Name: Promotore cattura Ciao-c: Ad alta risoluzione, Genome-wide profilatura delle interazioni del promotore (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-28T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Scopri il metodo Promoter Capture Hi-C per mappare le interazioni cromosomiche a lungo raggio tra promotori ed enhancer a livello genomico. Questa tecnica avanzata consente di collegare elementi regolatori ai geni target, rivelando l'architettura tridimensionale del genoma e le sue implicazioni nelle malattie.

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Ringraziamo Valeriya Malysheva per lettura critica del manoscritto e aiuto di esperti con la figura 1. Questo lavoro è stato supportato dal Medical Research Council, UK (MR/L007150/1) e UK Biotechnology and Biological Sciences Research Council, UK (BB/J004480/1).

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Design modulare del promotore Capture Hi-C
Promotore Capture Hi-C è progettato per arricchire in particolare librerie Hi-C per le interazioni che coinvolgono i promotori. Queste interazioni comprendono solo un sottoinsieme di legatura prodotti presenti in una libreria di Hi-C.
Cattura Hi-C può essere facilmente modificato per arricchire le librerie Hi-C per qualsiasi regione genomica o regioni di interesse modificando il sistema di acquisizione. Cattura regioni possono essere continuo segmenti genomici44,45,46,48, esaltatori di che sono stati identificati in PCHi-C ('Reverse Capture Hi-C'35), o dnasi I siti ipersensibili49 . La dimensione del sistema di acquisizione può essere regolata a seconda dell'ambito sperimentale. Ad esempio, Dryden et al. destinazione 519 esca frammenti nei tre deserti di gene associati al seno cancro44. Il sistema di acquisizione da Martin et al. gli obiettivi di entrambi i segmenti genomici continui ('Regione Capture': 211 regioni genomiche in totale; 2.131 frammenti di restrizione) e selezionato promotori (3.857 promotori di geni)45.
SureSelect librerie sono disponibili in dimensioni diverse gamme: 1 kb per 499 kb (5.190 – 4.806), 500 kb a 2,9 Mb (5.190 – 4.816) e 3 Mb a 5,9 Mb (5.190 – 4.831). Come ogni acquisizione singola biotina-RNA è 120 nucleotidi lunghi, queste acquisizione sistemi di ospitare un massimo di 4.158, 24.166 e 49.166 individuali cattura sonde, rispettivamente. Ciò corrisponde a 2.079, 12.083 e 24.583 frammenti di restrizione mirata, rispettivamente (si noti che i numeri per i frammenti di restrizione sono limiti inferiori basati sul presupposto che le due sonde di acquisizione singola possono essere progettati per ogni restrizione frammento — in realtà a causa di sequenze ripetitive questo non sarà il caso per ogni restrizione frammento (Vedi anche Figura 1B, C), determinando un maggior numero di frammenti di restrizione indirizzabile per un numero costante di acquisizione disponibili sonde ).
Il protocollo qui descritto si basa sull'uso di un enzima di restrizione con un sito di riconoscimento bp 6 per scoprire interazioni a lungo raggio. Usando un enzima di restrizione con un sito di riconoscimento bp 4 per una maggiore risoluzione delle interazioni più prossimale è anche possibile40,49.
Limitazioni di PCHi-C
Un limite intrinseco di ogni cromosoma conformazione cattura saggi è che la loro risoluzione è determinata con l'enzima di restrizione utilizzato per la generazione della libreria. Interazioni che avvengono tra elementi di DNA situati sullo stesso frammento di restrizione sono invisibili per analisi di 'tipo C'. Ulteriormente, in PCHi-C, in alcuni casi più di un sito di inizio della trascrizione possa trovarsi sullo stesso frammento di restrizione contenenti promotore, e PIRs in alcuni casi porto entrambi i contrassegni istone attivo e repressiva, che lo rende difficile individuare quale regolamentazione elementi di mediano le interazioni e di prevedere l'output regolamentazione delle interazioni del promotore. Usando gli enzimi di restrizione con 4 siti di riconoscimento di bp attenua questo problema ma a scapito di molto maggiore complessità di biblioteca Hi-C (Hi-C biblioteche generate con 4 degli enzimi di restrizione del sito di riconoscimento di bp sono almeno 100 volte più complessi di Hi-C le librerie generate con 6 degli enzimi di restrizione del sito di riconoscimento di bp) e i costi associati per il sequenziamento di nuova generazione.
Un'altra limitazione è che l'attuale protocollo di PCHi-C richiede milioni di cellule come materie prime, precludendo l'analisi delle interazioni di promotore in tipi cellulari rara. Una versione modificata di PCHi-C per attivare l'interrogatorio di contatti promotore in popolazioni di cellule con 10.000 a 100.000 cellule (ad esempio cellule durante lo sviluppo embrionale precoce o di cellule staminali ematopoietiche) sarebbe pertanto una preziosa aggiunta alla cattura Hi-C della casella degli strumenti.
Infine, come tutti i metodi che si basano sulla fissazione di formaldeide, PCHi-C registra solo le interazioni che sono 'congelate' presso il punto di tempo di fissazione. Così, per studiare la cinetica e la dinamica delle interazioni di promotore, metodi come microscopia di Super-risoluzione cellule vive sono tenuti insieme a PCHi-C.
Metodi di sezionare l'organizzazione spaziale del cromosoma ad alta risoluzione
La complessità vasta delle librerie di interazione cromosomiche vieta l'identificazione affidabile di prodotti di interazione tra due frammenti di restrizione specifici con significatività statistica. Per aggirare questo problema, acquisizione di sequenza è stato utilizzato per arricchire o Hi-C33,34,40,44 o 3 C50,51 librerie per interazioni specifiche. Il principale vantaggio dell'utilizzo di librerie librerie oltre 3C Hi-C per la fase di arricchimento è che Hi-C, a differenza di C 3, include una fase di arricchimento per i prodotti genuini di legatura. Di conseguenza, la percentuale di legge valide in librerie PCHi-C è di circa 10 volte superiore a quella in Capture-C biblioteche50, che conteneva circa 5 – 8% valido legge dopo il filtraggio di HiCUP. Serifoski et al hanno confrontato direttamente cattura-C a HiCap, che come PCHi-C utilizza librerie Hi-C per l'arricchimento di cattura, in contrasto con Capture-C che utilizza librerie C 3. Coerente con i nostri risultati, hanno trovato che cattura-C biblioteche sono costituiti principalmente da frammenti ONU-dei40. Inoltre, le librerie HiCap avevano una complessità maggiore di cattura-C biblioteche40.
Una variante di cattura-C, chiamato generazione cattura-C52 (NG cattura-C) utilizza un oligo al fine di frammento di restrizione, come precedentemente stabilito in PCHi-C33,34, invece che sovrapposte sonde utilizzate nell'originale Protocollo di acquisizione-C50. Questo aumenta la percentuale di letture valide rispetto all'acquisizione-C modestamente, ma NG cattura-C impiega due turni sequenziale di arricchimento di cattura, e un numero relativamente elevato di PCR cicli (cicli di 20-24 in totale, rispetto a 11 cicli in genere per PCHi-C), che inevitabilmente si traduce in più alti numeri di sequenza duplicati e minore complessità di biblioteca. In esperimenti di prova durante l'ottimizzazione di PCHi-C, abbiamo trovato che la percentuale di unico (cioè, non duplicati) legge coppie era solo circa 15% quando abbiamo usato 19 cicli di PCR (13 cicli pre-capture + 6 cicli post-acquisizione; dati non indicati), tuttavia ottimizzazione di un minor numero di cicli di PCR, in genere produce 75 – 90% coppie di lettura uniche. Quindi, riducendo il numero di cicli di PCR sostanzialmente aumenta la quantità di dati di sequenza informativa.
Un metodo recente combina ChIP con Hi-C di concentrarsi sulle interazioni cromosomiche mediati da una proteina specifica di interesse (HiChIP53). Rispetto alla ChIA-PET54, che si basa su una logica simile, HiChIP dati contengano un numero maggiore di letture di sequenza informativo, consentendo l'interazione maggiore fiducia chiamando53. Sarà molto interessante confrontare direttamente il corrispondente HiChIP e insiemi di dati di cattura Hi-C una volta che diventano disponibili (ad esempio HiChIP usando un anticorpo contro la coesina unità Smc1a53 con Capture Hi-C per tutti i Smc1a associato restrizione frammenti) fianco a fianco. Una differenza intrinseca tra questi due approcci è che catturare Hi-C non si basa su immunoprecipitazione della cromatina e pertanto è in grado di interrogare cromosomiche interazioni indipendentemente dall'occupazione di proteina. In questo modo il confronto dell'organizzazione del genoma 3D in presenza o in assenza di specifico fattore legante, come è stato utilizzato per identificare PRC1 come regolatore chiave del mouse ESC genoma spaziale architettura7.
PCHi-C e GWAS
Studi di associazione genome-wide (GWAS) hanno rivelato che superiore al 95% della malattia-collegati varianti di sequenza si trovano in regioni non codificanti del genoma, spesso a grandi distanze di proteina-codificazione geni55. Varianti di GWAS sono spesso trovati in prossimità di dnasi I siti ipersensibili, che è un segno distintivo delle sequenze con potenziale attività regolatoria. PCHi-C e catturare Hi-C sono stati ampiamente utilizzati per collegare i promotori ai loci GWAS rischio implicati nel cancro di seno44, cancro colorettale48e malattia autoimmune35,45,46. Un PCHi-C studio su 17 cellule ematopoietiche umane differenti tipi trovano SNPs associati con la malattia autoimmune sono stati arricchiti in PIRs in cellule linfoidi, mentre varianti di sequenza associate tratti specifici delle piastrine e globuli rossi sono stati trovati principalmente in i macrofagi ed eritroblasti, rispettivamente35,56. Così, promotore specifico tessuto tipo Interattomi scoperto da PCHi-C possono aiutare a capire la funzione della malattia-collegati non codificanti varianti di sequenza e identificare nuovi geni malattia potenziale per intervento terapeutico.
Caratteristiche delle regioni promotore-interagire
Parecchie linee di prova link promotore Interattomi a controllo di espressione genica. In primo luogo, parecchi PCHi-C studi hanno dimostrato che le regioni genomiche che interagiscono con i promotori di geni espressi (altamente) sono arricchite in segni associati con attività di enhancer, come H3K27 acetilazione e p300 associazione33,34 , 37. abbiamo trovato una correlazione positiva tra livello di espressione genica e il numero di rinforzatori interagenti, suggerendo che gli effetti additivi di risultato rinforzatori in aumentata espressione genica livelli34,35. In secondo luogo, di origine naturale espressione loci quantitative trait (QTLs) sono arricchiti in PIRs connessi agli stessi geni cui espressione è influenzata dal QTLs35. In terzo luogo, integrando dati PCHi-C e viaggio57 , Cairns et al trovato che geni reporter di viaggio mapping a PIRs in mouse CES mostrano reporter più forte espressione genica di geni reporter presso siti di integrazione nelle regioni non-interagenti promotore 58, che indica che il PIRs possiedono attività trascrizionale di regolamentazione. Insieme, questi risultati suggeriscono che il promotore Interattomi scoperti da PCHi-C in vari tipi di cellule umane e del mouse includono moduli regolatori chiave per controllo di espressione genica.
Vale la pena notare che i rinforzatori rappresentano solo una piccola frazione (~ 20%) di tutte le PIRs scoperto da PCHi-C33,34. Altri PIRs potrebbe avere ruoli strutturali o topologici anziché funzioni di regolamentazione trascrizionale dirette. Tuttavia, c'è anche prova che PCHi-C può svelare elementi di DNA con funzione regolatrice che non porto classica enhancer marchi. In una linea di cellule linfoidi umane, il promotore di BRD7 è stato trovato per interagire con una regione priva di segni di enhancer che è stata indicata per possedere l'attività enhancer in reporter gene saggi33. Elementi regolatori con caratteristiche simili possono essere più abbondanti che attualmente apprezzato. Ad esempio, una schermata basata su CRISPR per DNA elementi identificati contrassegno normativi elementi regolatori (UREs) che controllano l'espressione genica, ma sono privi del rinforzatore segna59.
In altri casi, PIRs hanno dimostrato di marchi di cromatina associate di repressione trascrizionale del porto. PIRs e interagenti promotori vincolati PRC1 in mouse CES erano impegnati in una vasta rete spaziale dei geni repressi recanti che il repressivo Marco H3K27me37. In cellule linfoblastoidi umane, un elemento distante interagendo con il promotore di BCL6 represso transgene reporter gene espressione33, suggerendo che potrebbe funzionare per reprimere la trascrizione di BCL6 nel suo contesto nativo.
PIRs arricchiti per occupazione della proteina isolante della cromatina CTCF umano CES e NECs37 può rappresentare un'altra classe di PIRs. Collettivamente, questi risultati suggeriscono che il PIRs harbor una raccolta di attività di regolamentazione gene ancora ad essere funzionalmente caratterizzato.

Raccogliendo la prova suggerisce che l'organizzazione tridimensionale del genoma svolge un importante ruolo funzionale in una gamma di processi nucleari, tra cui gene attivazione1,2,3, repressione4 ,5,6,7,8, ricombinazione9,10, DNA riparazione11, DNA replica12,13, e senescenza cellulare14. Esaltatori di distanti si trovano in prossimità spaziale ai promotori che regolano15,16,17, che è essenziale per il controllo di espressione genica spazio-temporale adeguato. Delezioni Enhancer mostrano che rinforzatori distali sono essenziali per destinazione gene trascrizione18,19,20,21,22e 'costretto cromatina loop' dimostra che derivati dal tethering tra un enhancer e relativo promotore di destinazione il locus Hbb è sufficiente per guidare l'attivazione trascrizionale23. Ulteriormente, le riorganizzazioni di genoma che portano geni sotto il controllo di esaltatori di ectopici possono causare l'attivazione del gene inappropriati e malattia24,25,26. Insieme, questi esempi illustrano che interazioni promotore-enhancer sono essenziali per il controllo del gene e richiedono regolazione stretta affinché l'espressione genica appropriato. L'essere umano e genomi del mouse sono stimati ciascuno per harbor esaltatori di circa 1 milione. Per la stragrande maggioranza di questi rinforzatori, geni bersaglio sono sconosciuti, e le regole di ingaggio tra promotori ed esaltatori di sapidità sono capite male. Assegnazione di esaltatori di transcriptional ai loro geni bersaglio così rimane una grande sfida nel decifrare il controllo di espressione genica dei mammiferi.
La nostra comprensione dell'architettura tridimensionale del genoma è stato rivoluzionato con l'introduzione di 3C27 (cattura di conformazione del cromosoma) e sue varianti28,29,30,31 . Il più potente di queste tecniche, Hi-C (cattura di conformazione di throughput elevato del cromosoma) è progettato per identificare l'intero ensemble di cromosomiche interazioni all'interno di una popolazione delle cellule. Hi-C biblioteche, tipicamente generati da milioni di cellule, sono molto complessi con un prodotti di legatura indipendente11 10 stimato tra frammenti di ~ 4 kb nel genoma umano32. Come una conseguenza, affidabile e riproducibile identificazione delle interazioni tra restrizione singoli frammenti (come quelle che contengono un promotore o enhancer) da Hi-C dati non sono fattibili, a meno che le librerie Hi-C sono sottoposti a sequenziamento ultra-profondo, che non è una soluzione economicamente conveniente per i laboratori di preparazione librerie Hi-C ordinariamente. Per ovviare a questo inconveniente, abbiamo sviluppato il promotore Capture Hi-C per arricchire in modo specifico promotore-contenente i prodotti di legatura da librerie Hi-C. Ci siamo concentrati sui promotori per due motivi. In primo luogo, contatti promotore-enhancer sono stati indicati per essere cruciale per i livelli di espressione di gene corretto nei numerosi studi (vedi riferimenti sopra), e in secondo luogo, come i promotori sono in gran parte invarianti tra tipi di cellule, lo stesso sistema di cattura dell'esca può essere utilizzato per interrogare il circuito di regolamentazione nei diversi tipi cellulari e condizioni. Il nostro approccio si basa sull'ibridazione nella soluzione delle librerie Hi-C con decine di migliaia di 120mers di biotinylated RNA complementare al promotore-contenente i prodotti di legatura Hi-C e successiva acquisizione su biglie magnetiche rivestite con streptavidina. Ciò si traduce in librerie PCHi-C con molto ridotta complessità rispetto alla libreria originale Hi-C, concentrandosi solo sull'identificazione di frammenti che sono legati ai promotori alle significativamente alte frequenze.
Abbiamo usato PCHi-C in un numero di umani e tipi di cellule del mouse di contribuire ad una migliore comprensione del controllo di espressione genica da scoprire regioni interagenti promotore distale a lungo raggio con funzione regolatrice putativo, come pure non casuale contatti di promotore-promotore nello spazio tridimensionale del nucleo. Gli studi hanno mappato centinaia di migliaia di contatti promotore-enhancer in tutto albergo numerose cellule tipi33,34,35,36,37,38, 39, identificato organizzazione genoma spaziale Polycomb Repressive Complex-mediata in cellule staminali embrionali di topo7, dimostrato ricablaggio su larga scala del promotore Interattomi durante la differenziazione cellulare37, 38 , 39e collegato non codificanti malattia-collegati di sequenza varianti a gene promotori35.
PCHi-C è un metodo ideale per mappare il genoma ensemble di sequenze di DNA che interagiscono con i promotori. Approcci correlati, ad esempio catturare Hi-C di regioni genomiche continue (Vedi discussione) sono il metodo di scelta per ottenere profili di interazione ad alta risoluzione per regioni genomiche selezionate. PCHi-C e catturare Hi-C sono estremamente simili da un punto di vista sperimentale (l'unica differenza è la scelta del sistema di cattura), così che i consigli e le linee guida che forniamo sono applicabili a entrambi gli approcci. Qui, presentiamo una descrizione dettagliata di PCHi-C. Delineare la spiegazione razionale e la progettazione di un esperimento di PCHi-C, forniamo un dettagliata PCHi-C protocollo di generazione in biblioteca e illustrare come la qualità delle librerie PCHi-C può essere monitorata a varie fasi nel protocollo per produrre dati di alta qualità.

<table><tbody><tr><td>Soluzione di paraformaldeide al 16% (vol/vol)</td><td>Agar Scientific</td><td>R1026</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) 1x</td><td>Life Technologies</td><td>41965-039</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS) filtrato sterile</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>F9665</td><td></td></tr><tr><td>Puntali filtranti a bassa ritenzione&nbsp;</td><td>Starlab</td><td>S1180-3810, S1180-1810, S1180-8810 e S1182-1830</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS pH 7.4</td><td>Life Technologies</td><td>70011-036</td><td></td></tr><tr><td>Acqua di biologia molecolare</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W4502</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl pH 8.0</td><td>Life Technologies</td><td>15568-025</td><td></td></tr><tr><td>IGEPAL CA-630&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I8896</td><td></td></tr><tr><td>5 M NaCl&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>24740-011</td><td></td></tr><tr><td>Cocktail di inibitori della proteasi (senza EDTA)&nbsp;</td><td>Roche Diagnostics</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>Tampone di restrizione 2 (10x NEBuffer 2)</td><td>New England Biolabs</td><td>B7002</td><td></td></tr><tr><td>Provetta DNA LoBind, 1,5 mL&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>0030 108.051</td><td></td></tr><tr><td>Provetta DNA LoBind, 2 mL</td><td>Eppendorf</td><td>30108078</td><td></td></tr><tr><td>20% (peso/vol) SDS&nbsp; &nbsp;</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>161-0418</td><td></td></tr><tr><td>20% (vol/vol) Triton X-100&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>HindIII, 100 U/uL</td><td>New England Biolabs</td><td>R0104</td><td></td></tr><tr><td>10 mM dCTP&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>18253-013</td><td></td></tr><tr><td>10 mM dGTP</td><td>Life Technologies</td><td>18254-011</td><td></td></tr><tr><td>10 mM dTTP&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>18255-018</td><td></td></tr><tr><td>0,4 mM Biotina-14-dATP</td><td>Life Technologies</td><td>19524-016</td><td></td></tr><tr><td>DNA polimerasi I frammento grande (Klenow) 5000 unità/mL</td><td>New England Biolabs</td><td>M0210</td><td></td></tr><tr><td>10x T4 tampone di reazione DNA ligasi&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>B0202</td><td></td></tr><tr><td>100x 10mg/ml Albumina sierica bovina&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>B9001</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA ligasi, 1 U/&mu; L&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>15224-025</td><td></td></tr><tr><td>RNasi A</td><td>Roche</td><td>10109142001</td><td></td></tr><tr><td>proteinasi K, ricombinante, grado PCR</td><td>Roche</td><td>3115836001</td><td></td></tr><tr><td>20 000&volte; g 50 ml provetta da centrifuga</td><td>VWR</td><td>525-0156</td><td></td></tr><tr><td>0,5 M EDTA pH 8,0&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>Fenolo pH 8,0&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P4557</td><td></td></tr><tr><td>Fenolo: Cloroformio: Alcool isoamilico 25:24:1&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P3803</td><td></td></tr><tr><td>Acetato di sodio pH 5,2&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S7899</td><td></td></tr><tr><td>Quant-iT PicoGreen&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>P7589</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Kit di estrazione del gel</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR Kit di purificazione</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>Tampone di restrizione 2.1 (10x NEBuffer 2.1)</td><td>New England Biolabs</td><td>B7202</td><td></td></tr><tr><td>NheI, 100U/uL</td><td>New England Biolabs</td><td>R0131</td><td></td></tr><tr><td>Micro TUBE AFA Fiber Tappo a scatto pre-fessurato 6x16mm nbsp;</td><td>Covaris</td><td>520045</td><td>Per</td></tr><tr><td>sonicazione Perline SPRI (Agencourt AMPure XP)&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne Streptavidin C1 perline&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>65001</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>10 mM dATP&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>18252-015</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA polimerasi 3000 unità/mL</td><td>New England Biolabs</td><td>M0203</td><td></td></tr><tr><td>T4 PNK 10000 unità/mL</td><td>New England Biolabs</td><td>M0201</td><td></td></tr><tr><td>Klenow exo meno 5000 unità/mL&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0212</td><td></td></tr><tr><td>Tampone di reazione di legatura rapida&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>B6058</td><td></td></tr><tr><td>NEB DNA Ligasi rapida&nbsp;</td><td>Adattatore New England Biolabs</td><td>M2200</td><td></td></tr><tr><td>PE 1.0 (5'-P-GATCGGAAGAGCGGTTCAGC AGGAATGCCGAG-3')</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PE adattatore 2.0 (5'-ACACTCTTTCCCTACACGACGCT CTTCCGATCT-3')</td><td>Kit Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NEB Phusion PCR&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530</td><td></td></tr><tr><td>PE PCR primer 1.0 (5'-AATGATACGGCGACCACCGA GATCTACACTCTTTCCCTAC ACGACGCTCTTCCGATCT-3')</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PE PCR primer 2.0 (5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GATCGGTCTCGGCATTCCT GCTGAACCGCTCTTCCGATCT-3')&nbsp;</td><td>Strisce PCR Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Agilent Technologies</td><td>410022 e 401425</td><td></td></tr><tr><td>Kit completo di adattatori ILM PE per reagenti SureSelect SSEL TE&nbsp;</td><td>Agilent Technologies</td><td>931108</td><td></td></tr><tr><td>libreria personalizzata SureSelect da 3 a 5,9 Mb.</td><td>Agilent Technologies</td><td>5190-4831</td><td>mouse dal design personalizzato o sistema PCHi-C umano</td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne Streptavidin T1 beads&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>65601</td><td></td></tr><tr><td>E220&nbsp; ultrasuonatore focalizzato ad alte prestazioni</td><td>Corvaris</td><td>E220</td><td></td></tr></tbody></table>

promotore cattura ciao-c: ad alta risoluzione, genome-wide profilatura delle interazioni del promotore

Promoter Capture Hi-C: High-resolution, Genome-wide Profiling of Promoter Interactions

L'organizzazione tridimensionale del genoma è legata alla sua funzione. Ad esempio, elementi regolatori come rinforzatori trascrizionali controllano l'espressione spazio-temporale dei loro geni bersaglio attraverso il contatto fisico, spesso colmare distanze genomiche considerevole (in alcuni casi centinaia di kilobasi) e bypassando geni vicini. Il genoma umano porti un stimato rinforzatori 1 milione, la maggior parte dei quali hanno sconosciuto geni bersaglio. Assegnazione regioni regolative distale ai loro geni bersaglio è dunque fondamentale per comprendere il controllo di espressione genica. Abbiamo sviluppato promotore Capture Hi-C (PCHi-C) per abilitare il rilevamento del genoma di regioni promotore-interacting distali (PIRs), per tutti i promotori in un singolo esperimento. In PCHi-C, altamente complesso Hi-C biblioteche specificamente sono arricchiti per sequenze promotrici attraverso selezione in soluzione ibrida con migliaia di esche biotinilati RNA complementari alle estremità dei frammenti di restrizione promotore-contenenti tutti. L'obiettivo è quello di sequenze promotrici poi discesa e i loro partner di frequente interazione come esaltatori e altri potenziali elementi regolatori. Dopo la sequenziazione di alto-rendimento accoppiato-fine, viene applicato un test statistico per ogni frammento di restrizione promotore-legati per identificare PIRs significativi a livello di frammento di restrizione. Abbiamo usato PCHi-C per generare un Atlante delle interazioni a lungo raggio promotore in decine di umani e tipi di cellule del mouse. Queste mappe Interactoma promotore hanno contribuito ad una maggiore comprensione del controllo di espressione genica dei mammiferi assegnando putative regioni regolative ai loro geni bersaglio e rivelando reti di interazione spaziale preferenziale promotore-promotore. Questa informazione ha anche alta rilevanza per la comprensione di malattie genetiche umane e l'identificazione di potenziali geni-malattia, collegando malattia-collegati non codificanti varianti a o vicino a sequenze di controllo a loro geni bersaglio di sequenza.

Promotore Capture Hi-C è stato utilizzato per arricchire del mouse7,34,36,39 e umano33,35,37,38 Hi-C biblioteche per interazioni di promotore. Un simile protocollo (denominato HiCap) è stata descritta dal gruppo Sandberg40. Figura 1A Mostra il flusso di lavoro schematico per promotore Capture Hi-C. Nel protocollo descritto qui, librerie Hi-C sono generate tramite la legatura nel nucleo41, che si traduce in un numero significativamente ridotto di legatura spurie prodotti42. Per PCHi-C, mouse altamente complesso o librerie Hi-C umane sono sottoposti a nella soluzione di ibridazione e catturano utilizzando 39.021 biotinilati RNA complementare a frammenti di restrizione HindIII promotore-contenenti del mouse 22.225, o 37.608 biotinilati RNAs targeting 22.076 umano contenenti promotore HindIII frammenti di restrizione, rispettivamente. Promotore contenenti frammenti di restrizione possa essere mirati ad una o entrambe le estremità di singoli biotinilati RNAs (Figura 1B). Abbiamo trovato che la cattura di entrambi finisce copertura migliorata di singoli promotori (Figura 1; prime sequenze letture) quasi duplice, come previsto. Così, in ogni momento possibile (cioè, nelle regioni non-ripetitive), si consiglia di utilizzare biotinilati RNA complementare ad entrambe le estremità di un frammento di restrizione per essere catturato.
Per valutare la qualità biblioteca PCHi-C in una fase iniziale durante la preparazione della biblioteca, eseguiamo due controlli dopo legatura del DNA e purificazione, come descritto in precedenza31. Il primo consiste nell'utilizzare coppie di primer specifici per amplificare i prodotti di legatura come in 3 C27. Usiamo le coppie di primer (tabella 1) per amplificare i prodotti di cellula-tipo invariante legatura a lungo raggio, ad esempio tra il gene Myc e suoi esaltatori di noti si trova circa 2 Mb (Figura 2A) o tra geni del locus ( Hist1 separati da 1,5 Mb) e tra due regioni situate nelle immediate vicinanze lineare ('a corto raggio control').
Il secondo controllo di qualità è effettuato per determinare l'efficienza dell'incorporazione di biotina durante Fill-in di Klenow-mediata della restrizione sito strapiombi con biotina-dATP. Successo Klenow Fill-in e la legatura successiva smussato-fine risultati nella scomparsa del sito di restrizione originale tra le molecole di DNA di un prodotto di legatura e nel caso di HindIII nella formazione di un nuovo sito di riconoscimento NheI (Figura 2B ). Il rapporto tra il HindIII al prodotto digerito la legatura NheI è una lettura diretta dell'efficienza di incorporazione di biotina. Una libreria di Hi-C di scarsa qualità mostrerà un elevato livello di digestione HindIII, considerando che sono librerie di alta qualità vicino-completa NheI digestione dei prodotti di legatura (Figura 2B).
Dopo la preparazione di biblioteca Hi-C (vale a dire, dopo che la biotina-streptavidina tirare verso il basso della dimensione selezionata di prodotti di legatura Hi-C, adattatore legatura e pre-cattura PCR), la distribuzione l'integrità e la dimensione della libreria Hi-C è valutata da Bioanalyzer (Figura 2 C). lo stesso controllo viene effettuato alla fine della preparazione di libreria PCHi-C (vale a dire, dopo la cattura di ibridazione dei prodotti contenenti promotore di legatura e post-cattura PCR). Confronto dei profili Hi-C e C PCHi Bioanalyzer dimostra che come previsto, librerie Hi-C sono molto più concentrate rispetto le librerie corrispondenti PCHi-C, ma la distribuzione di dimensione delle librerie è molto simile, che indica che la cattura un passo in PCHi-C non introduce un bias di dimensione (Figura 2, D).
Dopo la sequenziazione accoppiato-fine, la legge di PCHi-C vengono mappata, qualità controllata e filtrata utilizzando il HiCUP della pipeline43. Alta qualità PCHi-C librerie contengono tra 70-90% 'coppie valide' (cioè, accoppiato-fine sequenza legga tra due frammenti di restrizione che non sono vicine sulla mappa genomica lineare; Figura 3A, B). Utilizzando la legatura nel nucleo protocollo41,42, la percentuale di trans legge coppie (cioè, accoppiato-fine sequenza legga tra due frammenti di restrizione che si trovano su cromosomi diversi) sono di solito basse, tra 5 e 25%, che riflette l'esistenza di territori cromosomici e che indica la qualità di buona biblioteca. Confronto diretto della percentuale di 'coppie valide' tra librerie Hi-C e i loro corrispondenti PCHi-C biblioteche35, spettacoli che in tutti i casi la percentuale di coppie valide è più alto nelle librerie PCHi-C (Figura 3B). Questo è accompagnato da una riduzione della percentuale di letture non valido 'stesso frammento interno' in PCHi-C (Figura 3). Questo è previsto, come il passo di cattura non solo arricchisce per prodotti contenenti promotore di legatura, ma anche per fini di frammento di restrizione, a causa della posizione della cattura i oligos sulla restrizione frammenti (Vedi Figura 1B).
Dopo HiCUP filtraggio, determiniamo l'efficienza di cattura. PCHi-C librerie contengono tre tipi di sequenza valida letture dopo il filtraggio di HiCUP: 1.) promotore: genoma legge (cioè, letture tra un frammento catturato promotore e un frammento di restrizione HindIII non-promotore ovunque nel genoma) 2.) promotore: promotore legge (letture tra due frammenti catturati promotore) 3.) genoma: genoma legge (prodotti di legatura di sfondo Hi-C dove nessuno dei partner di prodotto di legatura esegue il mapping a un promotore catturato). Queste vengono eliminate prima dell'analisi a valle.
Librerie di alta qualità PCHi-C hanno efficienze di cattura (somma delle categorie 1 e 2 sopra) tra 65-90% (Figura 3D). Un confronto diretto a librerie Hi-C Mostra che PCHi-C si traduce in una ~ 15 volte arricchimento per promotore-legatura prodotti contenenti (Figura 3D), in alcuni casi 17-fold. Questo è vicino al massimo ipotetico (19.6-fold) arricchimento per PCHi-C, che è dipendente la percentuale dei frammenti di restrizione di genoma coperte dal sistema di acquisizione. Maggiore arricchimento può essere ottenuta progettando sistemi di cattura mira meno restrizione frammenti44,45,46.
Analisi del promotore Interattomi dimostra cella tipo e specificità di lineage33,34,35, con cambiamenti pronunciati durante la differenziazione cellulare37,38,39 . Figure 4 e 5 mostrano esempi di dinamiche di specificità e differenziazione di lignaggio a promotori specifici. Ad esempio, ALAD è costitutivamente espressa in tutte le cellule, ma la sua espressione è upregulated in eritroblasti47. Il promotore ALAD contatti diversi frammenti distali in tutte le cellule ematopoietiche e si impegna in ulteriori interazioni specificamente negli eritroblasti (Figura 4). IL-8 non mostra nessuna interazione statisticamente significativa in cellule di B, molto poche interazioni in cellule di T, ma decine di interazioni in cellule della linea mieloide, comprese specifiche interazioni cellula-tipo in monociti, neutrofili e megacariociti ( Figura 5). Questi esempi dimostrano come PCHi-C può essere utilizzato per svelare Interattomi specifico tipo di cella e identificare regioni promotore-interagendo con potenziale normativo.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57320/57320fig1.jpg"> Figura 1 : Spiegazione razionale promotore Capture Hi-C e la cattura dell'esca design. Flusso di lavoro schematico (A) di PCHi-C. Nel nucleo la legatura Hi-C41,42 (I) è seguita dall'ibridazione nella soluzione con esche biotinilati RNA (II) targeting i frammenti di restrizione di tutto l'essere umano (qui raffigurato) o promotori di geni (III) il mouse. (B) esca design per PCHi-C. Biotinilati RNA cattura esche (linee curve rosse) sono destinate contro le estremità dei frammenti di restrizione promotore-contenenti (grigio; nota che le sequenze del promotore stessi (rosso) sono solo mirate dalle esche di cattura di RNA se essi si trovano a restrizione estremità del frammento). Prodotti di legatura costituito promotore contenenti frammenti di restrizione (grigi) e loro interagenti frammenti di restrizione (giallo e verde) sono isolati mediante ibridazione di sequenza-complementarità tra esca di RNA e DNA bersaglio e successive biotina-streptavidina pulldown, come mostrato in a. (C) confronto di PCHi-C l'efficienza di cattura per promotore contenenti frammenti di restrizione mirati da un RNA esca cattura sonda vs due sonde di RNA esca cattura (Vedi schema b). <a href="/files/ftp_upload/57320/57320fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57320/57320fig2.jpg"> Figura 2 : Controlli di qualità di pre-sequenza PCHi-C. (A) a sinistra, schema di contrapposizione spaziale tra promotore e PIR con conseguente Hi-C legatura prodotto costituito da un frammento di restrizione promotore-contenenti (grigio; sequenza del promotore in rosso) e un frammento di restrizione del PIR (giallo). Diritto, DNA elettroforesi mostrando esempi di Hi-C legatura prodotti amplificati utilizzando coppie di primer specifici (come raffigurato nello schema a sinistra). (B) a sinistra, esempi rappresentativi di restrizione HindIII, NheI e HindIII/NheI digerisce di Hi-C legatura (prodotti PCR mostrato nella A). Bene, disegno schematico del DNA sequenza dopo legatura Hi-C seguito infruttuoso (in alto) o Fill-in Klenow di dNTP successo (in basso) di giunzioni di restrizione e la legatura successiva. (C) rappresentante Hi-biblioteca bioanalyzer il profilo C (diluizione 1/5). Profilo bioanalyzer rappresentante PCHi-C biblioteca di (D) (Nessuna diluizione). <a href="/files/ftp_upload/57320/57320fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57320/57320fig3.jpg"> Figura 3 : Controlli di qualità post-sequenziamento PCHi-C. (A) confronto di sequenza valida percentuale legga le coppie dopo HiCUP43 elaborazione a PCHi-C vs corrispondenti librerie Hi-C (dati da Javierre et al., 201635). (B) risultato rappresentante HiCUP PCHi-C risultati validi legge coppie e altre categorie di sequenza che vengono eliminate prima dell'analisi a valle (dati da Javierre et al., 201635). (C) confronto della percentuale 'stesso frammento interno' legge dopo HiCUP elaborazione a PCHi-C vs corrispondenti librerie Hi-C (dati da Javierre et al., 201635). (D) confronto di sequenza percentuale legge frammenti innescati promotore che coinvolgono (efficienza di cattura) a PCHi-C vs corrispondenti librerie Hi-C (dati da Javierre et al., 201635). <a href="/files/ftp_upload/57320/57320fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57320/57320fig4.jpg"> Figura 4: ALAD profilo PCHi-C in cellule ematopoietiche umane. Interazioni di promotore di tipi delle cellule mieloidi sono mostrati come archi blu, e interazioni di promotore di tipi delle cellule linfoidi come archi viola. Interazioni dell'eritroblasto specifiche sono indicati dalle frecce rosse (dati da Javierre et al., 201635). <a href="/files/ftp_upload/57320/57320fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57320/57320fig5.jpg"> Figura 5 : IL8 Profilo di PCHi-C in cellule ematopoietiche umane. Interazioni di promotore di tipi delle cellule mieloidi sono mostrati come archi blu, e interazioni di promotore di tipi delle cellule linfoidi come archi viola. Interazioni del monocito-specifiche sono indicati dalle frecce verdi, interazioni del neutrofilo-specifiche sono indicati dalle frecce rosse e un'interazione megacariocita specifico è indicata da una freccia marrone (dati da Javierre et al., 201635). <a href="/files/ftp_upload/57320/57320fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="9">Umano</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nome</td>
			<td colspan="3">Sequenza</td>
			<td>Cromosoma</td>
			<td>Strand</td>
			<td>Inizio GRCh38/hg38</td>
			<td>Fine GRCh38/hg38</td>
			<td>Combinazioni di primer per testare 3C interazioni e incorporazione di biotina</td>
		</tr>
<tr>
<td>HS AHF64 Dekker</td>
			<td colspan="3">GCATGCATTAGCCTCTGCTGTTCTCTGAAATC</td>
			<td>11</td>
			<td>+</td>
			<td>116803960</td>
			<td>116803991</td>
			<td>utilizzare in combinazione con hs AHF66 Dekker</td>
		</tr>
<tr>
<td>HS AHF66 Dekker</td>
			<td colspan="3">CTGTCCAAGTACATTCCTGTTCACAAACCC</td>
			<td>11</td>
			<td>+</td>
			<td>116810219</td>
			<td>116810248</td>
			<td>utilizzare in combinazione con hs AHF64 Dekker</td>
		</tr>
<tr>
<td>locus MYC HS</td>
			<td colspan="3">GGAGAACCGGTAATGGCAAA</td>
			<td>8</td>
			<td>-</td>
			<td>127733814</td>
			<td>127733833</td>
			<td>utilizzare in combinazione con hs MYC + 1820 o hs MYC-538</td>
		</tr>
<tr>
<td>HS MYC + 1820</td>
			<td colspan="3">AAAATGCCCATTTCCTTCTCC</td>
			<td>8</td>
			<td>+</td>
			<td>129554527</td>
			<td>129554547</td>
			<td>utilizzare in combinazione con locus MYC hs</td>
		</tr>
<tr>
<td>HS MYC-538</td>
			<td colspan="3">TGCCTGATGGATAGTGCTTTC</td>
			<td>8</td>
			<td>-</td>
			<td>127195696</td>
			<td>127195716</td>
			<td>utilizzare in combinazione con locus MYC hs</td>
		</tr>
<tr>
<td>HS HIST1 F</td>
			<td colspan="3">AAGCAGGAAAAGGCATAGCA</td>
			<td>6</td>
			<td>+</td>
			<td>26207174</td>
			<td>26207193</td>
			<td>utilizzare in combinazione con hs HIST1 R</td>
		</tr>
<tr>
<td>HS HIST1 R</td>
			<td colspan="3">TCTTGGGTTGTGGGACTTTC</td>
			<td>6</td>
			<td>+</td>
			<td>27771575</td>
			<td>27771594</td>
			<td>utilizzare in combinazione con hs HIST1 F</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="9">Mouse</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="3">Sequenza</td>
			<td>Cromosoma</td>
			<td>Strand</td>
			<td>Inizio GRCm38/mm10</td>
			<td>Fine GRCm38/mm10</td>
			<td>Combinazioni di primer per testare 3C interazioni e incorporazione di biotina</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="3">TCATGAGTTCCCCACATCTTTG</td>
			<td>8</td>
			<td>+</td>
			<td>84841090</td>
			<td>84841111</td>
			<td>utilizzare in combinazione con mm Calr2</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="3">CTGTGGGCACCAGATGTGTAAAT</td>
			<td>8</td>
			<td>+</td>
			<td>84848519</td>
			<td>84848541</td>
			<td>utilizzare in combinazione con mm Calr1</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="3">TATCAAGGGTGCCCGTCACCTTCAGC</td>
			<td>6</td>
			<td>+</td>
			<td>125163098</td>
			<td>125163123</td>
			<td>utilizzare in combinazione con Gapdh4 Dekker</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="3">GGGCTTTTATAGCACGGTTATAAAGT</td>
			<td>6</td>
			<td>+</td>
			<td>125163774</td>
			<td>125163799</td>
			<td>utilizzare in combinazione con Gapdh3 Dekker</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="3">GGAGGAGGGAAAAGGAGTGATT</td>
			<td>6</td>
			<td>+</td>
			<td>52212829</td>
			<td>52212850</td>
			<td>utilizzare in combinazione con mm Hoxa13</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="3">CAGGCATTATTTGCTGAGAACG</td>
			<td>6</td>
			<td>-</td>
			<td>52253490</td>
			<td>52253511</td>
			<td>utilizzare in combinazione con mm Hoxa7</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="3">GGGTAATGGTGTCACTAACTGG</td>
			<td>13</td>
			<td>+</td>
			<td>23571284</td>
			<td>23571305</td>
			<td>utilizzare in combinazione con Hist1h3e o mm Hist1h4i</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="3">GGGTTTGATGAGTTGGTGAAG</td>
			<td>13</td>
			<td>+</td>
			<td>23566541</td>
			<td>23566561</td>
			<td>utilizzare in combinazione con mm Hist1h2ae</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="3">TTGGGCCAAAGCCTATATGA</td>
			<td>13</td>
			<td>+</td>
			<td>22043085</td>
			<td>22043104</td>
			<td>utilizzare in combinazione con mm Hist1h2ae</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1: Sequenze Primer per il controllo di qualità di essere umano e le librerie del mouse Hi-C.

Elementi regolatori del DNA, come rinforzatori, controllano l'espressione genica contattando fisicamente i promotori di geni bersaglio, spesso attraverso interazioni a lungo raggio cromosomiche, che coprono grandi distanze genomiche. Promotore Capture Hi-C (PCHi-C) identifica interazioni significative tra promotori e regioni distali, che consente l'assegnazione di potenziali sequenze regolatrici a loro geni bersaglio.

Promotore cattura Ciao-c: Ad alta risoluzione, Genome-wide profilatura delle interazioni del promotore

The three-dimensional organization of the genome is linked to its function. For example, regulatory elements such as transcriptional enhancers control the ...

Poiché gli elementi regolatori come gli enhancer trascrizionali possono essere localizzati a grandi distanze genomiche dai loro geni bersaglio che regolano attraverso interazioni cromosomiche a lungo raggio, l'obiettivo di Promoter Capture Hi-C è quello di collegare gli elementi regolatori genici ai loro geni bersaglio. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della struttura e della funzione del genoma, come ad esempio il modo in cui l'architettura tridimensionale di un genoma influisce sul controllo dell'espressione genica. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente la rilevazione di interazioni significative con i promotori, un'unica restrizione dalla soluzione.Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia perché può collegare varianti di sequenza associativa di malattia non codificanti all'interno o vicino alle sequenze di controllo regolatorio ai loro geni bersaglio. Inizia con un minimo di 20 milioni di celle per esperimento. Per le celle in sospensione, raccogliere e centrifugare le celle a 400 volte g e 20 gradi Celsius per tre minuti.Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet della cella in 30,625 millilitri di terreno con il 10% di FBS a temperatura ambiente. Quindi aggiungere 4.375 millilitri di paraformaldeide priva di metanolo al 16% a una concentrazione finale del 2%Fissare le cellule per 10 minuti a temperatura ambiente mescolando delicatamente su un bilanciere. Estingue la reazione aggiungendo 5 millilitri di glicina ghiacciata a un molare appena preparato.Mescolare per cinque minuti con un leggero dondolio a temperatura ambiente. Quindi incubare su ghiaccio per 15 minuti con occasionali capovolgimenti. Quindi, centrifugare le celle di sospensione a 760 volte g e quattro gradi Celsius per cinque minuti.Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 50 millilitri di PBS pH 7,4 ghiacciato. Infine, centrifugare le cellule a 400 volte g e quattro gradi centigradi per 10 minuti e rimuovere con cura il surnatante. Dopo la lisi cellulare, come descritto nel protocollo di testo, lavare i nuclei cellulari con un tampone di restrizione 1,25x 2.Per fare ciò, risospendere il pellet in un millilitro di tampone ghiacciato e trasferire i nuclei risospesi in un tubo da 1,5 millilitri. Centrifugare i nuclei a 760 volte g e quattro gradi Celsius per cinque minuti prima di rimuovere il surnatante. Risospendere il pellet in 1790 microlitri di tampone di restrizione 1,25x 2.Quindi dividere la sospensione in cinque aliquote contenenti ciascuna da cinque a 10 milioni di nuclei cellulari in 358 microlitri. Aggiungere 11 microlitri di SDS al 10% in peso per volume per aliquota e agitare a 950 giri al minuto per 30 minuti a 37 gradi Celsius in un termomixer. Se compaiono grumi di cellule, dissociarli mediante pipettaggio evitando di formare bolle.Quindi aggiungere 75 microlitri di Triton X-100 al 10% per aliquota e agitare a 950 giri/min e 37 gradi Celsius per 15 minuti in un termomixer. Aggiungere 12 microlitri di 100 unità per microlitro di HindIII per aliquota. Incubare a 37 gradi Celsius durante la notte agitando a 950 giri/min in un termomiscelatore.Dopo la digestione, eseguire la PCR quantitativa come descritto nel protocollo di testo. Quindi aggiungere 60 microlitri di master mix di biotinilazione per aliquota e mescolare. Incubare le aliquote a 37 gradi Celsius per un'ora, agitando a 700 giri/min per cinque secondi ogni 30 secondi.Dopo un'ora mettete le aliquote sul ghiaccio. Eseguire la libreria Hi-C come descritto nel protocollo di testo. Trasferire tra 500 nanogrammi e un microgrammo della libreria Hi-C in una nuova provetta, quindi far evaporare il campione su un concentratore sottovuoto fino a quando non si asciuga.Risospendere la libreria Hi-C evaporata aggiungendo 3,6 microlitri di acqua di biologia molecolare, 2,5 microlitri di bloccante 1, 2,5 microlitri di bloccante 2 e 0,6 microlitri di bloccante personalizzato. Trasferire il campione in un pozzetto di una nuova striscia di provette per PCR, chiuderlo con la striscia di tappo per PCR e posizionare il campione sul ghiaccio. Etichettare il pozzetto come D per Hi-C DNA.Preparare il buffer di ibridazione come descritto nel protocollo di testo. Incubare il tampone a 65 gradi Celsius per cinque minuti in un termomixer. Trasferire il tampone in un pozzetto di una nuova striscia di provette per PCR, chiuderlo con la striscia di tappo per PCR e mantenerlo a temperatura ambiente.Etichettare il pozzetto come H per tampone di ibridazione. In un pozzetto di una nuova striscia di provette per PCR, mescolare cinque microlitri di sonde di RNA biotinilato da 100 nanogrammi per microlitro, 0,5 microlitri di inibitore della RNasi SRNasi B e 1,5 microlitri di acqua di biologia molecolare. Chiudere la striscia della provetta per PCR con una striscia di tappo per PCR e posizionarla sul ghiaccio.Etichettare il tubo come R per RNA. Configurare la macchina PCR come descritto nel protocollo di testo. Procedere il più rapidamente possibile durante tutte le procedure mentre la macchina PCR è in funzione per evitare l'evaporazione del campione.Posizionare la striscia di provette D PCR nella macchina PCR, chiudere il coperchio della macchina PCR e avviare la reazione PCR. Quando il programma PCR raggiunge i 65 gradi Celsius, aprire il coperchio della macchina PCR e posizionare la striscia di provette H PCR nella macchina PCR. Chiudere il coperchio della macchina per PCR e incubare per tre minuti.Quindi, aprire il coperchio della macchina PCR, posizionare la striscia di provette R PCR nella macchina PCR e chiudere la macchina PCR. Dopo due minuti, aprire il coperchio della macchina PCR e tutte le strisce di provette PCR. Trasferire 13 microlitri del pozzetto H nel pozzetto R e poi tutto il volume del pozzetto D nel pozzetto R.Pipet su e giù tre volte per mescolare la reazione e chiudere la striscia della provetta PCR.Rimuovere le strisce delle provette per PCR H e D e chiudere il coperchio della macchina per PCR. Incubare la reazione a 65 gradi Celsius per 24 ore. Aggiungere 60 microlitri di perle magnetiche accoppiate con streptavidina in un nuovo tubo.Posizionare il tubo sul supporto di separazione magnetica per un minuto prima di rimuovere il surnatante. Risospendere le perle con 200 microlitri di tampone legante 1x e ruotarle per tre minuti a temperatura ambiente e 15 giri/min su una ruota rotante. Far girare delicatamente la provetta in una centrifuga da banco per due o tre secondi per raccogliere il campione.Dopo aver posizionato il tubo sul supporto di separazione magnetica per tre minuti, rimuovere il surnatante. Ripetere questo lavaggio due volte. Quindi risospendere le perle in 200 microlitri di tampone legante 1x.Aprire la macchina PCR e la striscia di provette PCR mentre il programma PCR è ancora in esecuzione e trasferire la reazione di ibridazione nella provetta con le microsfere magnetiche. Incubare la reazione e le perle a temperatura ambiente per 30 minuti su una ruota rotante a tre giri/min. Recuperare le perline sul supporto di separazione magnetica e rimuovere il surnatante trasparente.Dopo aver risospeso le perle in 500 microlitri di tampone di lavaggio 1, incubare il campione per 15 minuti a 20 gradi Celsius agitando a 950 giri/min in un termomiscelatore. Recupera nuovamente le perline e rimuovi il surnatante trasparente. Ora risospendere le perle in 500 microlitri di tampone di lavaggio 2 e mescolare.Incubare il campione per 10 minuti a 65 gradi Celsius agitando a 950 giri/min in un termomiscelatore. Ripetere questo lavaggio con il tampone di lavaggio 2 altre due volte. Quindi posizionare il campione sul supporto di separazione magnetica, rimuovere il surnatante trasparente e risospendere le perle in 200 microlitri di tampone di restrizione 1x 2.Dopo aver recuperato le perle e rimosso nuovamente il surnatante, risospendere le perle in 30 microlitri di tampone di restrizione 1x 2. Questa figura mostra il profilo di interazione Hi-C di cattura del promotore per il promotore IL8 in 17 tipi di cellule ematopoietiche umane. Le interazioni con i promotori dei tipi di cellule linfoidi sono mostrate come archi viola e le interruzioni del promotore dei tipi di cellule mieloidi sono mostrate come archi blu.Le interazioni specifiche dei monociti sono indicate da frecce verdi, le interazioni specifiche dei neutrofili sono indicate da frecce rosse e un'interazione specifica dei megacariociti è indicata da una freccia marrone. Durante il tentativo di questa procedura è importante ricordarsi di lavorare nel modo più preciso possibile. Non è magia nera, ma è un protocollo lungo, quindi piccoli errori si sommano per influire negativamente sulla qualità dei dati alla fine.Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come l'editing dell'epigenoma genomore CRISPR/Cas9, al fine di interrogare la funzione biologica delle regioni che interagiscono con il promotore scoperte dal promotore Capture Hi-C. Dopo aver visto questo video, speriamo che tu possa avere una buona comprensione di come implementare il promoter Capture Hi-C nel tuo laboratorio.

promoter-capture-hi-c-high-resolution-genome-wide-profiling-promoter

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Genetica

L'Hi-C metodo consente l'identificazione imparziali, genoma delle interazioni della cromatina (1). Hi-C coppie legatura di prossimità e di sequenziamento massicciamente parallelo. I dati ottenuti possono essere usati per studiare architettura genomica alle scale multiple: risultati iniziali identificate caratteristiche come territori cromosoma, la segregazione della cromatina aperti e chiusi, e la struttura della cromatina alla scala megabase.

Hi-C: un metodo per studiare l&#39;architettura tridimensionale dei genomi.

Qui, descriviamo un protocollo di ChIP-sequenziamento high throughput ottimizzato e pipeline di analisi computazionali per la determinazione dei modelli di stato della cromatina genoma da tessuti tumorali congelati e linee cellulari.

Una piattaforma integrata per la mappatura di genoma degli Stati di cromatina usando High-throughput ChIP-sequencing nei tessuti del tumore

Si tratta di un metodo per identificare nuove proteine che interagiscono con DNA loci target specifico, basandosi sull'acquisizione di sequenza-specifico della cromatina reticolato per analisi proteomica successive. Alcuna conoscenza pregressa potenziali proteine leganti, né modifiche di cella non sono necessari. Inizialmente sviluppato per il lievito, la tecnologia ora è stata adattata per cellule di mammifero.

Adattamento di ibridazione catturare delle proteine della cromatina associate per proteomica per cellule di mammifero

L'identificazione delle interazioni fisiche tra geni ed elementi regolatori è impegnativo ma è stata facilitata dai metodi di cattura conformazione del cromosoma. Questa modifica del protocollo 4C-seq mitiga bias PCR riducendo al minimo eccessiva amplificazione dei modelli di PCR e massimizza la mappability di letture incorporando un passo di digest di aggiunta degli enzimi di limitazione.

Identificazione di High-throughput di sequenze regolatorie del Gene mediante sequenziamento di nuova generazione di cromosoma circolare conformazione catturare (4C-seq)

Segnaliamo l'applicazione della cattura della conformazione quantitativa del cromosoma seguita dal sequenziamento ad alto processo in corpi embrionali generati da cellule staminali embrionali. Questa tecnica consente di identificare e quantificare i contatti tra stimolatori e regioni promotrici di un determinato gene durante la differenziazione delle cellule staminali embrionali.

Identificazione dei contatti Enhancer-Promoter nei corpi embrionali mediante Quantitative Chromosoma Conformation Capture (4C)

Questo protocollo descrive il metodo Capture Hi-C utilizzato per caratterizzare l'organizzazione 3D di regioni genomiche mirate di dimensioni megabased ad alta risoluzione, compresi i confini dei domini topologicamente associati (TAD) e le interazioni cromatiniche a lungo raggio tra elementi regolatori e altri elementi di sequenza del DNA.

Decifrare l'organizzazione della cromatina 3D ad alta risoluzione tramite Capture Hi-C

ATAC-seq è un metodo di sequenziamento del DNA che utilizza la trasposasi mutante iperattiva, Tn5, per mappare i cambiamenti nell'accessibilità della cromatina mediati da fattori di trascrizione. ATAC-seq consente la scoperta dei meccanismi molecolari alla base delle alterazioni fenotipiche nelle cellule tumorali. Questo protocollo delinea le procedure di ottimizzazione per ATAC-seq nei tipi di cellule epiteliali, comprese le cellule tumorali.

Ottimizzazione ATAC-Seq per la ricerca sull'epigenetica del cancro

L'espressione genica è regolata dalle interazioni dei promotori genici con gli elementi regolatori distali. Qui, descriviamo come basso input Capture Hi-C (liCHi-C) consenta l'identificazione di queste interazioni in tipi di cellule rare, che in precedenza non erano misurabili.

Un flusso di lavoro integrato per studiare l'architettura del genoma spazio-temporale centrata sul promotore in popolazioni cellulari scarse

Presentiamo un flusso di lavoro senza codifica per i biologi per identificare i potenziatori genici tessuto-specifici utilizzando solo strumenti basati su browser. Il nostro protocollo sfrutta i marcatori istonici pubblici H3K4me1/H3K27ac e i dati Hi-C, consentendo ai ricercatori senza competenze di programmazione di accedere, analizzare e identificare potenziali elementi regolatori associati ai loro geni di interesse.

Un flusso di lavoro basato sul web per la selezione di potenziatori specifici per geni e tessuti

Questo protocollo fornisce una pipeline computazionale semplificata per quantificare le trascrizioni dei potenziatori nascenti. Integrando l'accessibilità della cromatina, le caratteristiche della cromatina e i dati trascrizionali, consente un rilevamento accurato e un'analisi specifica del filamento dell'attività dell'enhancer in regioni intrageniche complesse, pur rimanendo accessibile ai ricercatori senza un'ampia formazione in bioinformatica.

Una pipeline computazionale per la quantificazione dell'RNA dell'enhancer intergenico/intragenico nelle cellule staminali embrionali di topo

Scopri il metodo Promoter Capture Hi-C per mappare le interazioni cromosomiche a lungo raggio tra promotori ed enhancer a livello genomico. Questa tecnica avanzata consente di collegare elementi regolatori ai geni target, rivelando l'architettura tridimensionale del genoma e le sue implicazioni nelle malattie.

Promotore cattura Ciao-c: Ad alta risoluzione, Genome-wide profilatura delle interazioni del promotore

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