Formazione di Biofilm indotta da sali biliari in patogeni enterici: tecniche di identificazione e quantificazione

L'obiettivo generale di questo protocollo di formazione e valutazione del biofilm è determinare la capacità dei patogeni batterici enterici di formare un biofilm, specialmente in condizioni che imitano il transito gastrointestinale e l'esposizione ai sali biliari. I metodi possono aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della patogenesi batterica, come la capacità dei patogeni enterici di sopravvivere alle dure condizioni di sale biliare del tratto gastrointestinale. Il vantaggio principale delle tecniche è che i risultati combinati dei tre saggi supportano una caratterizzazione approfondita della formazione di biofilm in risposta all'esposizione al sale biliare per ciascun patogeno.

Abbiamo avuto l'idea dei metodi combinati, data la necessità di quantificare completamente la formazione di biofilm indotta dal sale biliare in Shigella flexneri. In generale, le persone che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché alcuni aspetti del test possono limitare la riproducibilità. Quindi, si prega di prestare attenzione ai passaggi critici, per garantire la riproducibilità.

A dimostrare le procedure saranno i membri del mio laboratorio, Kourtney Nicherson, borsista post-dottorato, e Alejandro Llanos, borsista di ricerca clinica. Innanzitutto, etichettare due provette da 1,5 millilitri come TSB e TSB più BS. Quindi aggiungere un millilitro di TSB o TSB più BS alle rispettive provette. Quindi, inoculare le provette con 20 microlitri di coltura notturna a una diluizione da uno a 50.

Quindi aggiungere 130 microlitri di terreno di controllo non inoculato a ciascuno dei tre pozzetti in una piastra sterile, trasparente, a fondo piatto, trattata con coltura tissutale, a 96 pozzetti. Questo sarà il controllo vuoto. Aggiungere 130 microlitri di coltura inoculata in ciascuno dei tre pozzetti.

Dopo aver aggiunto il controllo e la coltura inoculata nei rispettivi pozzetti, incubare la piastra a 96 pozzetti per quattro-24 ore a 37 gradi Celsius, staticamente. Una volta terminata l'incubazione, impostare il pozzetto di controllo sul lettore di piastre. Quindi, aspirare il terreno di coltura da ciascun pozzetto.

Quindi lavare delicatamente i pozzetti una volta con 200 microlitri di PBS sterile. Dopo il lavaggio, aspirare il PBS, quindi capovolgere la piastra per farla asciugare per circa 20 minuti. È molto importante garantire una rimozione delicata del supporto e un lavaggio delicato, per garantire che la matrice EPS non venga disturbata.

Successivamente, aggiungere 150 microlitri di cristallovioletto allo 0,5% a ciascuno dei pozzetti sperimentali e di controllo. Quindi incubare la piastra per cinque minuti a temperatura ambiente. Dopo cinque minuti, lavare i pozzetti una volta con 400 microlitri di acqua distillata.

Aggiungere 200 microlitri di acqua distillata per lavare i pozzetti cinque volte. Dopo tutti e cinque i lavaggi, capovolgere la piastra e lasciarla asciugare completamente, al riparo dalla luce. Per ottenere risultati coerenti, è importante che i campioni siano accuratamente asciugati prima di procedere.

Dopo che la piastra è completamente asciutta, utilizzare 200 microlitri di etanolo al 95% per decolorare i pozzetti. Lasciare quindi la piastra sullo shaker per 30 minuti a quattro gradi Celsius, in modo da evitare l'evaporazione. Dopo 30 minuti, registrare l'OD 540 sul lettore di piastre.

Per la rilevazione semiquantitativa dell'EPS, utilizzare una pipetta multicanale per trasferire il terreno di coltura su una piastra trasparente a 96 pozzetti. Quindi utilizzare 200 microlitri di reagente di fissaggio per fissare la piastra nera per 15 minuti a temperatura ambiente. Registrare ora la lettura OD 600 impostando il pozzetto di controllo e il grezzo per la standardizzazione.

Quindi registrare la lettura del mezzo di coltura mentre la popolazione aderente si sta fissando. Una volta completato il fissaggio, rimuovere il reagente e gettarlo nei rifiuti pericolosi. Quindi utilizzare 200 microlitri di PBS sterile per lavare delicatamente i pozzetti due volte.

Dopo il lavaggio, aspirare il PBS. Successivamente, aggiungere 150 microlitri di 25 microgrammi per millilitro di ConA-FITC. Incubare la piastra a temperatura ambiente per 15 minuti.

Dopo l'incubazione, lavare delicatamente i pozzetti con 200 microlitri di PBS. Quindi aggiungere 150 microlitri di PBS a ciascun pozzetto e registrare la fluorescenza a 488 nanometri. Dopo aver preparato i reagenti freschi, riscaldare il PBS, il PBS con glucosio, il PBS con sali biliari e il PBS con glucosio e sali biliari a 27 gradi Celsius.

Quindi registrare i valori OD 600 dalla piastra di biofilm notturna sul lettore di piastre impostando il pozzetto di controllo su bianco. Quindi, aspirare il terreno di coltura utilizzando una linea a vuoto, senza disturbare la popolazione aderente sulla superficie plastica. Lavare delicatamente i pozzetti due volte con 200 microlitri di PBS sterile.

Dopo il lavaggio con PBS, aggiungere 130 microlitri di PBS preriscaldato, PBS con glucosio, PBS con sali biliari e PBS con sali biliari e glucosio a ciascuno dei tre pozzetti, quindi incubare la piastra a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Dopo 30 minuti, rimuovere la piastra dall'incubatrice. Pipettare il surnatante in una piastra fresca sterile a 96 pozzetti.

Infine, preparare da una a 10 diluizioni seriali del surnatante con PBS nella piastra a 96 pozzetti o in un blocco di diluizione. Quindi utilizzare una pipetta multicanale per trasferire cinque microlitri di ciascuna diluizione su piastre di agar LB. Incubare le piastre a 37 gradi Celsius durante la notte.

Il giorno successivo, conta il numero di colonie. Il diagramma a barre è ottenuto per quantificare la formazione di biofilm dipendente dal sale biliare nei patogeni enterici. Questo viene fatto tracciando i valori di OD 540 dei singoli ceppi in presenza e assenza di sali biliari nel mezzo.

Il grafico mostra un aumento significativo della formazione di biofilm per la maggior parte dei ceppi patogeni, ad eccezione dell'E.Coli enteroaggrativo. Successivamente, l'EPS prodotto durante la formazione del biofilm viene rilevato determinando la quantità di ConA-FITC trattenuta dall'EPS. Il grafico a barre mostra un aumento significativo della lettura della fluorescenza in presenza di sali biliari.

Ciò conferma la produzione di EPS per l'agente patogeno Shigella flexneri. Qui, la colorazione dipendente da ConA-FITC della matrice EPS è significativamente elevata quando esposta ai sali biliari. Questo indica la formazione di biofilm batterico, caratterizzato dalla matrice EPS ricca di polisaccaridi.

One X PBS e DAPI sono utilizzati per mostrare rispettivamente la specificità FITC-dipendente e la presenza del DNA batterico. Infine, viene contato il numero di unità formanti colonie per analizzare la dispersione dipendente dal sale biliare dei batteri dal biofilm. Il grafico mostra che i batteri si disperdono facilmente dai biofilm in PBS e PBS con il glucosio.

Tuttavia, l'esposizione dei batteri ai sali biliari inibisce drasticamente la loro dispersione dai biofilm. Questi saggi sono stati sviluppati per catturare e quantificare i biofilm virulenti transitori formati da patogeni enterici, in particolare Shigella flexneri, in risposta all'esposizione al sale biliare nell'intestino tenue prima dell'infezione nel colon. Potrebbe essere necessario modificare i test, come i tipi di terreni di base, la composizione dei sali biliari utilizzati e le condizioni di crescita batterica, per tenere conto di diversi agenti patogeni, a seconda del sito di infezione all'interno del tratto gastrointestinale.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire ciascuno dei saggi per valutare a fondo la formazione di biofilm nel tuo ceppo batterico o mutante di interesse. Ricorda che lavorare con gli agenti patogeni e alcune delle soluzioni può essere estremamente pericoloso. Quando si eseguono questi saggi, è necessario tenere sempre in considerazione precauzioni come metodi di manipolazione e smaltimento appropriati.

Inoltre, la preparazione di terreni di sali biliari freschi, controlli adeguati e la garanzia della riproducibilità sperimentale sono fondamentali per l'analisi dei dati e la conferma del fenotipo del biofilm indotto dai sali biliari. Le tecniche, che sono applicazioni uniche e creative ad alto rendimento dei metodi tradizionali, consentiranno un'adeguata quantificazione del processo multiforme e dinamico di formazione di biofilm indotta da sali biliari nei patogeni enterici.