Specifiche e rilevazione accurata del Using PCR convenzionale su campioni di tessuto foglia agrumi Citrus Greening patogeno Candidatus liberibacter spp.

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di rilevare con precisione l'agente patogeno dell'inverdimento degli agrumi Candidatus liberibacter spp. nel tessuto fogliare degli agrumi. Questo metodo consente agli agrumicoltori e ai ricercatori di identificare in modo rapido e accurato la presenza di agenti patogeni responsabili dell'inverdimento degli agrumi.

A dimostrare la procedura sarà Ian Palmer, uno studente laureato del mio laboratorio. Questo metodo è efficiente, economico e adattabile per l'analisi quantitativa. Inoltre, può essere eseguito con un livello minimo di esperienza e attrezzature di laboratorio.

Per prima cosa usa le forbici pulite per tagliare un'intera foglia fresca da un albero di agrumi e mettila in un sacchetto di plastica pulito. Quindi raffreddare un mortaio e un pestello, aggiungendo una piccola quantità di azoto liquido. Quindi usa le forbici per tagliare piccoli pezzi di tessuto fogliare, di circa un pollice quadrato.

Mettere i pezzi di foglia nel mortaio per congelarli immediatamente. Inizia rapidamente a macinare il tessuto fogliare con il mortaio, fino a quando l'azoto liquido evapora e rimane una polvere verde fine. Quindi raffreddare una spatola di metallo in azoto liquido, per 10-15 secondi.

Quindi utilizzare la spatola fredda per raccogliere il tessuto macinato dal mortaio in una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml. Utilizzare una pipetta da 1000 ml per aggiungere 600 ml di soluzione di lisi dei nuclei al campione. Quindi agitare il campione per uno o tre secondi.

Incubare la provetta a 65 gradi centigradi, a bagnomaria per 15 minuti. Una volta terminato il periodo di incubazione, utilizzare una pipetta da 10 ml per aggiungere 3 ml di soluzione di RNA al liceo per rimuovere l'RNA. Quindi mescolare il contenuto del tubo capovolgendolo da due a cinque volte.

Incubare a 37 gradi Celsius per 15 minuti in un'incubatrice ad armadio. Dopo 15 minuti aggiungere 200 ml di soluzione di precipitazione proteica al campione. Agitare il tubo ad alta velocità per 20 secondi.

Quindi centrifugare il campione a 13000G per tre minuti. Durante il corso della centrifugazione, aggiungere 600 ml di isopropanolo mantenuto a temperatura ambiente, a una nuova provetta per microcentrifuga da 1,5 ml. Al termine della centrifugazione, rimuovere con cautela il surnatante dalla provetta da centrifuga alla provetta contenente isopropanolo.

Scartare il pellet. Capovolgi il tubo in modo che il DNA sia visibile come un filamento simile a un filo. Quindi centrifugare il campione a 13000G per un minuto a temperatura ambiente.

Decantare il surnatante dopo la centrifugazione. Quindi aggiungere 600 ml di etanolo al 70% al pellet. Capovolgere più volte il tubo per lavare il pellet.

Centrifugare la provetta a 13000G per un minuto. Al termine della centrifugazione, aspirare con cura il surnatante. Quindi capovolgere il tubo con il coperchio aperto su carta assorbente per farlo asciugare all'aria per 15 minuti.

Una volta essiccato, aggiungere 100 ml di soluzione reidratante del DNA al pellet. Incubare la sospensione di DNA a 65 gradi Celsius a bagnomaria per un'ora. Picchiettare periodicamente il tubo durante la miscelazione.

Aggiungere 1 ml di acqua purificata in una micro-cuvetta. Leggere l'acqua in bianco sullo spettrofotometro. Quindi aggiungere 1 ML del campione nella micro-cuvetta.

Posizionare la micro-cuvetta sullo spettrofotometro e ottenere la concentrazione di DNA. Costituire la reazione PCR aggiungendo tutti i reagenti e 100 nanogrammi di DNA genomico in una provetta PCR da 50 ML. Mescolare i reagenti muovendo delicatamente la provetta, seguita da una rapida centrifugazione.

Posizionare la provetta per PCR nel termociclatore ed eseguire il programma. Per preparare il gel di agarosio, pesare 0,4 grammi di polvere di agarosio. Quindi aggiungere la polvere di agarosio in un pallone di Erlenmeyer da 200 ml, regolando il volume a 50 ml con tampone TAE 1X.

Cuocere la miscela di agarosio al microonde alla massima potenza per circa 1,5 minuti. Agitare ogni 30 secondi fino a quando l'agarosio non si scioglie completamente. Quindi aggiungere 2,5 ml di 10 milligrammi per millilitro di bromuro di etidio all'agarosio liquido.

Quindi agitare il pallone per mescolare il bromuro di etidio e versare rapidamente il gel di agarosio liquido in uno stampo in gel raso. Inserire immediatamente un pettine in gel standard da 12 denti. Lasciare raffreddare il gel per circa 20 minuti a temperatura ambiente, quindi rimuovere il pettine in gel.

Posizionare ora il gel solidificato nell'unità di elettroforesi riempita con 1X tampone TAE. Caricare il campione di DNA amplificato totale e 5 ml di DNA in un secondo momento in pozzetti separati sul gel. Avviare l'unità di elettroforesi, a 90 volt costanti per 35 minuti.

Quindi rimuovere il gel dall'unità di elettroforesi. Quindi posizionare il gel su un transilluminatore UV. Cattura le fotografie dei modelli di bande in gel nel transilluminatore a 302 nanometri.

Per identificare il batterio di inverdimento, il DNA genomico amplificato con PCR ottenuto da campioni infetti e non infetti viene elettroforizzato. Nel gel queste bande corrispondenti a 500 paia di basi indicano la presenza di una regione specifica del DNA ribosomiale Las16S nel batterio CL asiaticas. Queste bande corrispondenti a 700 paia di basi indicano la presenza di LAA2/LAJ5 e inserti presenti nella sequenza di DNA dell'operone beta ribosomiale 16S nel batterio.

Queste bande distinte a 400 paia di basi indicano l'amplificazione del solo gene F-box degli agrumi, che si riferisce al controllo interno dell'amplificazione. Per considerare validi i nostri risultati, è richiesta la presenza di questa banda. Al contrario, la presenza di una sola banda a 400 paia di basi, ma la mancanza delle altre bande a 500 e 700 paia di basi indica un tessuto agrumato sano.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in circa quattro ore se eseguita correttamente. Questa procedura può essere adattata per consentire l'esecuzione di metodi più quantitativi, come la RTQPCR per rilevare la quantità di agente patogeno presente.