Il protocollo MPLEx Multi-omic nell'analisi di campioni di terreno

Questo metodo viene utilizzato nei campi della proteomica, della metabolomica e della lipidomica aiutando a ottenere informazioni complete sui cambiamenti molecolari che avvengono nelle comunità microbiche associate al suolo a causa di perturbazioni ambientali. Il vantaggio principale di questa tecnica è che l'ottenimento di più analiti da un singolo campione di terreno aumenta la precisione e l'accuratezza, riducendo al contempo i tempi e lo sforzo di preparazione del campione. Per iniziare, per ogni campione di terreno da 20 grammi, pesare 10 grammi in due provette separate da 50 millilitri compatibili con metanolo/cloroformio.

Utilizzare provette di plastica in PTFE, poiché il cloroformio rilascia la maggior parte della plastica, contaminando i campioni. Aggiungere circa 10 millilitri di acciaio inossidabile lavato con cloroformio e perline di granato a ciascun tubo. Quindi, mentre sono sul ghiaccio, aggiungere quattro millilitri di acqua ultrapura fredda a ciascuna provetta e trasferire i campioni in un secchiello per il ghiaccio in una cappa aspirante.

Utilizzando una pipetta sierologica di vetro da 25 millilitri, aggiungere rapidamente 20 millilitri di cloroformio ghiacciato due a uno al volume/volume di metanolo alle provette. Stringere i coperchi e agitare la miscela di terreno in soluzione. Il cloroformio-metanolo aiuta a rompere la parete cellulare dei procarioti e inattiva anche le attività enzimatiche.

Quindi, collegare i tubi agli attacchi a vortice del tubo da 50 millilitri e agitare orizzontalmente per 10 minuti a quattro gradi Celsius all'interno di un frigorifero, se possibile. Quindi, posizionare i campioni all'interno di un congelatore a 80 gradi Celsius negativi per circa 15 minuti per raffreddarli completamente. Quindi, utilizzando un sonicatore a sonda all'interno di una cappa aspirante, sonicare ogni campione con una sonda da sei millimetri e 1/4 di pollice al 60% di ampiezza per 30 secondi su ghiaccio.

Dopo la sonicazione, posizionare i campioni in un congelatore a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius, poiché la sonicazione può generare molto calore. Dopo aver ripetuto le fasi di vortice orizzontale, sonicazione e congelamento, centrifugare i campioni a 4.000 volte la gravità e quattro gradi Celsius per cinque minuti. A questo punto, il campione verrà separato nello strato superiore del metabolita, nello strato interproteico e nello strato lipidico inferiore.

Posizionare i campioni sul ghiaccio. Quindi, all'interno di una cappa aspirante, utilizzare una pipetta sierologica di vetro da 10 millilitri per trasferire gli strati superiori di metaboliti dalle due provette da 50 millilitri in una grande fiala di vetro. Ora, inclina leggermente il tubo da 50 millilitri per rilasciare lo strato intermedio proteico in modo che fluttui liberamente sullo strato lipidico inferiore.

Quindi, utilizzando una spatola da laboratorio a testa piatta in acciaio inossidabile pulita, raccogliere con cura entrambi gli intercalari proteici e metterli insieme in un nuovo tubo da 50 millilitri. Utilizzando una pipetta sierologica di vetro da 25 millilitri, trasferire gli strati lipidici inferiori in una grande fiala di vetro. Aggiungere 20 millilitri di metanolo ghiacciato alle due provette con i detriti e all'unica provetta con l'intercalare proteico.

Agitare brevemente i tubi e centrifugare i pellet di detriti e lo strato intermedio proteico a 4.000 volte la gravità e quattro gradi Celsius per cinque minuti. Quindi, travasare il metanolo in un contenitore per rifiuti pericolosi all'interno di una cappa aspirante. Congelare le proteine e i pellet di detriti in azoto liquido e asciugarli in un liofilizzatore per circa due ore.

Aggiungere 20 millilitri di tampone di solubilizzazione delle proteine in tris buffer da 50 millimolari, pH 8,0, a ciascuno dei pellet di detriti e 10 millilitri al tubo intercalare delle proteine. Nella cappa aspirante, la sonda sonica i campioni al 20% di ampiezza per 30 secondi per portarli in soluzione. Agitare i campioni per due minuti.

Quindi, posizionare il campione di intercalare proteico in un rotatore di provette da laboratorio a 50 gradi Celsius per 30 minuti per solubilizzare la proteina. Agitare orizzontalmente i campioni di detriti per altri 10 minuti per lisare le cellule intatte rimanenti. Quindi, ruotare con i campioni di intercalare proteico per i restanti 20 minuti.

Centrifugare tutti i campioni a 4.500 volte la gravità a temperatura ambiente per 10 minuti e raccogliere il surnatante da ciascuna provetta per campione in due provette da 50 millilitri. Aggiungere 10 millilitri di tampone di solubilizzazione al pellet interstrato proteico. Quindi, sonicare e far vorticare il pellet di nuovo in soluzione.

Dopo la centrifugazione, combinare equamente i surnatanti nelle due provette da 50 millilitri con i surnatanti dei pellet di detriti e centrifugare le provette in un rotore a secchio ad angolo fisso a 8.000 volte la gravità e quattro gradi Celsius per 10 minuti per pellettare eventuali detriti rimanenti. Dividere i surnatanti in due provette da 50 millilitri. Quindi, utilizzando una pipetta sierologica di vetro da 10 millilitri, aggiungere 7,5 millilitri di TCA a ciascuna provetta.

Agitare i campioni in soluzione. Quindi, posizionare i campioni in un congelatore a 20 gradi Celsius negativi per due ore o tutta la notte. Per pellettare la proteina precipitata, centrifugare il campione a 4.500 volte la gravità e quattro gradi Celsius per 10 minuti e decantare il surnatante nei rifiuti.

Aggiungi 10 millilitri di acetone ghiacciato al 100% a ogni pellet proteico. Agita i tubi e combinali come pellet in un unico tubo. Centrifugare e poi decantare l'acetone.

Utilizzando un volume minore di acetone, lavare il pellet due volte e trasferire la sospensione in un tubo da 1,5 o due millilitri per la centrifuga finale. Decantare il surnatante nei rifiuti e lasciare asciugare il pellet capovolto su un panno di carta in una cappa aspirante per circa 20 minuti. A seconda delle dimensioni del pellet, aggiungere da 100 a 200 microlitri di tampone di solubilizzazione delle proteine.

Sonicare e far vorticare il pellet in soluzione. Si noti che il campione può essere viscoso a causa di sostanze umiche che precipitano insieme alla proteina, che verrà rimossa con una successiva centrifugazione. Infine, agitare il campione in un incubatore o in un agitatore a 300 giri/min e 40 gradi Celsius per 30 minuti, per solubilizzare la proteina in soluzione prima di procedere alla digestione delle proteine o al congelamento rapido per una futura elaborazione.

Utilizzando il protocollo MPLEx dimostrato in questo video, 3.376 peptidi, 105 lipidi e 102 metaboliti polari sono stati estratti dal suolo della prateria nativa del Kansas e l'estrazione delle proteine del protocollo è stata confrontata con i kit di estrazione delle proteine e le estrazioni SDS utilizzando la LC-MS/MS in fase inversa. Quando si confrontano inizialmente tre repliche del kit di estrazione proteica commerciale e dei metodi SDS, solo il 12% dei peptidi si sovrapponeva tra le due tecniche, mostrando la complessità della comunità microbica e i diversi effetti di estrazione. Dopo il confronto di MPLEx con un kit di estrazione proteica commerciale ed estratti SDS, circa il 38% dei peptidi osservati utilizzando il metodo MPLEx sono stati rilevati anche durante l'utilizzo delle estrazioni SDS e/o del kit commerciale.

Considerando il numero di specie nella comunità batterica del suolo del Kansas e il suo metagenoma, la sovrapposizione delle identificazioni peptidiche è ragionevole. Come mostrato qui, l'ampia applicabilità dell'approccio MPLEx è stata precedentemente valutata utilizzando l'archaeon S. acidocaldarius, un consorzio unicianobatterico, tessuto della corteccia cerebrale di topo, urina umana e foglie di A. thaliana. In tutti i casi, il numero di proteine osservate con il metodo MPLEx era simile a quello dei controlli, indicando la sua utilità per molti tipi di campioni diversi.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come ottenere proteine, metaboliti e lipidi da un singolo campione di terreno. Durante il tentativo di questa procedura, è importante essere flessibili, poiché tutti i tipi di terreno sono diversi. Ad esempio, la dimensione dell'intercalare proteico varierà a seconda della biomassa del suolo e delle sostanze umiche presenti nel suolo.

Non dimenticare che lavorare con il cloroformio può essere estremamente pericoloso e che è necessario prendere sempre precauzioni come lavorare in una cappa aspirante durante il tentativo di questa procedura.