocondriale e disfunzione e facilitato lo studio della contributo dell'uniporter complesso e mitocondriale Ca2 + afflusso a malattia13,14,15. Infatti, Ca2 + segnalazione mitocondriale è stata implicata nelle patologie di una vasta gamma di malattie che variano dalla malattia cardiaca alla neurodegenerazione e cancro16,17,18, 19,20.
Data l'importanza fondamentale di mitocondriale Ca2 + segnalazione nella morte delle cellule e del metabolismo e combinata con la vasta portata dei sistemi biologici che mitocondriale di Ca2 + segnalazione impatti, metodi di valutazione mitocondriale Ca2 + afflusso sono di grande interesse. Non sorprendentemente, sono stati sviluppati una varietà di tecniche e strumenti per misurare mitocondriale Ca2 + . Questi includono metodi che utilizzano strumenti quali fluorescente Ca2 +-coloranti sensibili21,22 e geneticamente codificato Ca2 + sensori mirati ai mitocondri, come cameleon ed equorina23, 24. L'obiettivo di questo articolo è quello di evidenziare diversi metodi e sistemi di modello in cui mitocondriale Ca2 + l'assorbimento può essere misurato. Presentiamo due metodi sperimentali per valutare la capacità mitocondriale Ca2 + afflusso. Utilizzando i mitocondri cardiaci come esempio, dettagliamo una piattaforma basata su lettore di piastra per la misurazione mitocondriale Ca2 + assorbimento utilizzando il Ca2 + sensibili tinta del calcio verde-5N che è adatto idealmente per i mitocondri del tessuto isolato14 . Utilizzando cellule in coltura NIH 3T3, descriviamo anche un saggio di basati su formazione immagine di microscopia confocale per misura di mitocondriale Ca2 + in celle permeabilized utilizzando il Ca2 + sensibile colorante Rhod-2/AM25.

<table><tbody><tr><td>Olympus FV1000 Laser Scanning microscopio confocale</td><td>Olympus</td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td>Synergy Neo2 Lettore multimodale di micropiastre con iniettori</td><td>Biotek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Omogeneizzatore tissutale</td><td>Kimble</td><td>886000-0022</td><td></td></tr><tr><td>22 x 22 mm Vetrini coprioggetti</td><td>Corning</td><td>2850-22</td><td></td></tr><tr><td>Piastra a 96 pozzetti</td><td>Corning</td><td>3628</td><td></td></tr><tr><td>6 pozzetto</td><td>piastra Corning</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>Calcium Green-5N</td><td>Invitrogen</td><td>C3737</td><td></td></tr><tr><td>MitoTracker verde FM</td><td>Invitrogen</td><td>M7514</td><td></td></tr><tr><td>Rhod-2, AM</td><td>Invitrogen</td><td>R1244</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Invitrogen</td><td>D12345</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Invitrogen</td><td>P3000MP</td><td></td></tr><tr><td>D-Mannitol</td><td>Sigma</td><td>M9546</td><td></td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>EMD Millipore</td><td>8510</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E8145</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di potassio</td><td>Fisher</td><td>BP366-500</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato di potassio monobasico</td><td>Sigma</td><td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di magnesio</td><td>Sigma</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato di sodio</td><td>Sigma</td><td>P2256</td><td></td></tr><tr><td>Acido L-malico</td><td>Sigma</td><td>M1125</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di calcio</td><td>Sigma</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>Acetato di potassio</td><td>Fisher</td><td>BP364-500</td><td></td></tr><tr><td>Adenosina 5&prime;-trifosfato sale di magnesio</td><td>Sigma</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>Fosfocreatina sale disodico</td><td>Sigma</td><td>P7936</td><td></td></tr><tr><td>Saponina</td><td>Sigma</td><td>S7900</td><td></td></tr><tr><td>Ru360</td><td>Calbiochem</td><td>557440</td><td></td></tr></tbody></table>

analisi di afflusso del calcio mitocondriale in mitocondri isolati e cellule coltivate

Analyses of Mitochondrial Calcium Influx in Isolated Mitochondria and Cultured Cells

CA2 + gestione dai mitocondri è una funzione critica che regolano processi sia fisiologici e fisiopatologici in un ampio spettro di cellule. La capacità di misurare con precisione l'afflusso e l'efflusso di Ca2 + dai mitocondri è importante per determinare il ruolo di mitocondriale Ca2 + gestione in questi processi. In questo rapporto, presentiamo due metodi per la misura di mitocondriale Ca2 + gestione in mitocondri isolati sia in cellule coltivate. Dettagliamo in primo luogo una piattaforma di basata su lettore di piastra per la misurazione mitocondriale Ca2 + assorbimento utilizzando il Ca2 + colorante sensibile del calcio verde-5N. Il formato basato su lettore di piastra elude la necessità di attrezzature specializzate, e la tintura di calcio verde-5N è adatta idealmente per misura Ca2 + dai mitocondri del tessuto isolato. Per la nostra applicazione, descriviamo la misurazione del mitocondriale Ca2 + assorbimento in mitocondri isolati dal tessuto del cuore del mouse; Tuttavia, questa procedura può essere applicata per misurare mitocondriale Ca2 + assorbimento in mitocondri isolati da altri tessuti quali fegato, muscolo scheletrico e cervello. In secondo luogo, descriviamo un saggio basato su microscopia confocale per misura di mitocondriale Ca2 + in celle permeabilized utilizzando il Ca2 + sensibile colorante Rhod-2/AM e imaging utilizzando la microscopia a scansione laser 2-dimensionale. Questo protocollo di permeabilizzazione Elimina la contaminazione di tintura citosolico, consentendo la registrazione specifica di cambiamenti in mitocondriale Ca2 +. Inoltre, microscopia a scansione laser permette un'alta frequenza di catturare rapidi cambiamenti di mitocondriale Ca2 + in risposta a diversi farmaci o reagenti applicati nella soluzione esterna. Questo protocollo può essere applicato per misurare mitocondriale Ca2 + assorbimento in molti tipi cellulari tra cui cellule primarie quali miociti cardiaci e neuroni e linee cellulari immortalizzate.

La figura 1 Mostra mitocondriale Ca2 + misure di assorbimento in mitocondri cardiaci isolati utilizzando la piattaforma basata su lettore di piastra e il Ca2 + tingere del calcio verde-5N. In condizioni di controllo (Figura 1A), i mitocondri cardiaci erano sospese in tampone di KCl contenente calcio verde-5N e poi sfidati con impulsi sequenziali di CaCl2 (5 μL di soluzione di CaCl2 0,6 ...

Qui, presentiamo due protocolli per la misurazione dell'afflusso Ca2 + mitocondriale in mitocondri isolati e cellule coltivate. Per mitocondri isolati, dettagliamo un piatto basato su lettore Ca2 + importazione analisi usando il Ca2 + sensibili tingere del calcio verde-5N. Per le cellule coltivate, descriviamo un metodo di microscopia confocale utilizzando il Ca2 + colorante Rhod-2/AM.

Analisi di afflusso del calcio mitocondriale in mitocondri isolati e cellule coltivate

Ca2+ handling by mitochondria is a critical function regulating both physiological and pathophysiological processes in a broad spectrum of cells. The ...

L'obiettivo generale di questa procedura è misurare l'afflusso di calcio mitocondriale nei mitocondri isolati e nelle cellule in coltura. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della segnalazione del calcio, come il modo in cui i mitocondri aiutano a modellare il panorama citosolico del calcio e il ruolo della dinamica del calcio mitocondriale nelle condizioni di malattia. Il vantaggio principale di questa tecnica è che i nostri protocolli possono essere adattati a una varietà di sistemi modello per valutare la capacità di afflusso di calcio mitocondriale.Dimostrerò la procedura di assorbimento del calcio mitocondriale basata su un lettore di piastre. E il Dr. Joshua Maxwell, un istruttore del Dipartimento di Pediatria, dimostrerà la procedura basata sul microscopio confocale per misurare l'afflusso di calcio mitocondriale. Inizia questo esperimento risciacquando accuratamente il cuore precedentemente isolato in 25 millilitri di PBS ghiacciato one-X, assicurandoti che il sangue sia completamente spremuto dai ventricoli.In cinque millilitri di PBS ghiacciato, usando un paio di forbici affilate, tritare il tessuto cardiaco in piccoli pezzi. Scartare con cur

analyses-mitochondrial-calcium-influx-isolated-mitochondria-cultured

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Questo protocollo descrive un metodo per la misurazione in tempo reale dei flussi di calcio mitocondriale di imaging fluorescente. Il metodo si avvale di una circolare permutated YFP a base di sensori di calcio dual-eccitazione raziometrico (raziometrico pericam-mt) l'indicazione espressa nei mitocondri.

Monitoraggio Cambiamenti dei livelli di calcio mitocondriale durante l&#39;apoptosi mediante un sensore di calcio geneticamente codificato

Un protocollo spettrofluorimetrico per la misura della permeabilità mitocondriale apertura dei pori di transizione nel cuore topo mitocondri isolati è presentato qui. Il test prevede la misurazione simultanea dei mitocondri...

Multi-parametro di misura della apertura dei pori di transizione di permeabilità nel Cuore mouse mitocondri isolati

Questo video descrive un test basato su un lettore di piastre per misurare l'assorbimento di calcio mitocondriale in mitocondri isolati. Il test analizza il segnale di fluorescenza di un colorante fluorescente sensibile al calcio per studiare la cinetica dell'assorbimento mitocondriale del calcio e del sovraccarico di calcio.

Saggio di captazione del calcio mitocondriale: un metodo basato su lettore di piastre per misurare l'assorbimento di calcio nei mitocondri isolati

Questo video descrive un test basato sull'imaging al microscopio confocale per misurare l'assorbimento di calcio mitocondriale nelle cellule in coltura. Il test utilizza il colorante fluorescente sensibile al calcio Rhod-2/AM per misurare il calcio mitocondriale in cellule coltivate permeabilizzate.

Saggio dell'afflusso di calcio per misurare l'assorbimento mitocondriale di calcio nelle cellule in coltura

Questo video mostra la procedura per valutare la capacità di ritenzione del calcio nei mitocondri monitorando in tempo reale i cambiamenti nella fluorescenza quando i mitocondri assorbono il calcio. Questo test è utile per studiare la funzione mitocondriale e i processi correlati al calcio, tra cui l'apoptosi e le malattie neurodegenerative.

Determinazione della capacità di ritenzione del calcio dei mitocondri isolati

Questo documento descrive l'applicazione della microscopia elettronica cryoanalytical per la misurazione quantitativa del contenuto di calcio totale e la distribuzione a risoluzione subcellulare in campioni biologici fisiologicamente definiti.

Misurazione del calcio totale in neuroni da Electron Probe microanalisi a raggi X

Il confronto del potenziale di membrana mitocondriale tra i campioni fornisce informazioni preziose sullo stato cellulare. Vengono descritti i passaggi dettagliati per isolare i mitocondri e valutare la risposta agli inibitori e ai disaccoppiatori utilizzando la fluorescenza. Il metodo e l'utilità di questo protocollo sono illustrati dall'uso di una coltura cellulare e di un modello animale di stress cellulare.

Isolamento e analisi funzionale dei mitocondri da cellule in coltura e Tissue mouse

I mitocondri possono utilizzare il potenziale elettrochimico attraverso la loro membrana interna (Δ Ψm) di sequestrare il calcio (Ca 2+), permettendo loro di modellare Ca citosolico 2 + Segnalazione all'interno della cellula. Descriviamo un metodo per misurare simultaneamente i mitocondri Ca 2+ di assorbimento e ΔΨ m in cellule vive con coloranti fluorescenti e microscopia confocale.

Misurazione simultanea di mitocondriale calcio e mitocondriale potenziale di membrana in cellule vive di Microscopia fluorescente

Questo protocollo ha lo scopo di descrivere un metodo per esaminare la capacità di ritenzione di Ca2 + e Ca2 +- innescato mitocondriale gonfiore di mitocondri isolati di SH-SY5Y cellule passo-passo.

Mitocondriale di Ca2 + ritenzione capacità Assay e Ca2 +-innescato gonfiamento mitocondriale Assay

Questo proctocollo mira a fornire un metodo per l'imaging mitocondriale In vitro e in vivo Ca2+ in astrociti e neuroni.

Imaging Dell'assorbimento mitocondriale di Ca2+ in astrociti e neuroni utilizzando indicatori Ca2+ geneticamente codificati (GECI)

Scopri come misurare l'afflusso di calcio mitocondriale in mitocondri isolati e cellule coltivate utilizzando saggi con plate reader e microscopia confocale. Questi metodi aiutano a studiare la segnalazione del calcio e le dinamiche mitocondriali nelle malattie.

Analisi di afflusso del calcio mitocondriale in mitocondri isolati e cellule coltivate

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