Name: Specifiche e rilevazione accurata del Using PCR convenzionale su campioni di tessuto foglia agrumi Citrus Greening patogeno Candidatus liberibacter spp. (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Scopri il metodo PCR per rilevare con precisione il patogeno Candidatus liberibacter spp. nel tessuto fogliare di agrumi. Questa tecnica efficiente e accessibile supporta agricoltori e ricercatori nella gestione del greening degli agrumi.

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Concettualizzazione, H.C. e Z. d. F.; Indagine, C. H., J. C e Z. d. F; Risorse, Z. F. d.; Scrittura - bozza originale, i. P. r.; Scrittura – recensione & Editing, i. P. r., J. C., C. H., S. L. T. e Z. d. F.; Visualizzazione, H. C.; Supervisione, Z. F. d.; Finanziamento acquisizione, Z. d. F e F. d. L.
Progetto sostenuto da un South Carolina migliorando insegnante qualità dell'istruzione superiore stato Grant intitolato, miglioramento medio gradi scienza insegnanti processi della conoscenza della pianta, strutture e funzioni attraverso impegno in Plant Sciences Research (pianta Science)
Fondi assegnati dal Regno Stati dipartimento dell'educazione (CFDA numero 84.367B)
Gli autori vorrei ringraziare Dr. Nian Wang dell'Università della Florida per la fornitura di campioni di DNA genomico da infettati Citrus sinensis Valencia.

1. isolare il DNA genomico da tessuto vegetale utilizzando un Kit di estrazione genomico
<ol><li>Ottenere tessuto fogliare agrumi tagliando un intero fresco foglia da un albero di agrume utilizzando forbici pulite e portare l'anta in un sacchetto di plastica pulito sandwich. Nota: La borsa contenente tessuto fogliare deve essere inserita in un frigorifero a 4 ° C o il ghiaccio in un contenitore isolato appena possibile dopo la raccolta per evitare il deterioramento.</li>
	<li>Aggiungere una piccola quantità di azoto liquido per raffreddare un mortaio e un pestello. Mentre essi sono agghiaccianti, usare le forbici per tagliare un piccolo pezzo di tessuto fogliare, circa 1 pollice quadrato di dimensioni. Posizionare il tessuto tagliato nel mortaio per congelare istantaneamente. Aggiungere più azoto liquido, se necessario. Nota: Guanti isolanti devono sempre essere indossati durante la manipolazione di azoto liquido.</li>
	<li>Macinare rapidamente i tessuti vegetali in una polvere fine utilizzando il mortaio. Continuare la rettifica fino a quando l'azoto liquido evapora completamente, e rimane una polvere fine verde.</li>
	<li>Brevemente chill una spatola di metallo in azoto liquido per 10-15 s, poi scoop il tessuto di terra all'interno di mortaio in una microcentrifuga da 1,5 mL, utilizzando la spatola.</li>
	<li>Aggiungere 600 µ l di soluzione di lisi di Nuclei (Vedi Tabella materiali) utilizzando una 1000 µ l pipette e vortexare il campione per 1-3 e, quindi, Incubare in un bagno di acqua di 65 ° C per 15 min.</li>
	<li>Aggiungere 3 µ l di soluzione di RNAsi al lisato utilizzando una pipetta 10 µ l, capovolgere la provetta 2 - 5 volte per mescolare e incubare a 37 ° C in un incubatore armadietto per 15 min. Nota: Lasciar raffreddare a temperatura ambiente prima di procedere.</li>
	<li>Aggiungere 200 µ l di soluzione di precipitazione della proteina, vortice ad alta velocità per 20 s, poi Centrifugare per 3 min a 13.000 x g per formare una pallottola solida. Mentre il campione è essere centrifugato, aggiungere 600 µ l di isopropanolo a temperatura ambiente per un tubo del microcentrifuge fresco 1,5 mL.</li>
	<li>Utilizzando una pipetta di 1000 µ l, con attenzione rimuovere il supernatante dal campione centrifugato, trasferirlo al tubo del microcentrifuge fresco 1,5 mL contenenti isopropanolo. Il pellet può ora essere scartato. Nota: Evitare di contaminare il surnatante con proteina lasciando una quantità minuscola di surnatante sopra il pellet.</li>
	<li>Capovolgere la provetta fino a quando il DNA diventa visibile come una massa di filamenti filiformi, poi Centrifugare a 13.000 x g per 1 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Decantare il supernatante, aggiungere 600 µ l di etanolo al 70% per il pellet, capovolgere la provetta diverse volte per lavare il DNA e centrifugare a 13.000 x g per 1 min.</li>
	<li>Attentamente aspirare l'etanolo, lasciando il pellet sciolto di DNA, quindi aprire e capovolgere la provetta, che riposa su carta assorbente. Aria secca a temperatura ambiente per 15 min.</li>
	<li>Aggiungere 100 µ l di soluzione di reidratazione del DNA al pellet di DNA secchi, quindi incubare il DNA in un bagno di acqua di 65 ° C per 1 h, mescolando periodicamente toccando il tubo.</li>
	<li>Posizionare 1 µ l di acqua purificata su un microcuvette e inserirlo in uno spettrofotometro per essere utilizzato come uno spazio vuoto. Calcolare la concentrazione di DNA presente posizionando 1 µ l di campione sulle microcuvette e inserimento nello spettrofotometro. Concentrazione di DNA (ng / µ l) può essere calcolato come (un260-320) × diluizione fattore × 50 ng / µ l. Nota: Il protocollo può essere messo in pausa qui. Il campione può essere conservato a 4 ° C.</li>
</ol>2. eseguire la PCR su campioni di DNA genomico
<ol><li>Unire 10 µ l 2 x PCR Master Mix (Vedi tabella dei materiali), primer di 1 µ l in avanti (10 pM / µ l), 1 µ l reverse primer (10 pM / µ l) (Vedi tabella 2 per sequenze dell'iniettore), 100 ng di DNA genomic estratto dal campione e purificato acqua (fino a 20 µ l di volume finale) in un 50 µ l PCR tubo, flick per mescolare e brevemente della centrifuga.</li>
	<li>Inserire il tubo PCR il termociclatore ed eseguire di conseguenza (Vedi tabella 1). Nota: Il protocollo può essere messo in pausa qui. Se necessario, conservare il campione a 4 ° C dopo la reazione è completa.</li>
</ol>3. elettroforesi del DNA amplificato in un Gel di agarosio
<ol><li>Pesare 0,4 g di polvere di agarosio e aggiungerlo insieme con 1 tampone di x TAE a un pulito 200 mL flacone erlenmeyer, riempimento fino a 50 mL.</li>
	<li>Forno a microonde in alto per 1,5 minuti, scuotendo ogni 30 s, finchè agarosio sia completamente dissolto. Nota: Guanti isolanti devono essere indossati durante la manipolazione di liquidi dell'agarosi per evitare ustioni.</li>
	<li>Aggiungere 2,5 µ l di bromuro di etidio 10 mg/mL il liquido agarosio e agitare per mescolare, quindi versare il gel di agarosio liquido in uno stampo di gel di livello. Inserire rapidamente pettini standard 12-dente del gel dopo la colata.</li>
	<li>Lasciare che il gel a raffreddare per 20 min a temperatura ambiente, poi rimuovere gel pettini e mettere il gel in una scatola di livello gel riempito con 1 tampone di x TAE.</li>
	<li>Utilizzando una micropipetta, caricare i campioni di DNA amplificati totali nei pozzetti. Aggiungere 5 µ l di DNA ladder (Vedi Tabella materiali) in un pozzo separato dai vostri campioni.</li>
	<li>L'elettroforesi per 35 min a una costante 90 V, quindi rimuovere il gel e posto in un transilluminatore UV.</li>
	<li>Fotografare e analizzare il gel banding modello mentre con transilluminazione UV a 302 nm.</li>
</ol>

<ol><li>Field Office, F. lorida <a target="_blank" href="http://citrusindustry.net/wp-content/uploads/2016/10/cit1016.pdf">Citrus October Forecast Maturity Test Results and Fruit Size</a>. , USDA, NASS, Florida Field Office. (2016).</li>
<li>Singerman, A., Useche, P. <a target="_blank" href="https://pdfs.semanticscholar.org/2aa9/2db973c8f73893a0799ef82cb8883821127b.pdf">Impact of citrus greening on citrus operations in Florida.</a> Food and Resource Economics Department, UF/IFAS Extension. , EDIS (FE983) (2015).</li>
<li>Spreen, T. H., Hodges, A. <a target="_blank" href="https://conference.ifas.ufl.edu/citrus12/PDF%20Presentations/Fri-pdf/1045%20Spreen.pdf">The economic impact of HLB on the florida citrus industry</a>. , University of Florida. (2012).</li>
<li>UICEP. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Pathology%22">Pathology</a>. , (2013).</li>
<li>Jagoueix, S., Bove, J. M., Garnier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+phloem-limited+bacterium+of+greening+disease+of+citrus+is+a+member+of+the+alpha+subdivision+of+the+Proteobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Syst+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The phloem-limited bacterium of greening disease of citrus is a member of the alpha subdivision of the Proteobacteria.</a> Int J Syst Bacteriol. 44 (3), 379-386 (1994).</li>
<li>Fujikawa, T., Iwanami, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+and+robust+detection+of+citrus+greening+%28huanglongbing%29+bacterium+%26%2334%3BCandidatus+Liberibacter+asiaticus%26%2334%3B+by+DNA+amplification+with+new+16S+rDNA-specific+primers%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Probes%22%5BJournal%5D)">Sensitive and robust detection of citrus greening (huanglongbing) bacterium &#34;Candidatus Liberibacter asiaticus&#34; by DNA amplification with new 16S rDNA-specific primers.</a> Mol. Cell. Probes. 26 (5), 194-197 (2012).</li>
<li>Davis, M. J., Mondal, S. N., Chen, H., Rogers, M. E., Brlansky, R. H. <a target="_blank" href="https://apsjournals.apsnet.org/doi/abs/10.1094/PDIS-92-11-1547">Co-cultivation of 'Candidatus Liberibacter asiaticus' with actinobacteria from citrus with huanglongbing.</a> Plant Dis. 92 (11), 1547-1550 (2008).</li>
<li>Department of Agriculture & National Agriculture Statistics Service. <a target="_blank" href="https://www.cacitrusmutual.com/wp-content/uploads/2015/12/2015-USDA-Citrus-Fruits-Summary.pdf">Citrus Fruits 2015 Summary (September 2015)</a>. , (2015).</li>
<li>Hocquellet, A., Toorawa, P., Bové, J. M., Garnier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+identification+of+the+two+Candidatus+Liberobacter+species+associated+with+citrus+huanglongbing+by+PCR+amplification+of+ribosomal+protein+genes+of+the+%CE%B2+operon%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Probes%22%5BJournal%5D)">Detection and identification of the two Candidatus Liberobacter species associated with citrus huanglongbing by PCR amplification of ribosomal protein genes of the β operon.</a> Mol. Cell. Probes. 13 (5), 373-379 (1999).</li>
<li>Mafra, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reference+genes+for+accurate+transcript+normalization+in+citrus+genotypes+under+different+experimental+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Reference genes for accurate transcript normalization in citrus genotypes under different experimental conditions.</a> PLoS One. 7 (2), e31263(2012).</li>
<li>Li, W., Hartung, J. S., Levy, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+real-time+PCR+for+detection+and+identification+of+Candidatus+Liberibacter+species+associated+with+citrus+huanglongbing%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Meth%22%5BJournal%5D)">Quantitative real-time PCR for detection and identification of Candidatus Liberibacter species associated with citrus huanglongbing.</a> J. Microbiol. Meth. 66 (1), 104-115 (2006).</li>
</ol>

Huan Chen, Ian Arthur Palmer, Jian Chen, Ming Chang, Stephen L. Thompson, Fengquan Liu e Zheng Qing Fu non dichiarare conflitti di interesse.

È fondamentale che tutti i passaggi sono seguiti esattamente per ottenere le condizioni sperimentali ottimali. Tessuto di foglia intera è stato utilizzato durante questa dimostrazione; Tuttavia, il protocollo può essere modificato per includere teoricamente qualsiasi tipo di tessuto vegetale. In precedenza, i ricercatori hanno estratto il DNA genomico da tessuto fogliare della vena, piuttosto che del tessuto foglia intera e raggiunto simili risultati11. Se la fascia corrispondente al gene FBOX...

Citrus greening, noto anche come huanglongbing, ha causato una perdita significativa di alberi di agrumi. Un caso rappresentativo è Florida, dove la malattia è prevista per causare una riduzione del 70% nella produzione di scatole di Florida arancione da scatole di 244 milioni nella stagione 1997-1998 a caselle 70 milioni a partire dal 2016-2017 stagione1. Oltre il 90% degli alberi di agrumi in Florida sono infetti2, e si stima che l'industria dell'agrume di Florida perde circa 1 miliardo di dollari ogni anno a causa di malattie degli agrumi, in cui citrus greening gioca un ruolo importante3. Citrus greening è trasmesso principalmente per la dilagante psyllid agrume asiatico Diaphorina citri, ma può essere trasmessa anche mediante innesto di tessuto infetto. La malattia provoca l'ingiallimento delle vene, foglia giallo asimmetrico chiazzatura, defogliazione precoce, avvizzimento progressivo ramoscello, decadimento di radice e morte della pianta. D'importanza, la malattia provoca la pianta di agrumi a produrre fiori fuori stagione, che raramente producono frutta. La frutta che è prodotta da piante di agrumi infetti è immaturi, verde e amaro degustazione4.
Lo scopo di questo metodo è quello con precisione e identificare con precisione il batterio mobile Candidatus liberibacter spp., l'agente causativo di citrus greening, vivono all'interno del floema di alberi di agrumi infetti5. Il DNA genomico è estratto dal tessuto foglia intera, che contiene i batteri vivi. Questo DNA genomico estratto viene utilizzato come un modello per PCR convenzionale, dove oligonucleotidi complementari alla sequenza del rDNA 16S del batterio sono utilizzati per amplificare questa sequenza. Oligonucleotidi complementari ad un gene FBOX agrumi sono utilizzati come un controllo di amplificazione interna. Abbiamo scelto di utilizzare questo metodo, perché essa ha dimostrato di avere successo nella precedente ricerca6.
Questo metodo ha il chiaro vantaggio di essere semplice, relativamente poco costoso e in grado di essere eseguita in qualsiasi laboratorio di biochimica normalmente attrezzata. Inoltre, PCR rimane il metodo più accurato e preciso per la rilevazione di questo agente patogeno, a causa della difficoltà di coltura di questo agente patogeno7e capacità del patogeno di sopravvivere e riprodursi per anni all'interno di un host asintomatico8. Molte specialità diverse analisi di PCR sono state usate per rilevare correttamente questo agente patogeno; Tuttavia, PCR convenzionale rimane il più semplice test per la rilevazione accurata e specifica, soprattutto all'interno di host asintomatico8.

<table><tbody><tr><td>Kit di purificazione del DNA genomico Wizard</td><td>Promega</td><td>A1120</td><td>Fonte di soluzioni per la lisi dei nuclei, l'RNasi, la precipitazione delle proteine e la reidratazione del DNA</td></tr><tr><td>Azoto liquido</td><td>Prodotti per l'aria</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Mastercycler pro con pannello di controllo</td><td>Eppendorf</td><td>6321000019</td><td></td></tr><tr><td>1250 W Microonde</td><td>Panasonic</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>5424 centrifuga da tavolo</td><td>Eppendorf</td><td>05-403-93</td><td></td></tr><tr><td>Isotemp 215 bagnomaria digitale</td><td>Fisher scientific</td><td>15-462-15Q</td><td></td></tr><tr><td>Spatola in metallo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z283274</td><td></td></tr><tr><td>Mortaio e pestello</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z247464</td><td></td></tr><tr><td>LSE Vortex Mixer</td><td>Corning</td><td>6775</td><td></td></tr><tr><td>2-propanolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9516</td><td></td></tr><tr><td>Sterile 10 &mu; Punte a L</td><td>TipOne</td><td>1161-3730</td><td></td></tr><tr><td>Sterile 200 &mu; Punte a L</td><td>TipOne</td><td>1163-1730</td><td></td></tr><tr><td>Sterile 1250 &mu; Punte a L</td><td>TipOne</td><td>1161-1750</td><td></td></tr><tr><td>Kit pipettatore a volume variabile</td><td>VWR</td><td>75788-460</td><td></td></tr><tr><td>Bromuro di etidio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1510</td><td></td></tr><tr><td>Agarosio</td><td>IBI Scientific</td><td>IB70041</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17892</td><td></td></tr><tr><td>Acido acetico</td><td>Fisher Chemical</td><td>A38-212</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10708976001</td><td></td></tr><tr><td>&mu; cuvetta</td><td>Eppendorf</td><td>6138000018</td><td></td></tr><tr><td>Vassoio di colata impilabile e pettini Carolina</td><td></td><td>213655</td><td></td></tr><tr><td>PowerPac Alimentatore di base</td><td>Bio-Rad</td><td>1645050</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Sub Cell GT System</td><td>Bio-Rad</td><td>1704487EDU</td><td></td></tr><tr><td>Biospettrometro di base</td><td>Eppendorf</td><td>6135000009</td><td></td></tr><tr><td>provette PCR da 0,2 mL</td><td>Fisher scientific</td><td>AB-0620</td><td></td></tr><tr><td>Provette per microcentrifuga da 1,5 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>3439</td><td></td></tr><tr><td>2X Taq Green PCR Master Mix</td><td>Promega</td><td>M7122</td><td></td></tr><tr><td>Primer diretto</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Primer inverso</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Acqua, grado</td><td>PCR Sigma-Aldrich</td><td>3315953001</td><td></td></tr><tr><td>Gel Doc XR+</td><td>Bio-Rad</td><td>1708195</td><td></td></tr><tr><td>1 KB+ Scala DNA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10787018</td><td></td></tr></tbody></table>

specifiche e rilevazione accurata del using pcr convenzionale su campioni di tessuto foglia agrumi citrus greening patogeno candidatus liberibacter spp.

Specific and Accurate Detection of the Citrus Greening Pathogen Candidatus liberibacter spp. Using Conventional PCR on Citrus Leaf Tissue Samples

Citrus greening, noto anche come huanglongbing, è una malattia distruttiva agrumi devastando agrumeti a livello globale. Questa malattia provoca asimmetrico foglia giallo chiazzatura, vena ingiallimento, defogliazione, decadimento di radice e in ultima analisi, la morte della pianta di agrumi. Quando infetta, le piante di agrumi hanno stentata crescita e producono fiori fuori stagione. Questi fiori frutti raramente, e quelli che producono agrumi piccoli, amaro, dalla forma irregolare che non sono desiderabili. Questa malattia è sparsa per l'Asian psyllid agrumi, Diaphorina citri e margotta di tessuto infetto di agrumi. L'agente patogeno ha un periodo di incubazione lungo e variabile all'interno della pianta di agrumi — a volte anni, prima che i sintomi compaiono. Tentativi di questo agente patogeno in vitro della coltura sono stati infruttuosi, possibilmente dovuto il livello basso e irregolare concentrazione dell'agente patogeno all'interno tessuto di agrumi contaminati, o perché è difficile da replicare l'ambientale condizioni favorevoli alla crescita di l'agente patogeno. È molto difficile individuare la malattia prima che si è diffuso, a causa del suo lungo periodo di incubazione e l'incapacità dei ricercatori alla cultura l'agente patogeno. Di conseguenza, la malattia diventa solo apparente dopo aver distrutto improvvisamente resa intera di un contadino di agrumi. Presentato qui è un metodo per la rilevazione accurata e specifica dell'agente patogeno citrus greening, Candidatus liberibacter spp utilizzando un kit di estrazione del DNA genomico e PCR. Questo metodo è semplice, efficiente, conveniente e adattabile per l'analisi quantitativa. Questo metodo può essere adattato per l'uso su qualsiasi tessuto agrumi; Tuttavia, è potenzialmente limitato dalla quantità di agente patogeno presente nel tessuto. Tuttavia, questo metodo verrà consentire agli agricoltori di agrumi identificare le piante infette di agrumi all'inizio e frenare la diffusione di questa malattia distruttiva prima che possa diffondersi ulteriormente.

Un risultato positivo produce una fascia distinta corrispondente a 500 bp per Candidatus Liberibacter asiaticus Las606/Lss6, e/o una fascia distinta corrispondente a 700 bp per Laa2/Laj5, un inserto nella β ribosomal 16S operone9. La banda di controllo di amplificazione interna deve essere presente anche a 400 bp. Questa banda corrisponde all'amplificazione dell'agrume FBOX gene1...

Citrus Greening è una malattia particolarmente distruttiva che interessano colture di agrumi a livello globale. Presentato qui è un metodo semplice usando PCR ed estrazione del DNA genomico di tessuto fogliare agrumi per l'accurata e precisa identificazione dell'agente patogeno citrus greening, Candidatus liberibacter spp.

Specifiche e rilevazione accurata del Using PCR convenzionale su campioni di tessuto foglia agrumi Citrus Greening patogeno Candidatus liberibacter spp.

Citrus greening, also known as huanglongbing, is a destructive citrus disease ravaging citrus farms globally. This disease causes asymmetrical yellow leaf ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di rilevare con precisione l'agente patogeno dell'inverdimento degli agrumi Candidatus liberibacter spp. nel tessuto fogliare degli agrumi. Questo metodo consente agli agrumicoltori e ai ricercatori di identificare in modo rapido e accurato la presenza di agenti patogeni responsabili dell'inverdimento degli agrumi.A dimostrare la procedura sarà Ian Palmer, uno studente laureato del mio laboratorio. Questo metodo è efficiente, economico e adattabile per l'analisi quantitativa. Inoltre, può essere eseguito con un livello minimo di esperienza e attrezzature di laboratorio.Per prima cosa usa le forbici pulite per tagliare un'intera foglia fresca da un albero di agrumi e mettila in un sacchetto di plastica pulito. Quindi raffreddare un mortaio e un pestello, aggiungendo una piccola quantità di azoto liquido. Quindi usa le forbici per tagliare piccoli pezzi di tessuto fogliare, di circa un pollice quadrato.Mettere i pezzi di foglia nel mortaio per congelarli immediatamente. Inizia rapidamente a macinare il tessuto fogliare con il mortaio, fino a quando l'azoto liquido evapora e rimane una polvere verde fine. Quindi raffreddare una spatola

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Fonte: Gulla, S., et al. Analisi multi-locus a numero variabile Tandem-repeat del batterio patogeno dei pesci Yersinia ruckeri tramite multiplex PCR ed elettroforesi capillare. J. Vis. Esp. (2019).Questo protocollo estrae DNA genomico da Yersinia ruckeri sospendendo colonie isolate in acqua ultrapura e applicando calore per lisare le cellule. La centrifugazione separa il surnatante contenente DNA dai detriti cellulari, producendo DNA modello adatto alla genotipizzazione basata su PCR e...

Estrazione del DNA genomico da tessuto fogliare vegetale infettato da batteri patogeni

Fonte: Chen, H., et al. Rilevamento specifico e accurato del patogeno del verdeamento degli agrumi Candidatus liberibacter spp. utilizzando PCR convenzionale su campioni di tessuto fogliare di agrumi. J. Vis. Esp. (2018)Questo video mostra l'estrazione del DNA genomico totale da tessuto fogliare di agrumi infettato da un batterio patogeno. Il protocollo consente un recupero affidabile del DNA per la rilevazione a valle basata su PCR del patogeno limitato dal floema.

Estrazione del DNA totale dalle foglie per la rilevazione di infezioni batteriche

La quantificazione della crescita dei patogeni è un potente strumento per caratterizzare varie risposte immunitarie di Arabidopsis thaliana (di seguito: Arabidopsis). Il metodo qui descritto presenta un saggio di infiltrazione a siringa ottimizzato per quantificare il pv di Pseudomonas syringae. maculicola ES4326 crescita nelle foglie adulte di Arabidopsis.

Batterica Leaf Infiltrazione Assay per Fine Caratterizzazione di risposte di difesa delle piante che utilizzano il<em&gt; Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae</em&gt; Patosistema

Rilevamento rapido e preciso di agenti patogeni in loco, soprattutto terricoli fitopatogeni, è fondamentale per impedire ulteriore produzione di inoculo e proliferazione di malattie delle piante in campo. Il metodo sviluppato qui utilizzando un sistema di rilevazione portatile in tempo reale di PCR consente la diagnosi in loco in condizioni di campo.

Rilevamento in loco molecolare di fitopatogeni terricoli, utilizzando un sistema PCR in tempo reale portatile

Questa carta segnala il protocollo per l'analisi di una rapida identificazione per Bemisia tabaci basato sulla tecnologia di amplificazione isotermica mediata da loop (lampada). Il protocollo richiede un addestramento minimo laboratorio e può, pertanto, essere implementato in loco nei punti di ingresso per l'importazione di vegetali quali porti ed aeroporti.

Un'analisi di amplificazione isotermica (lampada) mediata da Loop per la rapida identificazione di Bemisia tabaci

Abbiamo sviluppato un metodo per rilevare gli zoospori di Phytophthora capsici nelle fonti d'acqua utilizzando un metodo di estrazione del DNA della carta filtro accoppiato con un'amplificazione isotermica mediata a ciclo (LAMP) che può essere analizzata sul campo o in laboratorio.

Rilevamento di Phytophthora capsici nell'acqua di irrigazione utilizzando l'amplificazione isotermica mediata a ciclo

In questo lavoro, è stato sviluppato un metodo di rilevamento rapido, sensibile e portatile per Candidatus Liberibacter asiaticus basato sull'amplificazione della polimerasi ricombinasi combinata con CRISPR-Cas12a.

Rilevamento di Candidatus liberibacter asiaticus distribuibile sul campo utilizzando l'amplificazione della polimerasi ricombinasi combinata con CRISPR-Cas12a

Abbiamo progettato, fabbricato e convalidato uno strumento che elabora rapidamente i tessuti di corteccia di agrumi ricchi di floema. Rispetto ai metodi attuali, l'estrattore di tessuti di gemme (BTE) ha aumentato la produttività dei campioni e diminuito i costi di manodopera e attrezzature necessari.

Automatizzare la lavorazione delle gemme di agrumi per il rilevamento di agenti patogeni a valle attraverso l'ingegneria degli strumenti

Questo manoscritto descrive un nuovo dispositivo di infusione diretta delle piante per lo screening dell'efficacia delle molecole contro i batteri (Candidatus Liberibacter asiaticus) o il suo insetto vettore (Diaphorina citri, Kuwayama) che, in combinazione, sono associati alla malattia degli agrumi di Huanglongbing.

Dispositivo di infusione diretta per la consegna di molecole nelle piante

In questo protocollo, viene illustrato un saggio combinato di amplificazione della polimerasi ricombinasi CRISPR/Cas12a per la rilevazione del patogeno invasivo delle piante, Fusarium oxysporum f. sp. cubense tropical race 4.

Saggio combinato di amplificazione della polimerasi ricombinata CRISPR/Cas12a per il rilevamento di Fusarium oxysporum f. sp. cubense Tropical Race 4

Qui, descriviamo una procedura semplice e rapida per rilevare il DNA da agenti patogeni delle api, come Lotmaria passim e Nosema ceranae, utilizzando una lisi cellulare pronta per l'amplificazione, l'amplificazione della polimerasi ricombinasi e i saggi CRISPR/Cas12a.

Rilevamento del DNA in loco di parassiti tripanosomatidi e nosema ceranae attraverso lisi alcalina accoppiata al sistema RPA/CRISPR/Cas12a

Scopri il metodo PCR per rilevare con precisione il patogeno Candidatus liberibacter spp. nel tessuto fogliare di agrumi. Questa tecnica efficiente e accessibile supporta agricoltori e ricercatori nella gestione del greening degli agrumi.

Specifiche e rilevazione accurata del Using PCR convenzionale su campioni di tessuto foglia agrumi Citrus Greening patogeno Candidatus liberibacter spp. (Video) | JoVE Journal

Specifiche e rilevazione accurata del Using PCR convenzionale su campioni di tessuto foglia agrumi Citrus Greening patogeno Candidatus liberibacter spp.

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