Formaldeide-assistita di isolamento di elementi regolatori per l'accessibilità della cromatina di misura in cellule di mammifero
2 aprile 2018
La plasticità dell'architettura nucleare è controllata da meccanismi epigenetici dinamici tra cui non codificanti RNA, DNA metilazione, nucleosoma riposizionamento come istone composizione e modifica. Qui descriviamo un protocollo di isolamento Formaldehyde-Assisted di elementi normativi (FAIRE) che permette la determinazione dell'accessibilità della cromatina in modo riproducibile, poco costoso e semplice.
L'obiettivo generale di questo esperimento è determinare l'accessibilità della cromatina di un locus genetico attraverso il cross-linking covalente del DNA alle proteine associate, seguito dalla purificazione e quantificazione del DNA libero. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della cromatina, poiché l'accessibilità del DNA può essere determinata, indipendentemente dal tipo di cellula nelle cellule non trattate e anche nelle cellule sottoposte a rimodellamento della cromatina. Il vantaggio principale di questa tecnica è che non richiede l'uso di enzimi per scindere il DNA o di anticorpi che devono essere titolati per ogni ambiente sperimentale.
Questo protocollo ha l'ulteriore vantaggio di non richiedere alcuna attrezzatura speciale oltre a un sonicatore. A dimostrare la procedura saranno Olesja Ritter e Tabea Riedlinger, che sono studentesse di dottorato del mio laboratorio. Per iniziare il protocollo, aggiungere la formaldeide direttamente al terreno di crescita delle cellule che sono state seminate un giorno prima, per raggiungere una concentrazione finale dell'1% in volume per volume.
Incubare il terreno per 10 minuti a temperatura ambiente e centrifugare manualmente le piastre ogni due minuti. Successivamente, aggiungere glicina a una concentrazione finale di 0,125 molari per estinguere la formaldeide. Incubare la soluzione per cinque minuti a temperatura ambiente e tagliarla ogni due minuti.
Aspirare il terreno e poi aggiungere con cura PBS ghiacciato sul lato del piatto per lavare le cellule. Aspirare il terreno e ripetere accuratamente il lavaggio due volte. Dopo il terzo lavaggio, sospendete nuovamente le cellule in un millilitro di PBS ghiacciato e, se necessario, utilizzate un raschietto per staccare le cellule.
Trasferiscili in una provetta di reazione da 1,5 millilitri con ghiaccio. Centrifugare le celle per cinque minuti a 300 g e quattro gradi Celsius in una centrifuga da tavolo raffreddata. Aspirare con cura ed eliminare il surnatante.
Risospendere il pellet cellulare in un millilitro di tampone di lisi FAIRE pipettandolo accuratamente su e giù più volte. Incubare le cellule per 20 minuti con ghiaccio. Dopo l'incubazione, sonicare il DNA reticolato per condividerlo a una dimensione media di 200-300 paia di basi e raffreddare i campioni durante la sonicazione per evitare di riscaldare il campione.
La frammentazione del DNA è fondamentale per questo esperimento poiché la dimensione dei frammenti influisce sulla sensibilità della soluzione dell'intera tecnica, quindi è importante stabilire attentamente le condizioni di sonicazione in anticipo e controllare la dimensione dei frammenti di cromatina in ogni singolo esperimento. Centrifugare il campione per 15 minuti e 13.000 g a quattro gradi Celsius. Quindi, trasferire il surnatante in una nuova provetta di reazione.
Suddividere i campioni in aliquote da 100 microlitri. Utilizzare un'aliquota da 100 microlitri per invertire la reticolazione e da utilizzare come riferimento per il DNA totale. Aggiungere 10 microlitri di RNasi A e incubare il campione per un'ora a 37 gradi Celsius.
Quindi, aggiungere 10 microlitri di proteinasi K.Utilizzare un termoblocco programmabile per incubare il campione per quattro ore a 37 gradi Celsius e poi per sei ore a 65 gradi Celsius per scindere le proteine e invertire i legami incrociati. Procurarsi una nuova aliquota da 100 microlitri, aggiungere 10 microlitri di RNasi A e incubare il campione per un'ora a 37 gradi Celsius. Dopo l'incubazione, procedere in parallelo con il campione non dereticolato e il campione dereticolato della sezione precedente.
Aggiungere H2O per raggiungere un volume finale di 300 microlitri. Quindi, aggiungere 300 microlitri di alcol isoamilico fenolo cloroformio in una cappa aspirante e agitare energicamente. Centrifugare i campioni per 10 minuti a 13.000 g e quattro gradi Celsius.
Quindi, trasferire con cura 280 microlitri della fase acquosa superiore in una nuova provetta di reazione. Assicurati di non rimuovere detriti dall'interfase, che contiene anche proteine, e di scartare la fase inferiore rimanente come rifiuto di solventi organici. Ripetere il trattamento e trasferire con cura 270 microlitri della fase acquosa superiore in una nuova provetta di reazione.
Aggiungere 270 microlitri di cloroformio in una cappa aspirante e agitare energicamente. Centrifugare il campione. Dopo la centrifugazione, trasferire con cura 250 microlitri della fase acquosa superiore in una nuova provetta di reazione, facendo attenzione a non trasportare detriti dall'interfase.
Eliminare il campione rimanente come rifiuto di solventi organici. Quindi, aggiungere 25 microlitri di cloruro di sodio a cinque molari, 250 microlitri di isopropanolo e aggiungere cinque microlitri di glicogeno come vettore del DNA. Capovolgere le provette e incubarle a temperatura ambiente.
Dopo l'incubazione, centrifugare il campione per far precipitare il DNA. Successivamente, lavare il pellet di DNA con 400 microlitri di etanolo al 70% in volume e centrifugare il campione. Aspirare accuratamente il surnatante e lasciare asciugare il pellet per 10 minuti a temperatura ambiente.
Una volta che il pellet è asciutto, rimetterlo in sospensione in 100 microlitri di tampone TE. Incubare il campione di DNA libero non dereticolato per quattro ore a 65 gradi Celsius per rimuovere i legami incrociati tra DNA. Infine, quantificare la quantità di DNA utilizzando uno spettrofotometro ed eseguire una piccola aliquota per controllare la dimensione del frammento su un gel di agarosio al 2% in peso per volume.
Le cellule HeLA sono state stimolate con TNF per un'ora e analizzate da FAIRE. Il rapporto tra il DNA libero e il DNA totale è stato determinato per il promotore di ACTB, il gene che codifica per la beta-actina e il controllo positivo, una regione dell'eterocromatina sul cromosoma 12, il controllo negativo e il promotore IL8. È stato generato un gel colorato con bromuro di etidio con diversi tempi di sonicazione e indica che la dimensione ottimale della cromatina da 200 a 300 paia di basi è stata ottenuta dopo 20 minuti di sonicazione.
Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in due giorni. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come il sequenziamento profondo, al fine di determinare l'accessibilità della cromatina a livello di genoma. Non dimenticare che lavorare con formaldeide e fenolo cloroformio può essere estremamente pericoloso e l'esecuzione di questa procedura dovrebbe garantire precauzioni come lavorare in una cappa aspirante, indossare guanti e smaltire adeguatamente i rifiuti.
Panoramica
Questo articolo presenta un protocollo per determinare l'accessibilità della cromatina utilizzando il metodo Formaldehyde-Assisted Isolation of Regulatory Elements (FAIRE). La tecnica è semplice, riproducibile e non richiede attrezzature specializzate.
Componenti chiave dello studio
Area della scienza
- Neuroscienza
- Epigenetica
- Biologia della cromatina
Sfondo
- L'accessibilità della cromatina è cruciale per comprendere la regolazione genica.
- I meccanismi epigenetici dinamici influenzano l'architettura nucleare.
- Gli RNA non codificanti, la metilazione del DNA e le modificazioni degli istoni svolgono ruoli significativi.
- Il protocollo FAIRE consente l'analisi della struttura della cromatina in vari tipi di cellule.
Obiettivo dello studio
- Determinare l'accessibilità della cromatina in specifici loci genetici.
- Fornire un metodo affidabile per studiare la dinamica della cromatina.
- Facilitare ulteriori analisi genomiche dopo la valutazione dell'accessibilità della cromatina.
Metodi utilizzati
- Incrocio covalente del DNA con le proteine associate utilizzando formaldeide.
- Purificazione e quantificazione del DNA libero.
- Sonicazione per frammentare il DNA a dimensioni ottimali per l'analisi.
- Utilizzo dell'estrazione fenolo-cloroformio per purificare i campioni di DNA.
Risultati principali
- Determinazione di successo dell'accessibilità della cromatina nelle cellule HeLa.
- Condizioni ottimali di sonicazione producono frammenti di DNA di 200-300 paia di basi.
- Confronto dei rapporti tra DNA libero e DNA totale in specifici promotori genici.
- Dimostrazione dell'applicabilità del metodo a varie impostazioni sperimentali.
Conclusioni
- Il protocollo FAIRE è uno strumento prezioso per studiare l'accessibilità della cromatina.
- Può essere eseguito senza attrezzature specializzate ed è conveniente.
- Altre applicazioni includono il sequenziamento profondo per l'analisi della cromatina su larga scala del genoma.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Reliable measurement of chromatin accessibility is critical for early-stage target validation and mechanistic de-risking in gene regulation studies. The FAIRE protocol enables antibody-independent, quantitative assessment of locus-specific chromatin states, supporting predictive confidence in discovery and screening workflows. Its operational simplicity and reproducibility facilitate integration into enterprise-scale R&D pipelines for epigenetic and transcriptional research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of chromatin accessibility at specific genetic loci to clarify regulatory mechanisms.
- Supports functional target validation by distinguishing open versus compacted chromatin regions without antibody bias.
- Facilitates mechanistic de-risking by providing quantitative, reproducible chromatin state data across cell types and conditions.
Screening & Assay Development
- Prepares validated chromatin accessibility profiles for downstream qPCR or sequencing-based assays.
- Standardizes chromatin state measurement, reducing experimental variability and enhancing reproducibility.
- Enables scalable, platform-agnostic workflows for compound or genetic perturbation screening.
Translational & Preclinical Research
- Aligns chromatin accessibility data with disease-relevant gene regulation models when applied to relevant cell systems.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by enabling genome-wide or locus-specific chromatin profiling.
- Provides mechanistic insight into transcriptional regulation for risk-adjusted advancement decisions.
Pipeline & Workflow Integration
The FAIRE protocol fits within the discovery-to-preclinical continuum, enabling hypothesis-driven chromatin interrogation and supporting lead identification and validation workflows.
- Discovery Biology: Quantifies chromatin openness to test regulatory hypotheses and clarify gene control mechanisms.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative chromatin accessibility outputs suitable for assay development and compound evaluation.
- Analytics: Provides DNA yield ratios and fragment size data for robust statistical comparison of experimental conditions.
- Translational Research: Facilitates biomarker alignment and mechanistic continuity when applied to disease-relevant models.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, antibody-independent workflow adaptable across diverse cell types and experimental settings.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in gene regulation studies and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability through standardized, equipment-light protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by providing robust chromatin state data early in the pipeline.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of epigenetic and transcriptional targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in chromatin biology and quantitative PCR or sequencing analytics.
- Needs access to a sonicator and standard molecular biology instrumentation.
- Demands rigorous cross-team standardization of sonication and extraction parameters for reproducibility.
- Adaptable to various mammalian cell types and experimental conditions with protocol optimization.
- Safety precautions are essential due to hazardous reagents such as formaldehyde and phenol-chloroform.
