Un'analisi di citometria-basata di flusso per identificare i composti che interrompono il grippaggio del Ligand di Chemokine CXC fluorescente etichettati 12 al recettore di chemochine CXC 4
10 marzo 2018
Un flusso di analisi basate su cytometry cellulare obbligatoria è descritto che è utilizzato principalmente come uno strumento di screening per identificare i composti che inibiscono il legame di un ligando di chemochine CXC fluorescente contrassegnato 12 (CXCL12) al recettore di chemochine CXC 4 (CXCR4).
L'obiettivo generale del saggio basato su cellule è identificare le molecole che si legano a un recettore accoppiato a proteine G. Sulla base della loro capacità di competere con un ligando marcato in fluorescenza per il legame al recettore. Il saggio di legame della competizione può supportare la scoperta di farmaci con recettore accoppiato a proteine G.
Come dimostreremo con questo protocollo per il recettore delle chemochine, CXC4. Il vantaggio principale di questo metodo è che le cellule viventi vengono utilizzate per analizzare il legame ricettivo invece delle preparazioni della memoria. E che si eviti l'uso di sonde a marcatura di radioattività.
Sebbene questo metodo sia stato inizialmente messo a punto per studiare il legame con il recettore delle chemochine CXCR4, può essere sviluppato anche per altri GPCR per i quali esistono ligandi marcati in fluorescenza. Per iniziare, erogare 100 microlitri di soluzione composta in una piastra inferiore trasparente 96 ben arrotondata, secondo un layout sperimentale predefinito. Aggiungere 50 microlitri di sospensione cellulare da un serbatoio di reagenti alla piastra a 96 pozzetti utilizzando una pipetta multicanale.
Incubare la piastra per 15 minuti a temperatura ambiente al buio. Dopo l'incubazione, aggiungere 50 microlitri di CXCL12 marcato in fluorescenza da 100 nanogrammi per millilitro da un serbatoio di reagenti simile ai pozzetti della piastra a 96 pozzetti. Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente al buio.
Quindi, centrifugare la piastra a 96 pozzetti a 400 volte la gravità per cinque minuti a temperatura ambiente. Rimuovere il surnatante dalle celle pellettate capovolgendo la piastra. Asciugare la piastra su un fazzoletto.
Aggiungere 200 microlitri di tampone SA fresco da un serbatoio di reagenti ai pozzetti utilizzando una pipetta multicanale. Procedere immediatamente alla centrifugazione della piastra, per cinque minuti a 400 volte la gravità a temperatura ambiente. Rimuovere nuovamente il surnatante, capovolgendo la piastra e asciugandola su un fazzoletto.
Infine, risospendere delicatamente il pellet cellulare in 200 microlitri di paraformaldeide all'1% disciolta in PBS. Questo passaggio riparerà le celle. Per analizzare i campioni mediante citometria a flusso, avviare il dispositivo e aprire il software corrispondente.
Selezionare i parametri cellulari da visualizzare in un formato a blocchi di punti, come l'area di diffusione diretta, l'area di diffusione laterale e, in una vista a istogramma, il canale di rilevamento fluoro quattro. Scegli un campione. Ad esempio un campione di controllo negativo, per eseguire il gating di una popolazione cellulare omogenea definita in base ai parametri di dispersione diretta e di dispersione laterale.
Adattare le impostazioni per il caricamento delle cellule nel dispositivo di citometria a flusso. Selezionare tre miscele prima dell'iniezione. Selezionare l'iniezione automatica di 100 microlitri di cellule fissate e utilizzare una portata del campione di 1,5 microlitri al secondo.
Eseguire l'esempio selezionando Acquisisci dati. I parametri di dispersione diretta e laterale per questo campione, nonché il rilevamento del fluoro quattro, appariranno ora sullo schermo. Ora seleziona lo strumento di gating del software.
Sulla base della visualizzazione del dot plot a dispersione diretta e laterale a dispersione, è possibile predefinire una popolazione cellulare omogenea e vitale mediante gating. Selezionare questa opzione per analizzare 20.000 eventi per campione. Ciò significa che per ogni campione verranno analizzate 20.000 cellule che rientrano in un gate predefinito.
L'acquisizione dei dati continuerà fino al raggiungimento di questo numero di eventi. Iniziare la corsa selezionando per prima cosa, i pozzetti da analizzare. Quindi seleziona i pozzi di corsa.
Il dispositivo di citometria a flusso analizzerà ora questi campioni uno per uno, registrando l'intensità media della fluorescenza per ciascun campione. Che corrisponde al segnale fluorescente medio delle 20.000 celle che rientrano nel gate predefinito. Infine, eseguire l'analisi dei dati come descritto nel protocollo.
Dopo la pre-incubazione di cellule jurkat con alte concentrazioni di antagonisti CXCR4 AMD3100, non consolidati e specifici. L'intensità media della fluorescenza che riflette il legame di CXCL12 marcato è quasi interamente ridotta ai livelli di fondo. Ciò dimostra il legame altamente specifico di CXCL12 a CXCR4 espresso sulle cellule jurkat.
I composti che non sono in grado di competere con CXCL12 marcato per il legame al recettore CXCR4, come l'antagonista CCR5 Maraviroc, non influenzeranno l'intensità media della fluorescenza. Al contrario, i composti altamente attivi lo faranno in modo dose-dipendente. Dopo aver visto il video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire un saggio di legame ricettivo da competizione utilizzando cellule viventi e citometria a flusso.
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Panoramica
Questo articolo descrive un saggio cellulare di legame basato sulla citometria a flusso, progettato per identificare composti che inibiscono il legame di CXCL12 a CXCR4. Il metodo utilizza cellule vive per analizzare il legame recettoriale, evitando l'uso di marcatori radioattivi.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Saggi di legame cellulare
- Recettori accoppiati a proteine G
- Scoperta di farmaci
Sfondo
- CXCL12 è un chemiochimico che si lega a CXCR4, un recettore accoppiato a proteine G.
- L'identificazione di inibitori di questo legame può contribuire allo sviluppo di farmaci.
- I metodi tradizionali spesso implicano l'uso di radioattività, che questo saggio cerca di evitare.
- L'utilizzo di cellule vive fornisce una rappresentazione più accurata delle interazioni biologiche.
Scopo dello studio
- Sviluppare uno strumento di screening per identificare composti che inibiscono il legame di CXCL12 a CXCR4.
- Dimostrare i vantaggi dell'utilizzo di cellule vive nei saggi di legame.
- Sostenere gli sforzi di scoperta di farmaci mirati ai recettori accoppiati a proteine G.
Metodi Utilizzati
- Citometria a flusso per l'analisi del legame cellulare.
- Utilizzo di ligandi marcati con fluorescenza per valutare la competizione di legame.
- Saggi su cellule vive per valutare le interazioni recettoriali.
- Evitare l'uso di marcatura radioattiva nel set-up sperimentale.
Risultati principali
- Il saggio identifica con successo composti che inibiscono il legame di CXCL12.
- L'analisi su cellule vive fornisce dati più pertinenti rispetto ai metodi tradizionali.
- Il metodo è efficace per lo screening di potenziali candidati farmacologici.
- I risultati confermano la fattibilità dell'utilizzo di questo saggio nella scoperta di farmaci.
Conclusioni
- Il saggio basato sulla citometria a flusso è uno strumento prezioso per identificare inibitori di CXCR4.
- L'uso di cellule vive migliora l'accuratezza degli studi sull'interazione ligando-recettore.
- Evitare la radioattività semplifica il processo sperimentale.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questo saggio di legame competitivo basato sulla citometria a flusso consente ai team della biofarmaceutica di identificare molecole di piccole dimensioni che interrompono le interazioni tra CXCL12 e CXCR4, un bersaglio chiave nei percorsi di oncologia e malattie infiammatorie. Utilizzando cellule vive e ligandi fluorescenti, il metodo evita l'uso di radioattività fornendo al contempo dati di legame fisiologicamente rilevanti. Supporta la validazione precoce del bersaglio e l'identificazione di composti promettenti, fornendo letture quantitative e riproducibili per la priorizzazione dei composti.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche misurando gli effetti diretti del composto sul legame recettore-legante in un contesto cellulare nativo.
- Valore operativo: Fornisce un'analisi funzionale che riduce i rischi associati a CXCR4 come bersaglio, confermandone meccanicamente l'attività del composto.
- Valore predittivo: Supporta la selezione del portafoglio identificando composti con profili di inibizione dose-dipendenti indicativi dell'interazione con il bersaglio.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera dati quantitativi sull'inibizione del legame mediante l'intensità media di fluorescenza, consentendo l'analisi della relazione struttura-attività.
- Valore operativo: Adattabile al formato a piastra 96 pozzetti, aumentando la capacità di screening pur mantenendo la coerenza del saggio.
- Riutilizzabilità: Stabilisce una piattaforma standardizzata applicabile ad altri recettori accoppiati alle proteine G quando sono disponibili ligandi fluorescenti, riducendo lo sforzo di riprogettazione.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Utilizza cellule Jurkat vive per riflettere l'espressione fisiologica dei recettori e la dinamica di legame, migliorando la rilevanza traslazionale.
- Valore operativo: Genera dati compatibili con successive valutazioni precliniche confermando gli effetti specifici del composto sul bersaglio.
- Controllo del rischio: Riduce i falsi positivi distinguendo gli inibitori specifici di CXCR4 da composti non specifici (ad esempio, il Maraviroc non mostra alcun effetto).
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il saggio si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla validazione del bersaglio all'identificazione del capostazione, fornendo dati di legame che informano il passaggio da hit a lead. Complementa lo screening fenotipico aggiungendo profondità meccanicistica alla caratterizzazione del composto.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi quantificando il disturbo indotto dal composto al legame tra CXCL12 e CXCR4 in cellule vive.
- Screening: Permette la prontezza del saggio attraverso passaggi standardizzati di incubazione, lavaggio e fissazione, compatibili con letture mediante citometria a flusso.
- Analisi: Fornisce l'intensità media di fluorescenza come parametro quantitativo per confrontare potenza ed efficacia dei composti a diverse concentrazioni.
- Ricerca traslazionale: Utilizza una linea cellulare rilevante per la patologia (Jurkat) che esprime CXCR4, collegando i dati di legame a un potenziale impatto terapeutico in ambito oncologico e infiammatorio.
- Riutilizzo aziendale: Funziona come piattaforma modulare di legame trasferibile ad altri bersagli GPCR, massimizzando il ritorno sull'investimento nello sviluppo del saggio.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nell'interazione con il bersaglio dimostrando un legame specifico e spostabile di CXCL12 a CXCR4.
- Valore operativo: Garantisce la riproducibilità attraverso procedure standardizzate di manipolazione delle cellule, tempi di incubazione e protocolli di selezione tramite citometria a flusso.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di proseguimento o interruzione identificando precocemente composti privi di attività specifica per il bersaglio durante la fase di scoperta.
- Impatto sul portafoglio: Permette un avanzamento proporzionato al rischio identificando composti con chiari profili di inibizione dose-dipendenti.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nell'uso della citometria a flusso, nella compensazione e nelle strategie di gating per popolazioni cellulari vitali.
- È subordinato all'accesso a citometri a flusso in grado di rilevare segnali fluorescenti nel canale appropriato (ad esempio, FITC o equivalente).
- Necessita della standardizzazione della preparazione delle cellule, della diluizione dei composti e delle condizioni di incubazione tra diversi lotti di screening.
- L'adattamento ad altri recettori accoppiati a proteine G richiede lo sviluppo o l'acquisizione di ligandi marcati con fluorocromi specifici per il recettore bersaglio.
- I limiti pratici includono la durata del saggio (~90 minuti più il tempo di analisi) e la necessità di ottimizzare la concentrazione del ligando per garantire rapporti segnale-rumore elevati.
